CN103783264B

CN103783264B - 一种发酵松针饲料的制备方法

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Publication number: CN103783264B
Application number: CN201410034121.8A
Authority: CN
Inventors: 吴秋珏; 王玉琴; 刘宁; 李元晓; 王国永; 王占彬; 祁艳霞
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-01-24
Also published as: CN103783264A

Abstract

本发明涉及一种黑曲霉发酵制备具有生物活性的松针发酵饲料的方法。该方法包括松针的预处理、粉碎、黑曲霉的培养、固体发酵培养基的制备、黑曲霉接种、密封发酵和烘干粉碎的制备过程，即为具有生物活性的松针发酵饲料。利用本发明制备的松针发酵饲料中，原松针的青气、药味减弱或消失，苦味消失，与原松针以及松针粉相比，极大地改善了其适口性，能够提高动物的采食量；经测定所得到的松针发酵饲料中，蛋白质、氨基酸的含量明显提高，同时含有丰富的纤维素酶、半纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶，促进对松针中纤维素的消化，有利于非草食性动物的大量采食，扩大了松针作为饲料的应用范围。

Description

一种发酵松针饲料的制备方法

技术领域

本发明主要涉及发酵饲料领域，尤其涉及一种发酵松针饲料的制备方法。

背景技术

随着畜牧养殖业的快速发展，人畜共粮的矛盾日趋突出，为解决这一问题，世界各国科技界和工业界都在寻找和研究新的饲料资源，松针就是一种新的饲料原料。

松针是松科、松属植物的叶，别名松叶，松毛等，味苦、性温、有补充营养、健脾理气、祛风燥湿、杀虫和止痒等功效。松针含有动物生长所必需的生物活性物质和营养成分，含有丰富的胡萝卜素和多种维生素，并含有黄酮类化合物、多种氨基酸、微量元素及植物杀菌素等对人和畜禽具有显著生物活性的化合物，这些活性物质能有效增强机体的抗氧化机能，促进机体免疫器官的发育；抑制甲型流感病毒H1Nl等病毒，增强动物机体的新陈代谢、促进生长和提高生产性能等作用。此外，松针来源于高纬度的山林，受污染少，而且是可再生资源，在自然资源日益减少的今天，松针的作用及其可再生的优势，使其作为饲料以及饲料添加剂具有广阔的前景。

但是迄今为止，松针的利用则较为单一，都是采用直接饲喂或者制成松针粉进行饲喂的方式，但是松针表面含有蜡质层，既影响口感，营养物质又不容易释放出来，而且松针味苦，适口性较差，使得动物不喜食，此外非草食动物体内缺乏足够的纤维素酶和半纤维素酶，因此不能充分消化吸收松针中的纤维素和半纤维素一类的物质，使其利用受到一定的限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备发酵松针饲料的方法，从而改善松针的适口性，并提高松针的营养价值，并且利于动物尤其是非草食性动物的消化吸收。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种制备发酵松针饲料的方法，其步骤如下：

（1）松针的预处理，将新鲜松针用清水洗净后在50~60℃、浓度为0.5~0.8mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡1~2h，然后用浓度为0.5~0.8mol/L的盐酸溶液或者清水进行多次清洗，并放入蒸锅，在90~100℃温度下蒸3~5分钟，使其脱去蜡质层，然后将脱去蜡质层的松针用浓度大于90%的乙醇进行漂洗，通风30min，再用无菌的生理盐水进行清洗；

（2）将步骤（1）中得到的预处理后的松针在55~60℃条件下进行烘干并粉碎，过40~60目筛，得到颗粒均匀的松针粉碎物；

（3）将黑曲霉接种于土豆葡萄糖培养基上进行培养，等孢子长满培养基斜面后用无菌水制成孢子菌悬液，其中孢子含量为4.5~5.5х10⁶个/mL；

（4）将步骤（2）所得的松针粉碎物与豆粕、小麦麸皮、玉米糁按8:0.5:1:0.5的比例进行混合，作为固体介质，然后按照固液比1:1.5的比例在所述的固体介质中加入营养素，得固体发酵培养基，其中所述的营养素组成为葡萄糖、尿素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁，其组成比例为4:1:6:1:2:1；

