CN107435029A - 农业废弃物固态发酵培养药用真菌桦褐孔菌的方法 - Google Patents

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王丹丹
范佳慧
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Abstract

本发明提供了一种以农业废弃物为原料，采用固态发酵培养珍稀药用真菌‑桦褐孔菌的方法。该方法步骤：1.在250mL三角瓶中加入花生壳20g(过100目筛)、尿素0.4g、硫酸铵0.4g、磷酸二氢钾0.4g、碳酸钙0.4g、水40mL，充分混匀，无菌封口膜封口，灭菌30分钟后，放入无菌操作台中备用。2.将液体培养的种子液在无菌操作台中加入到已灭菌的固体培养基中，室温下避光培养，其间保持良好通风，每个月定时定量向每个培养瓶里添加无菌水，每个月取出三瓶，测定菌丝体重，同时测定菌丝体中多糖含量以及多酚、三萜等活性成分含量。培养三个月后发现农业废弃物已被桦褐孔菌消耗殆尽，菌丝体生长停滞，测定发现多酚、三萜含量逐月稳步增加，三个月后含量趋于稳定。

Description

农业废弃物固态发酵培养药用真菌桦褐孔菌的方法
技术领域
本发明涉及一种人工固态发酵培养大型珍稀药用真菌-桦褐孔菌的方法。桦褐孔菌[Inonotus obliquus(Fr.)Pilat]，别名白桦茸，为多孔菌科、褐卧孔菌属药用真菌，桦褐孔菌主要分布于东欧、俄罗斯、芬兰、波兰等地，我国主要分布于黑龙江省的大小兴安岭、吉林省的长白山等北纬40°-50°高寒地区。桦褐孔菌的野生资源匮乏，是一种珍稀的名贵的药用真菌，菌体入药，在俄罗斯、北欧、日本、美国和韩国被广泛用来治疗恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肝病[和艾滋病，且无任何毒副作用。深入研究发现，桦褐孔菌的这些生理功效与其产生的多萜、多酚等生物活性成分相关。
背景技术
现有培育桦褐孔菌的方法有两种：一种是液态发酵法；一种是固态发酵法。
目前液态发酵法已经逐渐成熟，但是液态发酵法存在的主要问题：一是培育条件苛刻，培育过程繁琐，易染菌；二是桦褐孔菌球在液体培养基中聚集成块，生长慢且活性物产率低。
目前固态培养尚处于起步阶段，其方式主要有两种：袋料栽培、木段栽培。袋料栽培存在的主要问题：产量和质量不稳定，还没有形成规模化推广生产。木段栽培存在主要问题：生物活性物质产率低，且对木材资源造成大量的浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用农业废弃物作为培养基、菌丝体和活性产物产量双高的桦褐孔菌新型固态发酵技术。
本发明涉及桦褐孔菌的固态发酵培育新技术，其特征是，以农业废弃物花生壳、花生粕、玉米须、麦麸等作为培养基的碳源，在室温下避光静置培养桦褐孔菌，通过定期测定桦褐孔菌的菌丝体重量及其中活性产物含量，从中筛选出利用农业废弃物适合桦褐孔菌生长的固态发酵方法。
附图说明
1.培养基配方
2.培养情况
2.1 培养一个月
花生壳培养基培育的桦褐孔菌的菌落形态描述：菌落质地疏松，外观干燥，不透明，呈毛绒状；菌落与培养基连接疏松；菌落正面呈现乳白色、反面呈现淡黄色、边缘与中心颜色相差不大；菌落边缘整齐；菌丝间丝状交织，生长速度快。见附图1。
花生壳培养基培育一个月桦褐孔菌菌丝体所含成分表
花生粕培养基培育的菌落形态描述：菌落质地疏松，外观干燥，不透明，呈棉絮状；菌落与培养基连接疏松；菌落正、反面均呈现乳白色、边缘与中心颜色相差不大；菌落边缘整齐，可见粗丝状细胞；菌丝间丝状交织，生长速度快。见附图2。
花生粕培养基培育一个月桦褐孔菌菌丝体所含成分表
2.2 培养两个月
花生壳培养基培育的菌落形态描述：菌落质地紧密，外观干燥，不透明，呈毛绒状；菌落与培养基连接较紧密；菌落正、反面均呈现浅黄色、边缘与中心颜色相差较大；菌落边缘整齐；菌丝间丝状交织，生长速度较快。见附图3。
花生壳培养基培养两个月桦褐孔菌菌丝体所含成分表
花生粕培养基培养的菌落形态描述：菌落质地紧密，外观湿润，不透明，呈棉絮状；菌落与培养基连接较紧密；菌落正面呈现淡黄色、反面呈现深褐色、边缘与中心颜色相差不大；菌落边缘整齐，可见粗丝状细胞；菌丝间丝状交织，生长速度较快。见附图4。
花生粕培养基培养两个月桦褐孔菌菌丝体所含成分表
2.3 培养三个月
花生壳培养基培养的菌落形态描述：菌落质地密实，外观湿润，不透明，呈毛绒状；菌落与培养基连接紧凑；菌落正、反面均呈现黄褐色、边缘与中心颜色相近；菌落边缘整齐；菌丝间丝状交织，生长停滞。见附图5。
花生壳培养基培养三个月桦褐孔菌菌丝体所含成分表
花生粕培养基培养的菌落形态描述：菌落质地紧密，外观湿润，不透明，呈棉絮状；菌落与培养基连接紧凑；菌落正、反面呈现淡黄色、边缘与中心颜色相近；菌落边缘整齐，可见粗丝状细胞；菌丝间丝状交织，生长速度快。见附图6。
花生粕培养基培养三个月桦褐孔菌菌丝体所含成分表
该种培养方法的主要过程是：
将液体培养的种子在无菌操作台中加入到已经灭菌好的固体培养基中，室温下避光培养，其间保持良好通风，每个月定时定量向每个培养瓶里添加无菌水，每个月监测菌丝体重，并且提取测定菌丝体中的多糖、多酚、三萜含量。
本发明的培养方法克服了现有的桦褐孔菌人工固态培养的缺点，主要优点在于：
1、本发明的培养方法采用农业废弃物作为培养基的碳源，节能减排，提高了农业废弃物的高附加值开发利用，减少了农业废弃物焚烧、倾倒对环境造成的污染；
2、所用培养基配方简单，培养过程易于控制、操作省时省力，节约成本，减少了对木材的大量浪费。
具体实施方式
本发明涉及的桦褐孔菌的固态发酵方法将通过下面的实施例而得到更具体的描述。
实施例1 花生壳培养基固态发酵法培养桦褐孔菌
在250mL三角瓶中加入花生壳20g(过100目筛)、尿素0.4g、硫酸铵0.4g、磷酸二氢钾0.4g、碳酸钙0.4g、水40mL，充分混匀后，无菌封口膜封口，灭菌30分钟后，放入无菌操作台中备用。
将在摇床中培养好的种子液接种到已经灭菌的花生壳固态培养基中，每瓶按2％接种量接种种子液，使其平铺在培养基表面，用无菌封口膜封口，静置于避光处培养，保持良好通风。每隔一个月取一次样，每次平均取三瓶，检测其菌丝体重以及其中活性产物(多糖、多酚、多萜)含量，并向剩余瓶中加入20mL无菌水，原条件继续培养。三个月后测得此方法得到的菌丝体中多糖含量较低为0.061±0.003mg/g，得出培养基中花生壳已被桦褐孔菌分解殆尽，菌丝体生长停滞；多酚含量为45.90±0.26ug/g、三萜含量为0.19±0.001mg/g，得出桦褐孔菌利用农业废弃物产生除了大量的活性物质多酚、三萜，因此三个月为桦褐孔菌的最适培养周期。
实施例2 花生粕培养基固态发酵法培育桦褐孔菌
在250mL三角瓶中加入花生粕20g(过100目筛)、尿素0.4g、硫酸铵0.4g、磷酸二氢钾0.4g、碳酸钙0.4g、水40mL，充分混匀后，灭菌30分钟，放入无菌操作台中备用。
将在摇床中培养好的种子液接种到已经灭菌的花生粕固态培养基中，每瓶按2％接种量种子液，使其平铺在培养基中，用无菌封口膜封口，静置于避光处培养，保持良好通风。每隔一个月取一次样，每次取三瓶，检测其菌丝体重以及其中活性产物(多糖、多酚、多萜)含量，并向剩余瓶中加入20mL无菌水，原条件继续培养。三个月后测得此方法得到的菌丝体中多糖含量较低为多糖含量为0.084±0.001mg/g，得出培养基中花生粕已被桦褐孔菌分解殆尽，菌丝体生长停滞；多酚含量为多酚含量为121.31±0.22ug/g、三萜含量为0.39±0.002mg/g，得出桦褐孔菌利用农业废弃物产生了大量的活性物质多酚、三萜，因此三个月为桦褐孔菌的最适培养周期。

