CN111334432A - 一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺 - Google Patents

一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，包括以下步骤；（1）原料的采摘：利用剪刀采摘藤茶枝头嫩叶，避光保存；（2）原料的处理：将步骤（1）中采集的藤茶嫩叶用自来水冲洗5min，将嫩叶放入烧杯中，蒸馏水浸泡30min，10min更换一次蒸馏水，更换3次；（3）接种工具的处理：将接种工具（镊子，手术刀，工具架）利用报纸包扎好放入高压灭菌锅中，121℃条件下灭菌30min；（4）内生菌培养基的制作：称取200g马铃薯并去皮，切成小薄片，加水1000mL,煮沸20min后，用纱布过滤。滤液中加人20g葡萄糖、20g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL制作培养基。本藤茶内生菌产氨基酸的工艺，操作简单，能耗低，原料来源广泛，绿色安全，原料合理综合使用，产率高。

Description

一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺
技术领域
本发明涉及氨基酸培养技术领域，具体为一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺。
背景技术
藤茶系葡萄科蛇葡萄植物显齿蛇葡萄［Ampelopsis grossedentata (Hand.-Mazz.)W. T. Wang］的茎叶，又名莓茶，学名：显齿蛇葡萄，别名：灵芝草、龙须茶，是本草纲目遗漏的奇世珍宝。主要分布于湖北、湖南、云南、贵州等地。藤茶具有杀菌抗炎、清热解毒、降脂降压、提高人体免疫力等功能，而藤茶植物体内存在大量的内生菌，通过发酵可产生氨基酸，具有促进睡眠，改善记忆力，提高思维的敏捷度以及在食品、化妆品等方面具有重要的应用。氨基酸的来源主要是依靠产生氨基酸的菌种，目前氨基酸的生产，主要采用生产氨基酸的菌种进行发酵,多采用液体发酵的方式生产，液体发酵法是借助于液体介质来完成发酵，即先将菌种置于液体介质中，在液体中经几个小时的繁殖，制成发酵液，然后再将发酵液与其他原辅料搅拌，形成液体进行发酵；而固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质，是将菌种与固体辅料进行混合或者将菌种依附于固体辅料袋中进行发酵培养生产，而现有的氨基酸生产工艺操作复杂，能耗和成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，操作简单，能耗低，原料来源广泛，绿色安全，原料合理综合使用，产率高，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，包括以下步骤；
（1）原料的采摘：利用剪刀采摘藤茶枝头嫩叶，避光保存；
（2）原料的处理：将步骤（1）中采集的藤茶嫩叶用自来水冲洗5min，将嫩叶放入烧杯中，蒸馏水浸泡30min，10min更换一次蒸馏水，更换3次；
（3）接种工具的处理：将接种工具（镊子，手术刀，工具架）利用报纸包扎好放入高压灭菌锅中，121℃条件下灭菌30min；
（4）内生菌培养基的制作：称取 200g马铃薯并去皮，切成小薄片，加水 1000mL,煮沸20min 后，用纱布过滤。滤液中加人 20g葡萄糖、20g 琼脂，用蒸馏水定容至1000mL制作培养基。将培养基置于高压灭菌锅，121℃高压灭菌30min，冷却备用；
（5）接种工具与培养基的后处理：将已灭菌后的接种工具与培养基，转移至超洁净工作台进行紫外灭菌并循环接种台中的空气；
（6）接种前叶子的处理：将步骤（2）处理的藤茶叶子用步骤（3）中处理过的镊子夹取放入75%（乙醇:水=75:25,V/V,）的乙醇溶液体外消毒3次，每次5s →转入无菌水中清洗2次，每次2min→藤茶叶转入84消毒液，清洗3次，每次2min→藤茶叶转入无菌水中清洗3次，每次2min→藤茶叶转移到无菌纸上，吸干水份备用；
