CN105238697B - 一株牡丹内生真菌及该菌生产丹皮酚的工艺 - Google Patents
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Abstract
一株牡丹内生真菌及该菌生产丹皮酚的工艺，一株牡丹内生真菌J1‑2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M2014661，可应用于生产丹皮酚；该菌生产丹皮酚的工艺为，先扩大培养再液体培养，所得液体培养菌进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝中添加甲醇进行研磨，得到混合液；将混合液装入磨口带塞三角瓶内，在室温下进行超声浸提30 min，浸提后静置，所得上清即为得含丹皮酚的提取液，将该提取液放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。本发明利用牡丹内生真菌为生产丹皮酚提供了一种新方法，可代替利用采挖植物药材获得丹皮酚的方法，可以有效的保护中药材从而保护自然环境。
Description
技术领域
本发明涉及一株牡丹内生真菌，具体的说是一株牡丹内生真菌J1-2及该菌生产丹皮酚的工艺。
背景技术
牡丹是我国特有的木本名贵花卉。目前在我国山东菏泽、安徽铜陵、重庆垫江、河南洛阳、等地有大规模商品化的牡丹种植基地。丹皮又称为牡丹皮，为牡丹的干燥根皮，其性微寒，味苦、辛，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效，为我国传统中药材。丹皮酚为丹皮中主要的一种有效成分之一，具有解热、镇痛、抗真菌、抗病毒、抗癌等作用。
植物内生真菌是指整个生活史或者生活史中的某一个阶段存在于植物组织内部或者组织间隙，且不会引起宿主出现明显病症或者没有对宿主造成明显伤害的一类真菌。内生真菌的研究日益成为天然化学研究者关注的热点之一，内生真菌次生代谢产物种类繁多，包括生物碱类、醌类、酚、甾体类、萜类、肽类等，其药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核等。
目前国内外越来越多的实验表明：植物与内生真菌在相互作用的过程中，有内生真菌能产生与植物相同或相似的活性物质，从药用植物中分离到产生活性物质的内生真菌已成为当今学者的研究趋势。
发明内容
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，一株牡丹内生真菌，分类命名为毛壳菌属（Chaetomium sp）J1-2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M2014661，可应用于生产丹皮酚。
利用所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，包括以下步骤：
步骤一、将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的牡丹内生真菌接种到装有固体扩大培养基的培养皿中，倒置在25 ℃恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟，得到扩大培养后牡丹内生真菌，备用；
所述固体扩大培养基的制备方法为：每升固体扩大培养基取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL；将配成的固体扩大培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中，备用；
步骤二、将扩大培养后牡丹内生真菌接种到装有液体培养基的三角瓶中，放入25℃气浴摇床中，以150 r/min的转速，震荡培养9-13天，得到培养后牡丹内生真菌菌液，备用；
所述液体培养基的制备方法为：每升液体培养基，取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，酵母粉10g，硫酸亚铁1g，硫酸锌0.15g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL，在121 ℃下灭菌30 min，备用；
步骤三、对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝中按照每1 g新鲜菌丝20 mL甲醇的量添加甲醇，然后进行研磨，得到混合液；将混合液装入磨口带塞三角瓶内，在室温下进行50-100Hz超声浸提30 min，浸提后静置20-30min，取上清液置于离心管中，以12000 r/min的转速离心5 min，所得上清液即为含丹皮酚的提取液；将含丹皮酚的提取液放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
所述步骤三中，也可以在新鲜菌丝按照每1 g新鲜菌丝10 mL去离子水的量添加去离子水，然后进行研磨，得到混合液；然后将混合液采用挥发油提取器进行提取，收集下层挥发油；将所得挥发油放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
有益效果是：