Claims (4)

1.一种利用农业废弃物为培养基固态发酵生产大型珍稀药用真菌桦褐孔菌的方法，其特征是以花生粕、花生壳、麦麸、玉米须等农业废弃物为培养基碳源，采用固态静置培养方式，将液体种子定量加入固态培养基中，使种子液平铺在培养基表面，室温下避光培养，其间保持良好通风，每个月定时定量向每个培养瓶里添加无菌水，每个月抽样检测菌丝体重，并测定功效成分多糖、多酚、三萜含量，以监测桦褐孔菌的生长情况。
固态培养基配方为：农业废弃物20g，尿素、(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCO3各0.4g，加入40mL蒸馏水搅拌至充分溶解。
2.根据权利要求1所述的一种以农业废弃物为培养基，采用固态发酵法生产桦褐孔菌的方法，其农业废弃物是指花生粕、花生壳等坚果类农业废弃物。
3.根据权利要求1所述的一种以农业废弃物为培养基，采用固态发酵法生产桦褐孔菌的方法，其农业废弃物是指小麦麸皮、大麦麸皮等谷类麸皮农业废弃物。
4.根据权利要求1所述的一种以农业废弃物为培养基，采用固态发酵法生产桦褐孔菌的方法，其农业废弃物是指玉米须等谷类花柱农业废弃物。
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