（7）内生菌的接种：将步骤（6）处理后的藤茶叶转移到干净的无菌纸上，用（3）中处理的镊子压住叶子，用手术刀将叶子边缘切去2mm，再将叶子切成4mm×4mm正方形形状，使用镊子将叶子正面向上，背面接触 （4）中配制、处理的培养基中，再利用镊子轻轻压紧，使背面全部接触培养基，然后再盖上培养皿，将培养皿转移至恒温培养箱中，以恒温箱中恒温30℃培养6天；
（8）固体发酵培养基的制作：按棉籽壳75%，麸皮22%，CaCO31%，MgSO41%，尿素1%比例配制培养基，每袋总量为250g。先将棉籽壳用水浸泡24h，将其中的水挤出，手指缝中无水流出即停止，再将麸皮、CaCO3、MgSO4、尿素按照比例进行混合均匀，装入出菇袋中，压紧，用高压灭菌锅以121℃，灭菌30min，备用；
（9）内生菌固体发酵培养：将步骤（7）中培养后的内生菌进行颜色辨别挑取，至步骤（4）中的培养基中培养4天，将培养出的菌种挑取到步骤（8）固体发酵袋中，然后将固体发酵培养基转移到恒温箱中以30℃，暗培养6天，待内生菌将长满整个发酵袋，用于氨基酸检测。
进一步的，步骤（2）中选择藤茶中黄色的内生菌进行发酵培养。
进一步的，包括内生菌固体发酵培养氨基酸的影响因素选择：从藤茶部位、菌种选择、培养温度以及培养时间进行选择：利用精氨酸标准品制作标准曲线，将提取后的氨基酸通过紫外-可见分光度计，在570nm测量出提取液中氨基酸的吸光度值，将吸光度值带入回归方程，计算氨基酸提取率，根据提取率高低，选择出产生氨基酸的优化条件为：藤茶叶片用于培养内生菌、黄色菌种、培养温度为30℃，培养时间为6天。
进一步的，发酵产生氨基酸利用的是梵净山藤茶中的内生菌作为发酵菌种源。
进一步的，步骤（4）中发酵培养时间需要6天左右。根据氨基酸提取率与时间关系图可以得出，在6天后，氨基酸的含量趋于平缓，为保证得到更多的氨基酸以及节约时间，取6天为最佳培养时间。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本藤茶内生菌产氨基酸的工艺，具有以下好处：
设备构造简单、投资少、能耗低、易操作，后处理简便、污染少，基本无废水排放，此法便于运输，节约成本，以及原料来源广泛，废物对环境影响比较小，发酵后的副产物可以作为一种便宜的农肥使用，对环境的污染较小。
附图说明
图1为氨基酸标准曲线图；
图2为藤茶部位的选择与氨基酸提取率的比较图；
图3为内生菌菌种选择与氨基酸提取率的比较图；
图4为培养温度选择与氨基酸提取率的比较图；
图5为培养时间选择与氨基酸提取率的比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明提供如下技术方案：
一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，包括以下步骤；
（1）原料的采摘：利用剪刀采摘藤茶枝头嫩叶，避光保存；
（2）原料的处理：将步骤（1）中采集的藤茶嫩叶用自来水冲洗5min，将嫩叶放入烧杯中，蒸馏水浸泡30min，10min更换一次蒸馏水，更换3次，选择藤茶中黄色的内生菌进行发酵培养；
（3）接种工具的处理：将接种工具（镊子，手术刀，工具架）利用报纸包扎好放入高压灭菌锅中，121℃条件下灭菌30min；
（4）内生菌培养基的制作：称取 200g马铃薯并去皮，切成小薄片，加水 1000mL,煮沸20min 后，用纱布过滤。滤液中加人 20g葡萄糖、20g 琼脂，用蒸馏水定容至1000mL制作培养基。将培养基置于高压灭菌锅，121℃高压灭菌30min，冷却备用；
（5）接种工具与培养基的后处理：将已灭菌后的接种工具与培养基，转移至超洁净工作台进行紫外灭菌并循环接种台中的空气；
（6）接种前叶子的处理：将步骤（2）处理的藤茶叶子用步骤（3）中处理过的镊子夹取放入75%（乙醇:水=75:25,V/V,）的乙醇溶液体外消毒3次，每次5s →转入无菌水中清洗2次，每次2min→藤茶叶转入84消毒液，清洗3次，每次2min→藤茶叶转入无菌水中清洗3次，每次2min→藤茶叶转移到无菌纸上，吸干水份备用；