（5）将步骤（4）所得固体发酵培养基在125℃条件下灭菌30min；

（6）将步骤（5）所得的灭菌后的固体发酵培养基装在一个塑料袋中，并加水，使固体发酵培养基的含水率为55% ~ 66%，并调整其pH值使其保持在4.0~7.0；

（7）将步骤（3）所得的孢子菌悬液接种在步骤（6）所得的培养基中，接种量为1%~7%，然后将其用聚乙烯薄膜进行密封，在25℃-30℃下进行厌氧发酵48h；

（8）将步骤（7）所得的发酵物进行干燥，使其干物质量达到90%以上，然后进行粉碎并过40目筛，即得到最终的产品。

所述的黑曲霉购自广东环凯微生物科技有限公司，保藏于美国标准生物品收藏中心，其保藏编号为ATCC 16404，购买日期为2013年9月20日。

本发明的有益效果是：

第一，经步骤（1）中的预处理能够去除松针表面的蜡质层，减弱松针的青气和苦涩味，改善其适口性，增加动物的采食量，而且相对于未进行预处理的松针发酵饲料，本发明中的发酵效果得到了很大的提高，进而能够增加发酵产物，使得所制得的松针发酵饲料的营养价值更高；

第二，将预处理后的松针进行粉碎再进行发酵处理，可以增加发酵底物即松针与发酵菌种黑曲霉的接触面积，有利于发酵过程的进行；

第三，本发明中的固体发酵培养基中不仅含有松针粉碎物，还包括豆粕、小麦麸皮、玉米糁，以及提供能量和矿物质元素的包括葡萄糖、尿素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁的营养素，为黑曲霉的培养提供了丰富的营养，而且作为广泛应用的饲料原料的豆粕、小麦麸皮和玉米糁也在松针发酵的过程中被黑曲霉发酵，生成相应的发酵产物，在一定程度上也提高了松针发酵饲料的营养价值；

第四，经黑曲霉发酵的松针具备果香味，原松针的青气、药味减弱或消失，苦味消失，与原松针以及松针粉相比，极大地改善了其适口性，能够提高动物的采食量；

第五，经测定，与直接饲喂的松针粉相比，制备的发酵松针的营养价值和生物活性都得到了大幅度的提高，尤其是在较优的条件下，粗蛋白的含量从发酵前的11.04%增加到22. 98%，提高了108. 15%；总氨基酸、动物所需的必需氨基酸含量分别从发酵前的8.72% 和4. 56% 增加到17. 54% 和7. 04%；

第六，发酵之前的松针几乎不含有纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，其含有的纤维素很难被非草食性动物消化吸收，而通过黑曲霉的发酵，在发酵产物中富含高活力的纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶, 尤其是在较优的条件下，上述酶的活力分别为10. 26、119.45 和35. 86 U /g，有利于非草食动物对松针中纤维素和半纤维素的消化利用，扩大了松针作为饲料原料的使用范围。

因此，本发明通过对松针的预处理和黑曲霉发酵，使得松针的适口性得到了极大地改善，而且又很大程度上提高了松针自身的营养价值，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面结合三个实施例具体说明本发明。

实施例1：

（3）将黑曲霉接种于土豆葡萄糖培养基上进行培养，等孢子长满斜面后用无菌水制成孢子菌悬液。其中孢子含量为4.5~5.5х10⁶个/mL；

（4）将步骤（2）所得的松针粉碎物与豆粕、小麦麸皮、玉米糁按8:0.5:1:0.5的比例进行混合作为固体介质，然后按照固液比1:1.5的比例在所述的固体介质中加入营养素，得固体发酵培养基，所述的营养素组成为葡萄糖、尿素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁，其组成比例为4:1:6:1:2:1；

（6）将步骤（5）所得的培养基装在一个塑料袋中，加入无菌水，使其培养基的初始含水率为55%，并使其pH值为4.0；

（7）将步骤（3）所得的孢子菌悬液接种在步骤（6）所得的培养基中，接种量为1%，然后将其用聚乙烯薄膜进行密封，在25℃下进行厌氧发酵48h；

（8）将步骤（7）所得的发酵物进行干燥，使其干物质量达到90%以上，然后进行粉碎，过40目筛得到最终的产品。

经测定，上述方法所得的发酵松针饲料中，粗蛋白含量为13.31%，总氨基酸含量为9.83%，必需氨基酸的含量为5.12%，纤维素酶的活力为6.89 U /g，半纤维素酶的活力为60.95 U /g，β-葡萄糖苷酶的活力为27.59 U /g。

实施例2：

（3）将黑曲霉接种于土豆葡萄糖培养基上进行培养，等孢子长满斜面后用无菌水制成孢子菌悬液。其中，孢子含量为4.5~5.5х10⁶个/mL；

（4）将步骤（2）所得的松针粉碎物与豆粕、小麦麸皮，玉米糁按8:0.5:1:0.5的比例进行混合，作为固体介质，然后按照固液比1:1.5的比例在所述的固体介质中加入营养素，得固体发酵培养基，所述的营养素组成为葡萄糖、尿素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁，其组成比例为4:1:6:1:2:1；