本发明发现了一种牡丹内生真菌J1-2，该菌能够生产牡丹皮中主要的有效成分之一—丹皮酚。本申请提供了采用该菌生产丹皮酚的生产工艺，经实验验证，采用本发明中的液体培养基将牡丹内生真菌J1-2进行培养9-13天，可得到最多的菌丝鲜重，且菌丝中含有较高量的；所制备的丹皮酚，最终的含量可以达到350 µg（丹皮酚晶体）/g（菌丝）。本发明这为利用真菌生产丹皮酚提供了一种新方法，代替了利用采挖植物药材获得丹皮酚的方法，可有效的保护中药材从而保护自然环境。
生物材料的保藏
牡丹内生真菌，分类命名为毛壳菌属（Chaetomium sp）J1-2，保藏日期为2014年12月24日，保藏单位及其简称为中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC No：M2014661，保藏地址为中国，武汉市武汉大学。
附图说明
图1为牡丹内生菌J1-2的菌落形态图；
图2为牡丹内生菌J1-2的子囊显微结构图；
图3为牡丹内生菌J1-2的基因组PCR扩增产物的电泳图；
图中标记：左边泳道表示Marker，右边泳道表示J1-2；
图4为牡丹内生菌J1-2的系统进化树；
图5为对照品—丹皮酚的GC色谱图，其中A代表丹皮酚；
图6为含丹皮酚的提取液的GC色谱图，其中A代表丹皮酚；
图7为丹皮酚对照品的线性方程。
具体实施方式
一株牡丹内生真菌，分类命名为毛壳菌属（Chaetomium sp）J1-2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO: M2014661，可应用于生产丹皮酚。
利用所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，包括以下步骤：
步骤一、将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的牡丹内生真菌接种到装有固体扩大培养基的培养皿中，倒置在25 ℃恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟，得到扩大培养后牡丹内生真菌，备用；
所述每升固体扩大培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL；将配成的固体扩大培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中，备用；
步骤二、将扩大培养后牡丹内生真菌接种到装有液体培养基的三角瓶中，放入25℃气浴摇床中，以150 r/min的转速，震荡培养9-13天，得到培养后牡丹内生真菌菌液，备用；
所述每升液体培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，酵母粉10g，硫酸亚铁1g，硫酸锌0.15g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL，在121 ℃下灭菌30 min，备用；
步骤三、对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝中按照每1 g新鲜菌丝20 mL甲醇的量添加甲醇，然后进行研磨，得到混合液；将混合液装入磨口带塞三角瓶内，在室温下进行50-100Hz超声浸提30 min，浸提后静置20-30min，取上清液置于离心管中，以12000 r/min的转速离心5 min，所得上清液即为含丹皮酚的提取液；将含丹皮酚的提取液放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
所述步骤三中，也可以在新鲜菌丝按照每1 g新鲜菌丝10 mL去离子水的量添加去离子水，然后进行研磨，得到混合液；然后将混合液采用挥发油提取器进行提取，收集下层挥发油；将所得挥发油放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
实施例1
利用所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，包括以下步骤：
步骤一、将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的牡丹内生真菌接种到装有固体扩大培养基的培养皿中，倒置在25 ℃恒温培养箱中培养9天，待菌丝成熟，得到扩大培养后牡丹内生真菌，备用；
所述每升固体扩大培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL；将配成的固体扩大培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中，备用；
步骤二、将扩大培养后牡丹内生真菌接种到装有液体培养基的三角瓶中，放入25℃气浴摇床中，以150 r/min的转速，震荡培养9天，得到培养后牡丹内生真菌菌液，备用；
所述每升液体培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，酵母粉10g，硫酸亚铁1g，硫酸锌0.15g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL，在121 ℃下灭菌30 min，备用；
步骤三、对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝中按照每1 g新鲜菌丝20 mL甲醇的量添加甲醇，然后进行研磨，得到混合液；将混合液装入磨口带塞三角瓶内，在室温下进行50Hz超声浸提30 min，浸提后静置20min，取上清液置于离心管中，以12000 r/min的转速离心5 min，所得上清液即为含丹皮酚的提取液；；将含丹皮酚的提取液放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
