CN103468629B - 以桔皮为原料发酵木霉菌的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
以桔皮为原料发酵木霉菌的生产工艺，属于微生物技术领域。生产工艺包括：（1）对桔皮进行干燥、粉碎、筛分预处理；（2）将经过预处理的桔皮粉与麸皮和去离子水按一定比例混合，高压蒸汽灭菌；（3）在灭菌后的物料上接种木霉进行固态发酵；（4）固体发酵产物经干燥处理后即得木霉制剂产品。该工艺生产的木霉菌剂具有促进植物生长，诱导植物产生抗逆境抗病害的能力，可用于防治土传病害和促进污染土壤的植物修复；同时也为桔皮的资源化利用提供了一条新途径。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用桔皮固态发酵生产木霉菌剂的方法。
背景技术
木霉菌（Trichoderma spp）在自然界中分布广泛，生物量大，环境适应性强，是一种历史悠久的生防真菌，目前国际上已开发注册的木霉菌剂产品有50多种，大多数都可以用来防治作物土传病害和促进植物生长。近年来，亦有研究表明木霉菌具有吸附重金属的功能，其逐渐被应用于污染土壤的植物-微生物联合修复技术中。由于木霉是活菌制剂，主要通过孢子来实现其生物活性，因此选择廉价且产孢量高的发酵基质，优化人工发酵工艺，对于降低该活菌制剂的生产成本，推广该制剂的田间应用具有重要的意义。
我国是柑橘生产大国, 每年都会产生大量的副产物-柑橘皮。柑橘皮富含果胶、纤维素、可溶性糖及多种矿物质元素, 是一种良好的微生物生长基质。过去这种富有营养的物质被丢弃，不但大量浪费资源，而且污染环境。目前，对柑橘皮的研究主要集中在两个方面：一方面是内含成分的提取, 包括果胶、香精油、橙皮苷、黄酮类、色素等物质的提取利用；另一方面是微生物发酵，主要以柑橘皮为营养物质发酵生产饲料和酶制剂，而以桔皮作为培养基来生产木霉菌剂的方法还未见报道。鉴此，本专利以里氏木霉FS10-C为出发菌株，以桔皮为主要原料进行固态发酵制备木霉菌剂，不仅可以降低制剂的生产成本，而且还可有效解决了桔皮的资源化利用问题。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种利用桔皮固态发酵生产木霉菌剂的方法，该方法不仅可以降低制剂的生产成本，而且还可有效解决了桔皮的资源化利用问题。此外，通过本方法制得的木霉菌剂可用于防治土传病害和促进污染土壤的植物修复中。
技术方案：以桔皮为原料发酵木霉菌的生产工艺，工艺步骤如下：
（1）桔皮的预处理
将收集的桔皮烘干粉碎过筛后，选择粒径0.84 mm的桔皮粉用于后续工艺;
（2）物料灭菌
原料：桔皮粉50～65质量份，麦麸35～50质量份；加水，原料:水=1:0.8～1:1.2（重量比）；将混合料采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌处理：温度121℃，时间30～50分钟;
（3）发酵
将灭菌处理后的混合料进行发酵，木霉菌接种量为原料重量的5%～10%，温度为28℃，发酵周期为8～10天，从第4天起隔天搅拌一次，混匀;
（4）后处理
将长满分生孢子的木霉菌固体发酵培养物真空冷冻干燥，包装。
发酵时所采用的里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年07月01日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3970。
有益效果 （1）木霉菌剂制备方法简单，产孢量大：以桔皮为主要原料，加入一定量的麦麸作为辅料即得到混合培养基，不需要额外添加营养物质即可实现木霉菌的高密度培养，制剂含孢量大于1010个/克，达到目前木霉菌固体发酵的平均水平（1×1010个/克）；（2）桔皮麦麸作为有机质与木霉孢子混合添加入土壤，一方面可以为孢子的萌发提供营养，另一方面可以减轻土壤对孢子的抑制作用，同时增加土壤肥力；（3）采用本发明所述方法，能提高农业废弃物桔皮和麦麸的利用率，变废为宝。
具体实施方式
以下结合实例对本发明作进一步的描述，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：桔皮麦麸组合对里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C生长的促进作用
1.1 试验设计
（1）孢子悬液的制备：取培养好的里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C种子斜面，加5mL无菌水，振荡，将孢子洗脱到无菌三角瓶中，稀释至孢子浓度为106个孢子/mL待用。
（2）固态发酵：将桔皮70℃条件下烘干，粉碎过0.84mm筛；分别取桔皮粉100份；桔皮粉50份、麦麸50份；麦麸100份，按料水重量比1:1添加去离子水调，分装到15cm培养皿中，每个培养皿中约60g，3次重复， 121℃灭菌30分钟，冷却至室温；按5%wt的比例接种里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C孢子悬液，混匀置于28℃恒温培养箱中静止培养，定时搅拌。
（3）产孢量测定：发酵结束后，准确称取1.0g固体培养物, 定量稀释, 振荡混匀后, 用血球计数板计数, 3个重复。用常压干燥法测定发酵产物的含水量W, 计算孢子产量[ 个/(克] 。
1.2 结果与分析
表1 桔皮麦麸组合对里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C生长的促进作用