（6）将步骤（5）所得的培养基装在一个塑料袋中，加入无菌水，使其培养基的含水率为63%，并使其pH值为5.5；

（7）将步骤（3）所得的孢子菌悬液接种在步骤（6）所得的培养基中，接种量为2.5%，然后将其用聚乙烯薄膜进行密封，在28℃下进行厌氧发酵48h；

（8）将步骤（7）所得的发酵物进行干燥，使其干物质量达到90%以上，然后进行粉碎，过40目筛，即得到最终的产品。

经测定，上述方法所得的发酵松针饲料中，粗蛋白含量为22.98%，总氨基酸含量为17.54%，必需氨基酸的含量为7.04%，纤维素酶的活力为10.26 U /g，半纤维素酶的活力为119.45 U /g，β-葡萄糖苷酶的活力为35.86 U /g,。

实施例3：

（6）将步骤（5）所得的培养基装在一个塑料袋中，加入无菌水，使其培养基的含水率为66%，并使其pH值为7.0；

（7）将步骤（3）所得的孢子菌悬液接种在步骤（6）所得的培养基中，接种量为7%，然后将其用聚乙烯薄膜进行密封，在30℃下进行厌氧发酵48h；

经测定，上述方法所得的发酵松针饲料中，粗蛋白含量为18.72%，总氨基酸的含量为13.46%，必需氨基酸的含量为6.18%，纤维素酶的活力为9.38U/g，半纤维素酶的活力为99.35U/g，β-葡萄糖苷酶的活力为23.67U/g。

下面结合试验例进一步对本发明进行说明。

试验例1：探讨培养基初始含水量、菌悬液在培养基的接种量、培养基初始pH值以及培养温度对发酵产物中纤维素酶以及半纤维素酶活力的影响。

（1）培养基初始含水量对发酵产物中酶活力的影响。

固态发酵工艺中, 初始含水量是关键参数之一。菌丝生长、酶等代谢产物的形成都需要适宜的水分。依照本发明的方法，分别以初始含水率为55% 、59% 、63% 、66% 和70%进行发酵试验，试验结果见表1。

表1 培养基初始含水量对酶活力的影响

初始含水率（%）	生长情况	纤维素酶（U/g）	半纤维素酶（U/g）
				55	菌丝生长缓慢、孢子少	5.89	47.64
59	菌丝生长较好，孢子较多	8.93	102.13
				63	菌丝生长旺盛，孢子密集	10.06	118.97
66	菌丝生长缓慢、孢子较少	6.85	77.54
				70	菌丝、孢子稀疏	2.94	54.35

从表1中可以看出，水分太多或太少对纤维素酶和半纤维素酶的形成都不利。当初始含水率为63% 时，形成的孢子多，且产生的纤维素酶和半纤维素酶活力最高。

（2）菌悬液在培养基上的接种量对发酵产物中酶活力的影响。

依照本发明的方法，以1% 、3%、5%、7% 和9% 的接种量进行发酵试验，结果如表2所示。

表2 接种量对酶活力的影响

接种量（%）	纤维素酶（U/g）	半纤维素酶（U/g）
			1	7.92	82.64
3	10.38	117.68
			5	9.38	109.97
7	7.69	70.24
			9	5.87	58.49

从表2中可以看出, 接种量为1% 时，酶活力低；当接种量为3% 时，发酵所产的纤维素酶、半纤维素酶活力最高，分别为10. 38和117.68U /g；当接种量大于7% 时，酶活力大幅度下降。

（3）初始pH值对发酵产物中酶活力的影响。

培养基中初始pH 值对酶的合成有重要影响。不同的菌种在菌丝生长和酶的合成过程中所要求的最佳pH值往往不同。依照本发明的方法，以培养基初始pH 值为3. 0、4. 0、5. 0、6. 0和7. 0时进行发酵试验，试验结果见表3。

表3 初始pH值对酶活力的影响

初始pH值	纤维素酶（U/g）	半纤维素酶（U/g）
			3.0	5.12	59.64
4.0	7.67	82.75
			5.0	9.54	109.68
6.0	8.25	92.31
			7.0	7.63	90.12

从表3中可以看出，当初始pH 值为5. 0时，纤维素酶和半纤维素酶的活力最高。

（4）培养温度对发酵产物中酶活力的影响。

培养温度对微生物的生长和代谢产物的分泌有着显著的影响。由于固态发酵过程中有大量的热产生，实际的料层温度要比培养温度要高，若不能有效地控制培养温度，会造成酶失活，从而导致发酵失败。按照本发明的方法，以培养温度为25℃、28℃、30℃和32℃进行发酵试验，试验结果见表4。