实施例2
利用所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，包括以下步骤：
步骤一、将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的牡丹内生真菌接种到装有固体扩大培养基的培养皿中，倒置在25 ℃恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟，得到扩大培养后牡丹内生真菌，备用；
所述每升固体扩大培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL；将配成的固体扩大培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中，备用；
步骤二、将扩大培养后牡丹内生真菌接种到装有液体培养基的三角瓶中，放入25℃气浴摇床中，以150 r/min的转速，震荡培养12天，得到培养后牡丹内生真菌菌液，备用；
所述每升液体培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，酵母粉10g，硫酸亚铁1g，硫酸锌0.15g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL，在121 ℃下灭菌30 min，备用；
步骤三、对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝中按照每1 g新鲜菌丝20 mL甲醇的量添加甲醇，然后进行研磨，得到混合液；将混合液装入磨口带塞三角瓶内，在室温下进行80Hz超声浸提30 min，浸提后静置25min，取上清液置于离心管中，以12000 r/min的转速离心5 min，所得上清液即为含丹皮酚的提取液；将含丹皮酚的提取液放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
实施例3
利用所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，包括以下步骤：
步骤一、将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的牡丹内生真菌接种到装有固体扩大培养基的培养皿中，倒置在25 ℃恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟，得到扩大培养后牡丹内生真菌，备用；
所述每升固体扩大培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL；将配成的固体扩大培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中，备用；
步骤二、将扩大培养后牡丹内生真菌接种到装有液体培养基的三角瓶中，放入25℃气浴摇床中，以150 r/min的转速，震荡培养13天，得到培养后牡丹内生真菌菌液，备用；
所述每升液体培养基的制备方法为：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，酵母粉10g，硫酸亚铁1g，硫酸锌0.15g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL，在121 ℃下灭菌30 min，备用；
步骤三、对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝按照每1 g新鲜菌丝10 mL去离子水的量添加去离子水，然后进行研磨，得到混合液；然后将混合液采用挥发油提取器进行提取，收集下层挥发油；将所得挥发油放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
相关实验：
一、菌株的分离、筛选与鉴定
本发明的牡丹内生菌J1-2，该菌株分离自健康的人工种植的洛阳凤丹的根，茎，叶，采自洛阳牡丹园种植基地，植株年龄五年，植株健壮，无病虫害，它按以下步骤进行分离培养：
将五年生牡丹植株的根和茎切成1.5 cm左右的小段，叶切成2 cm2左右的小片，在超净工作台内对其表面消毒：根和茎分别用75％的酒精浸泡1 min，无菌水冲洗干净，再浸泡于5%次氯酸钠溶液4 min，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗；叶用75％的酒精浸泡20 s，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗，再浸泡于5%次氯酸钠溶液45 s，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗。将消毒过的根和茎用无菌手术刀纵向剖开，叶剪成梳状。将根和茎的纵剖面平铺在加有庆大霉素（4万U/L）的PDA培养基平皿上，叶平铺在平皿中，各重复5次。取消毒过程中的前中后三个阶段的漂洗液滴在培养皿中做对照来验证表面消毒的状况。将这些培养皿放入25℃恒温培养箱中培养，每天定时观察记录内生真菌的生长状况。在培养基上观察到有菌丝生成时，及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上，继续培养，待长出菌丝后继续分离纯化，直到分离到单一菌株。将单一菌株接种在PDA试管斜面培养基中，4℃保存备用。