（7）内生菌的接种：将步骤（6）处理后的藤茶叶转移到干净的无菌纸上，用（3）中处理的镊子压住叶子，用手术刀将叶子边缘切去2mm，再将叶子切成4mm×4mm正方形形状，使用镊子将叶子正面向上，背面接触 （4）中配制、处理的培养基中，再利用镊子轻轻压紧，使背面全部接触培养基，然后再盖上培养皿，将培养皿转移至恒温培养箱中，以恒温箱中恒温30℃培养6天；
（8）固体发酵培养基的制作：按棉籽壳75%，麸皮22%，CaCO31%，MgSO41%，尿素1%比例配制培养基，每袋总量为250g。先将棉籽壳用水浸泡24h，将其中的水挤出，手指缝中无水流出即停止，再将麸皮、CaCO3、MgSO4、尿素按照比例进行混合均匀，装入出菇袋中，压紧，用高压灭菌锅以121℃，灭菌30min，备用；
（9）内生菌固体发酵培养：将步骤（7）中培养后的内生菌进行颜色辨别挑取，至步骤（4）中的培养基中培养4天，将培养出的菌种挑取到步骤（8）固体发酵袋中，然后将固体发酵培养基转移到恒温箱中以30℃，暗培养6天，待内生菌将长满整个发酵袋，用于氨基酸检测；
发酵产生氨基酸利用的是梵净山藤茶中的内生菌作为发酵菌种源；
还包括内生菌固体发酵培养氨基酸的影响因素选择：从藤茶部位、菌种选择、培养温度以及培养时间进行选择：利用精氨酸标准品制作标准曲线，将提取后的氨基酸通过紫外-可见分光度计，在570nm测量出提取液中氨基酸的吸光度值，将吸光度值带入回归方程，计算氨基酸提取率，根据提取率高低，选择出产生氨基酸的优化条件为：藤茶叶片用于培养内生菌、黄色菌种、培养温度为30℃，培养时间为6天。
1内生菌固体发酵培养产生氨基酸的影响因素选择
1.1藤茶部位的选择
分别采集同一时间的藤茶叶子和藤茶杆，至于阴暗的盒子中转移到室内进行实验，以培养温度为30℃，培养白色菌种，暗培养6天，按照1.1.1中的方法进行内生菌培养，产生氨基酸，检测氨基酸含量，探讨藤茶不同部位对于产生氨基酸含量多少之间的关系。
1.2藤茶中内生菌类型的选择
采集新鲜的藤茶叶子，以培养温度为30℃，暗培养6天，按照1.1.1的方法进行内生菌培养，选择白色菌与黄色菌，分别培养发酵培养，产生氨基酸，检测氨基酸含量，探讨前期内生菌中菌种的不同对于产生氨基酸含量之间的关系。
1.3 培养温度的选择
采集新鲜的藤茶叶子，以白色菌种暗培养6天，按照1.1.1的方法进行内生菌培养，选择温度为20、25、30、35、40℃进行发酵培养产生氨基酸，检测氨基酸含量，探讨培养温度对于菌种产生氨基酸含量之间的关系。
1.4 培养时间的选择
采集新鲜的藤茶叶子，白色菌种以25℃暗培养，按照1.1.1的方法进行内生菌培养，产生氨基酸，检测氨基酸含量，探讨培养时间对于内生菌产生氨基酸含量之间的关系。
2 结果与分析
2.1藤茶部位的选择
探讨藤茶部位的选择对氨基酸提取率的影响，结果如图2所示，由图2可知，选择藤茶杆作为培养内生菌产生的氨基酸提取率低于，选择叶子作为培养内生菌产生氨基酸的量，所以，选择叶作为培养内生菌进行发酵产生氨基酸。
2.2 藤茶中内生菌类型的选择
探讨藤茶中内生菌的品种对产生氨基酸提取率影响，结果如图3所示。由如图3可知，选择黄色菌发酵培养产生氨基酸提取率大于白色菌发酵培养产生的氨基酸含量，所以，选择黄色菌作为发酵培养产生氨基酸的菌种。
2.3 培养温度的选择
探讨培养温度对内生菌发酵产生氨基酸量提取率的影响，结果如图4所示。由如图4可知，培养温度由20-30℃产生的氨基酸吸光度值呈现上升趋势，这是因为当温度逐渐上升，袋中生产氨基酸的内生菌的活性逐渐升高，使得生产出的氨基酸的提取率逐渐升高，得出氨基酸量逐渐升高，当温度在30-35℃以后，产生氨基酸的提取率呈现下降的趋势，在30℃左右，氨基酸含量最高，这是因为，产生氨基酸的菌种在30℃左右时，活性达到了最高，而当温度继续上升时，内生菌会被高温杀死，使得许多的菌种失去活性，只存在了少部分的内生菌，故使得氨基酸的提取率下降。
2.4 培养时间的选择