表4 培养温度对酶活力的影响

培养温度（℃）	纤维素酶（U/g）	半纤维素酶（U/g）
			25	6.98	80.37
28	8.95	99.37
			30	9.58	109.68
32	7.95	93.71

从表4中可以看出，当培养温度为28~30℃时，发酵产物中纤维素酶和半纤维素酶的活力最高。

试验例2：探讨不同的处理方法对发酵松针饲料中营养成分的影响。

取新鲜松针洗净，平均分为两部分，一部分为A组，在较优的条件下按照本发明的方法进行发酵松针饲料的制备，另一部分为B组，不进行松针的预处理，其他步骤与A组处理方法一致，进行发酵松针饲料的制备，最后对制备的发酵松针饲料的营养成分进行测定，其测定结果见表5。

表5 不同处理方法对发酵松针饲料中营养成分的影响

组别	粗蛋白（%）	总氨基酸（%）	必需氨基酸（%）	纤维素酶（%）	半纤维素酶（%）	β-葡萄糖苷酶（U/g）
							A	22. 98	16. 54	7. 04	10. 26	119.45	35. 86
B	16.21	12.11	6.72	5.22	88.74	21.53

从表5中可以看出，在对松针进行预处理除去其表面蜡质层的A组中，各种营养成分以及酶活力均明显高于没有进行预处理的B组。

试验例3：探讨黑曲霉发酵前后对松针中营养成分的影响。

取新鲜松针洗净，平均分为两部分，一部分为C组，在较优的条件下按照本发明的方法进行发酵松针饲料的制备，另一部分为D组，按照本发明所述方法的步骤（1）和步骤（2）的处理，不经黑曲霉的发酵，然后对两组进行营养成分的测定，其测定结果见表6。

表 6 黑曲霉发酵前后对松针中营养成分的影响

组别	粗蛋白（%）	总氨基酸（%）	必需氨基酸（%）	纤维素酶（%）	半纤维素酶（%）	β-葡萄糖苷酶（U/g）
							C	22. 98	16. 54	7. 04	10. 26	119.45	35. 86
D	11.04	8.72	4. 56	0	0	0

从表6中可以看出，其中C组按照本发明的方法进行黑曲霉的发酵后，其营养价值和生物活性都较未经黑曲霉发酵的D组有了大幅度的提高。

Claims

1.一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）松针的预处理，将新鲜松针用清水洗净后在50~60℃氢氧化钠溶液中浸泡1~2h，然后用盐酸溶液或者清水进行多次清洗，并放入蒸锅，在90~100℃温度下蒸3~5分钟，使其脱去蜡质层，然后将脱去蜡质层的松针用乙醇进行漂洗，通风30min，再用无菌的生理盐水进行清洗；

（2）将步骤（1）中得到的松针在55~60℃条件下烘干并粉碎，过40~60目筛，得到颗粒均匀的松针粉碎物；

（3）将黑曲霉接种于土豆葡萄糖培养基上进行培养，等孢子长满培养基斜面后用无菌水制成孢子菌悬液；

（4）将步骤（2）所得的松针粉碎物与豆粕、小麦麸皮、玉米糁按8:0.5:1:0.5的比例进行混合，作为固体介质，然后按照固液比1:1.5的比例在固体介质中加入营养素，得固体发酵培养基；

（6）将步骤（5）所得的固体发酵培养基加入无菌水，使其含水率为55% ~ 66%，并且pH值保持在4.0~7.0；

（7）将步骤（3）所得的孢子菌悬液按照1%~7%的接种量接种在步骤（6）所得的培养基中，然后将其密封进行厌氧发酵48h；

（8）将步骤（7）所得的发酵物进行干燥至恒重，使其干物质量达到90%以上，然后进行粉碎并过40目筛即得到产品。

2.根据权利要求1所述的一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）中的营养素组成为葡萄糖、尿素、硫酸铵、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁，其组成比例为4:1:6:1:2:1。

3.根据权利要求1所述的一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的孢子菌悬液中的孢子含量为4.5~5.5х10⁶个/ml。

4.根据权利要求1所述的一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：步骤（7）中所述的进行厌氧发酵的温度为25℃~30℃。

5.根据权利要求1所述的一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.5~0.8mol/L。

6.根据权利要求1所述的一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的盐酸溶液的浓度为0.5~0.8mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种发酵松针饲料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的乙醇浓度大于90%。