其中PDA培养基制备方法如下：取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水水煮沸30min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL。将配成的培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中备用；斜面PDA培养基为取5 mLPDA培养基装于试管中，121 ℃高压灭菌30 min，铺成斜面冷却，以备保存菌种。
结果从五年生洛阳凤丹的根，茎，叶中分离出内生真菌41株，并且对照组培养基上并未长菌，证明所消毒程序彻底，分离到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。
筛选的牡丹内生菌J1-2根据《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定，其菌株的菌落特征和子囊壳及附生菌丝、顶毛状态与毛壳菌属极为相近；在PDA固体培养基上培养5 d后，菌落呈现灰黄色，呈立体放射状生长，菌落直径达到7 cm，几乎覆盖整个平板，菌丝生长高度达到0.8 cm，培养基背面呈现较深的灰黄色，菌落质地疏松，继续培养到30 d，菌落颜色一直呈现灰黄色，培养基背面呈现的灰黄色继续加深，在此期间，平板盖上不断出现水滴状渗出物，菌丝不再直立生长，逐渐平铺在培养基上。继续培养到60 d后，显微镜下观察，菌丝交织，呈黑色，透明有隔。子囊壳表生，球形，不透明，体积较大，表面有大量附着丝；顶毛尖端渐纤细，顶毛直，不分支。菌落形态如图1所示，子囊形态如图2所示。
分子鉴定：取适量真菌组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉。然后采用DN41真菌基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取基因组DNA，利用通用引物ITS1和ITS4（其碱基序列参见序列表序列1和序列2），对目的片段进行扩增，PCR产物琼脂糖电泳后经DNA胶纯化试剂盒 (AXYGEN公司)回收纯化，成像结果如图3所示。在550bp附近得到一扩增片段，证明已成功从J1-2菌株中提取其基因组DNA。纯化产物上海生工生物工程公司测序，测序结果的碱基序列如序列表序列3。
测得的ITS序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，结果发现该序列与序列编号JX160051.1等的序列相似性高达99%，与相似性较高的几个序列建立进化树，如图4所示，并结合形态学观察，确定牡丹内生真菌J1-2为毛壳菌属（Chaetomium）。
二、牡丹内生菌产丹皮酚的检测实验
按照本申请中的采用牡丹内生真菌生产震荡培养15天。期间每3天取一次样，一次取3瓶进行抽滤得到新鲜菌丝，并在电子天平上称菌丝重量并记录，称重结果见表2（每次计算的数据以平均值表示）；将收集到的菌丝按照1 g/20 mL的比例用甲醇进行研磨，研磨后装入锯塞三角瓶内在室温下进行超声浸提30 min，浸提后静置，取上清液置于10 mL离心管中，以12000 r/min的转速离心5 min，所得上清液即为含丹皮酚的提取液；以供用紫外分光光度法检测菌丝中丹皮酚含量。
将含丹皮酚的提取液进行GC检测，用丹皮酚的标准品也同时进行GC检测，GC检测条件：色谱柱为Agilent HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速为1 mL min-1；进样口温度250 ℃，气化温度280 ℃。电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描范围20 ~350 aum。将内生真菌提取物的GC检测结果和标准品GC检测结果进行比对，若提取物检测结果的出峰时间和标准品一致，则能判定含丹皮酚的提取液中含有和标准品一致的化学物质。结果发现其中一株J1-2菌的检测结果在6.99分钟（图6）有一处明显峰和丹皮酚标准品出峰时间：6.87分钟（图5）一致，表明J1-2菌株产生了丹皮酚。
紫外分光光度法检测菌丝中丹皮酚含量：精密称取丹皮酚对照品4 mg，置50 mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为80 µg/mL的对照品溶液，然后稀释成不同浓度梯度的丹皮酚标准溶液，浓度分别为0.8 μg/mL ,1.6 μg/mL , 3.2 μg/mL, 4.8 μg/mL, 6.4 μg/mL，8 μg/mL每种浓度进样3 mL。用紫外分光光度计检测对照品相应浓度的吸光值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制丹皮酚对照品的线性方程。不同浓度丹皮酚的吸光度见表1，线性方程见图7，线性方程的R2=0.9986，这说明在0.8～8 µg/mL的浓度范围内，线性关系良好。根据线性方程将每隔三天取出并制成含丹皮酚的提取液的试验样品进行丹皮酚含量测定，测定结果如表2（数据以平均值的形式表示）：其中菌丝中丹皮酚含量计算公式如下：
菌丝中丹皮酚含量（µg/g）=测得的丹皮酚含量（µg/mL）×菌丝提取液体积（mL）/菌丝鲜重（g）