| 培养基 | 生长现象 | 产孢量/（×109个/克） |
| 单一桔皮 | 菌丝生长缓慢，致密，孢子形成晚，量大 | 4.55 |
| 单一麦麸 | 菌丝生长旺盛、整齐，孢子形成早，量极少 | 0.31 |
| 桔皮麦麸混合物 | 菌丝生长旺盛，产孢速度快且量大 | 9.47 |
由表1可知，里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C菌株在单一桔皮培养基上虽然产孢量可关，但存在着菌丝生长缓慢，发酵周期过长等问题；在单一麦麸上存在着菌丝生长过旺，第7天菌体就开始发生自溶现象，产孢量极低等问题；桔皮和麦麸的混合培养基则表现出了较好的协同作用，利于木霉菌快速生长的同时能促进产孢，产孢量是单一桔皮的2.08倍。
实施例2：木霉固体发酵条件的优化
2.1 试验设计
（1）孢子悬液的制备：取培养好里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C的种子斜面，加5mL无菌水，振荡，将孢子洗脱到无菌三角瓶中，稀释至孢子浓度为106个孢子/mL待用。
（2）固态发酵：将桔皮70℃条件下烘干，粉碎过0.84mm筛；选择基质配比、接种量、含水量和培养时间4个因素，分别取3个水平，以 L9( 34) 正交表进行正交试验，重复3次，接种里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C孢子悬液，混匀置于28℃恒温培养箱中静止培养，定时搅拌。
（3）产孢量测定：发酵结束后，准确称取1.0g固体培养物, 定量稀释, 振荡混匀后, 用血球计数板计数, 3个重复。用常压干燥法测定发酵产物的含水量W, 计算孢子产量【个/(克)】 。 2.2 结果与分析
表2 正交试验结果和极差分析
（注：K：各因素不同水平的平均含孢量；R：因素不同水平平均含孢量的最大值与最小值之差）
极差分析结果表明，各因素对产孢量的影响依次为：基质配比> 固水比> 培养时间> 接种量，即原料基质配比的影响最大，极差达到10.31，桔皮与麦麸的质量比为1:1时产孢量高于其他两种比例；不同水平的料水比对发酵后的分生孢子产量也有一定的影响，料水比为1:1.2时的孢子浓度高于1:0.8和1：1，低、中水平的含水量发酵后的产孢量之间差异不大；不同水平的培养时间，后一时间段测定的产孢量都高于前一次的产孢量；接种量对固体发酵的影响不大，各水平之间平均值较为接近，极差仅为1.46。因此最优工艺条件为A3B1C3D2 ，即桔皮与麦麸的质量比为1:1，固料与水的比例为1:1.2，接种量为5%，培养14天时里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C的产孢量最高，达到2.43×1010个/克，确定此为最佳培养基组合。在实际生产过程中，考虑到原材料价格，发酵周期等因素，桔皮的添加比例可以适当提高，达到65%，而发酵时间可以缩短为10天，同样能生产出适宜田间施用的菌剂。
实施例3：发酵罐放大培养生产木霉菌剂
具体步骤如下：
（1）孢子悬液的制备：取培养好的里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C种子斜面，加5 mL无菌水，振荡，将孢子洗脱到无菌三角瓶中，稀释至孢子浓度为106个孢子/mL待用。
（2）液体种子的制备：称取马铃薯200g切块煮沸过滤得土豆汁，加入20g葡萄糖，加水补足1000mL，装瓶灭菌，冷却后按2%wt比例接种上述孢子悬液，28℃，150转/分钟培养3天，即得液体种子。
（3）固态发酵：将桔皮70℃条件下烘干，粉碎过0.84mm筛；取桔皮粉50份，麦麸50份，按料水重量比1:0.8添加去离子水调和，充分混匀后，装于50L转轴式固体发酵罐中，121℃灭菌50分钟，冷却至室温，按5%wt的比例接种里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C液体种子，搅拌混匀后设置培养温度为28℃，通入无菌空气，空气流量为25 NL/分钟，静止培养，定时搅拌。
（4）后处理：发酵10天后放罐，将长满分生孢子的木霉菌固体发酵培养物真空冷冻干燥，包装。产品的孢子含量可以达到1.44×1010个孢子/克。
Claims (1)
1.以桔皮为原料发酵木霉菌的生产工艺，其特征在于工艺步骤如下：
（1）桔皮的预处理
将收集的桔皮烘干粉碎过筛后，选择粒径0.84 mm的桔皮粉用于后续工艺；
（2）物料灭菌
原料：桔皮粉50～65质量份，麦麸35～50质量份；加水，原料:水=1:0.8～1:1.2（重量比）；将混合料采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌处理：温度121℃，时间30～50分钟；
（3）发酵
将灭菌处理后的混合料进行发酵，木霉菌接种量为原料重量的5%～10%，温度为28℃，发酵周期为8～10天，从第4天起隔天搅拌一次，混匀；发酵时所采用的里氏木霉（Trichoderma ressei）FS10-C，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年07月01日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3970；
（4）后处理
将长满分生孢子的木霉菌固体发酵培养物真空冷冻干燥，包装。
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