探讨培养时间对内生菌发酵对氨基酸提取率的影响，结果如图5所示。由如图5可知，培养时间在3-6天时，氨基酸提取率值呈现上升的趋势，这是因为，在短时间内，袋中的营养成分丰富，大量的菌种繁殖，会产生大量的氨基酸，而当培养时间从6天后，氨基酸提取率基本呈现平稳的趋势，随着培养时间的延长，袋中的营养成分耗尽，菌种的繁殖趋于饱和，以及部分菌种的失活，使得生产的氨基酸量上升缓慢，含量趋于平缓，故提取率下降，所以，选择培养6天作为培养内生菌产生氨基酸的培养时间。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，其特征在于：包括以下步骤；
（1）原料的采摘：利用剪刀采摘藤茶枝头嫩叶，避光保存；
（2）原料的处理：将步骤（1）中采集的藤茶嫩叶用自来水冲洗5min，将嫩叶放入烧杯中，蒸馏水浸泡30min，10min更换一次蒸馏水，更换3次；
（3）接种工具的处理：将接种工具（镊子，手术刀，工具架）利用报纸包扎好放入高压灭菌锅中，121℃条件下灭菌30min；
（4）内生菌培养基的制作：称取 200g马铃薯并去皮，切成小薄片，加水 1000mL,煮沸20min 后，用纱布过滤，滤液中加人 20g葡萄糖、20g 琼脂，用蒸馏水定容至1000mL制作培养基，将培养基置于高压灭菌锅，121℃高压灭菌30min，冷却备用；
（5）接种工具与培养基的后处理：将已灭菌后的接种工具与培养基，转移至超洁净工作台进行紫外灭菌并循环接种台中的空气；
（6）接种前叶子的处理：将步骤（2）处理的藤茶叶子用步骤（3）中处理过的镊子夹取放入75%（乙醇:水=75:25,V/V,）的乙醇溶液体外消毒3次，每次5s →转入无菌水中清洗2次，每次2min→藤茶叶转入84消毒液，清洗3次，每次2min→藤茶叶转入无菌水中清洗3次，每次2min→藤茶叶转移到无菌纸上，吸干水份备用；
（7）内生菌的接种：将步骤（6）处理后的藤茶叶转移到干净的无菌纸上，用（3）中处理的镊子压住叶子，用手术刀将叶子边缘切去2mm，再将叶子切成4mm×4mm正方形形状，使用镊子将叶子正面向上，背面接触 （4）中配制、处理的培养基中，再利用镊子轻轻压紧，使背面全部接触培养基，然后再盖上培养皿，将培养皿转移至恒温培养箱中，以恒温箱中恒温30℃培养6天；
（8）固体发酵培养基的制作：按棉籽壳75%，麸皮22%，CaCO31%，MgSO41%，尿素1%比例配制培养基，每袋总量为250g。先将棉籽壳用水浸泡24h，将其中的水挤出，手指缝中无水流出即停止，再将麸皮、CaCO3、MgSO4、尿素按照比例进行混合均匀，装入出菇袋中，压紧，用高压灭菌锅以121℃，灭菌30min，备用；
（9）内生菌固体发酵培养：将步骤（7）中培养后的内生菌进行颜色辨别挑取，至步骤（4）中的培养基中培养4天，将培养出的菌种挑取到步骤（8）固体发酵袋中，然后将固体发酵培养基转移到恒温箱中以30℃，暗培养6天，待内生菌将长满整个发酵袋，用于氨基酸检测。
2.根据权利要求1所述的一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，其特征在于：步骤（2）中选择藤茶中黄色的内生菌进行发酵培养。
3.根据权利要求1所述的一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，其特征在于：还包括内生菌固体发酵培养氨基酸的影响因素选择：从藤茶部位、菌种选择、培养温度以及培养时间进行选择：利用精氨酸标准品制作标准曲线，将提取后的氨基酸通过紫外-可见分光度计，在570nm测量出提取液中氨基酸的吸光度值，将吸光度值带入回归方程，计算氨基酸提取率，根据提取率高低，选择出产生氨基酸的优化条件为：藤茶叶片用于培养内生菌、黄色菌种、培养温度为30℃，培养时间为6天。
4.根据权利要求1所述的一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，其特征在于：发酵产生氨基酸利用的是梵净山藤茶中的内生菌作为发酵菌种源。
5.根据权利要求1所述的一种藤茶内生菌产氨基酸的工艺，其特征在于：步骤（4）中发酵培养时间需要6天左右。根据氨基酸提取率与时间关系图可以得出，在6天后，氨基酸的含量趋于平缓，为保证得到更多的氨基酸以及节约时间，取6天为最佳培养时间。
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