表1 丹皮酚对照品浓度(X)和吸光度(Y)
表2 菌丝鲜重和菌丝中丹皮酚含量值
由表2可知，培养9-13天的发酵培养可获得较高量的丹皮酚，12天的发酵培养可以获得含丹皮酚含量最高的菌丝（2939 µg/g），且此时菌丝鲜重较大（1.99 g），此时所产生的丹皮酚总量最高为2939 µg/g×1.99 g=5848.61 µg. 此种液体发酵培养法在较短时间内能够大量培养出菌丝，且菌丝中丹皮酚含量较高，丹皮酚总量也达到最高值，这种方法为丹皮酚原料的生产提供了一种新途径。
在实验室条件下大规模培养J1-2菌丝，收集菌丝进行研磨，按1g/10mL的比例加入去离子水，用5mL挥发油提取器进行提取，收集下层挥发油，放入4℃冰箱过夜，丹皮酚可结晶。然后利用抽滤机抽去水分，称取结晶的丹皮酚，通过计算，最终的含量可以达到350 µg（丹皮酚晶体）/g（菌丝）。试验表明了可以通过蒸馏提取的方法利用菌丝提取其中的丹皮酚，这为利用真菌生产丹皮酚提供了一种新方法。同时这代替了利用采挖植物药材获得丹皮酚的方法，可以有效的保护中药材从而保护自然环境。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一株牡丹内生真菌及该菌生产丹皮酚的工艺
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccgttggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctccggtt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 574
<212> DNA
<213> 毛壳菌属（Chaetomium）
Claims (6)
1.一株牡丹内生真菌，分类命名为毛壳菌属（Chaetomium sp）J1-2, 已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO: M2014661，保藏日期为2014年12月24日。
2.利用权利要求1所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的牡丹内生真菌接种到装有固体扩大培养基的培养皿中，倒置在25 ℃恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟，得到扩大培养后牡丹内生真菌，备用；
所述固体扩大培养基的制备方法为：每升固体扩大培养基，取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，琼脂17 g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL；将配成的固体扩大培养基在121℃下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中，备用；
步骤二、将扩大培养后牡丹内生真菌接种到装有液体培养基的三角瓶中，放入25 ℃气浴摇床中，以150 r/min的转速，震荡培养9-13天，得到培养后牡丹内生真菌菌液，备用；
所述液体培养基的制备方法为：每升液体培养基，取新鲜马铃薯200 g，切块，用蒸馏水煮沸30 min，四层纱布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20 g，酵母粉10g，硫酸亚铁1g，硫酸锌0.15g，充分溶解后再用蒸馏水补足到1000 mL，在121 ℃下灭菌30 min，备用；
步骤三、对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝中按照每1 g新鲜菌丝20 mL甲醇的量添加甲醇，然后进行研磨，得到混合液；将混合液装入磨口带塞三角瓶内，在室温下进行超声浸提30 min，浸提后静置，取上清液置于离心管中，以12000 r/min的转速离心5 min，所得上清液即为含丹皮酚的提取液；将含丹皮酚的提取液放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
3.如权利要求2所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，其特征在于：所述浸提后静置的时间为20-30min。
4.如权利要求2所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，其特征在于：所述超声浸提的超声频率范围为50-100Hz。
5.如权利要求2所述牡丹内生真菌生产丹皮酚中的工艺，其特征在于：所述步骤三的替换方法为：对培养后牡丹内生真菌菌液进行抽滤，将抽滤所得新鲜菌丝称重，在新鲜菌丝按照每1 g新鲜菌丝10 mL去离子水的量添加去离子水，然后进行研磨，得到混合液；然后将混合液采用挥发油提取器进行提取，收集下层挥发油；将所得挥发油放入4℃冰箱过夜使丹皮酚结晶，得到丹皮酚。
6.如权利要求1所述的牡丹内生真菌在生产丹皮酚中的应用。
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| 牡丹根部内生细菌的分离鉴定及脂肽类物质的拮抗活性研究;杨瑞先等;《微生物学通报》;20141126;第42卷(第6期);第1081-1088页 * |
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