CN106244465B - 采用固体发酵生产木霉sqr-t037的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种采用固体发酵生产木霉SQR‑T037的方法，包括木霉SQR‑T037菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备及固体发酵步骤。所述固体发酵使用的固体发酵培养基主要以橘子皮或橙子皮为基质，添加适宜的营养物质组成。本发明操作简单，生产的木霉SQR‑T037活菌数高，最高可达到6.5×109cfu/g。在条件简陋的情况下仍可以进行大规模生产，为功能菌的广泛使用提供了技术支持，同时还有效利用了罐头厂废弃物，防止了橘子皮或橙子皮对环境的污染。

Description

采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法。
背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)属真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落。杨合同、胡琼、张旭东等人的研究表明，木霉不仅对植物病原菌有拮抗效应，而且促进植物的生长。木霉作为植物根际促生菌的一种，能有效促进植物的生长，同时有着使用安全、持续效果好、增产稳定、不污染环境等特点，因此值得广泛的推广使用。
本发明所用菌株为专利CN102531712A《利用醋糟生产的防病育苗基质及其生产方法》中涉及到的木霉，保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3308。木霉SQR-T037是科学家从自然界筛出来的一种生防效果俱佳的菌株，研究表明其对茄子苗期有显著的促生效应。在黄瓜的种植应用中，用SQR-T037二次发酵的生物肥配施75%的化肥与100%化肥处理产量相当，相比普通的生物有机肥则产量提高19.3%。因此，木霉SQR-T037值得商品化生产，然而目前尚未见到木霉SQR-T037固体发酵的相关文献见诸刊物，目前只有液体发酵的方法发表，如CN102531712A专利采用液体发酵，木霉含量为1×109个/mL活菌。本发明利用SQR-T037进行固体发酵，发酵出高含量的产品，为木霉SQR-T037的商品化运作提供技术支持。
发明内容
正是基于以上一个或多个问题，本发明提供一种固体发酵生产木霉SQR-T037的方法，用以解决现有技术中存在的木霉SQR-T037生产方法较单一且生产的木霉SQR-T037的活菌数不高等技术问题。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供的固体发酵生产木霉SQR-T037的方法，包括以下步骤：木霉SQR-T037菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备及固体发酵；
所述固体发酵方法为：将二级液体种子液按5%-12%的接种量接种至固体发酵培养基中；搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3L/min，培养6-9天后，待橘子皮或橙子皮上的菌苔90%以上变绿后出箱；优选地，待橘子皮或橙子皮上的菌苔全部变绿后出箱。
优选地，所述二级液体种子液以喷洒或倾倒的方式均匀接种至所述的固体发酵培养基中。
所述一级液体种子液的制备方法为：将活化后的木霉SQR-T037以3%的接种量接种至盛有200ml马铃薯培养基的500ml三角瓶中，于28℃，120r/min条件下，置于全温恒温摇床上发酵培养2天，即得一级液体种子液。
所述二级液体种子液的制备方法为：将所述一级液体种子液以3%的接种量接种至液体发酵培养基中，于发酵罐中，28℃，180r/min，通气量2.5 L/min条件下，发酵培养3天，即得二级液体种子液；其中，所述液体发酵培养基中各成分的质量百分数为：麸皮1.2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1.5%，余量为水。
其中，固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基是按如下方法制备的：将橘子皮或橙子皮用营养液浸泡（浸泡的目的是使营养液中的营养成分很好的与橘子皮或橙子皮结合，从而在之后的固体发酵步骤中提供无机盐离子、无机碳源、氮源给木霉SQR-T037利用)，侵泡2-4小时后将所述橘子皮或所述橙子皮捞出装袋，然后再将袋装后的所述橘子皮或所述橙子皮在121℃温度下高压灭菌20-30分钟（优选为121℃温度下高压灭菌30分钟），冷却后即得固体发酵培养基；其中，所述营养液的各成分的质量百分数为：葡萄糖0.5%-2%、氯化铵0.5%-2%、磷酸氢二钾0.5%-2%、磷酸氢二钠0.2%-1.5%、硫酸镁0.05%-1%,余量为水；所述营养液pH自然；优选地，所述橘子皮或所述橙子皮被所述营养液浸没，浸没有利于橘子皮或橙子皮吸收营养液的营养成分吸收地更加充分。
优选地，所述固体发酵培养基的制备方法为：将橘子皮或橙子皮用营养液浸泡，侵泡2-4小时后将所述橘子皮或所述橙子皮捞出装袋，然后再将袋装后的所述橘子皮或所述橙子皮在121℃温度下高压灭菌20-30分钟（优选为121℃灭菌30分钟），冷却后即得固体发酵培养基；其中，所述营养液中的各成分的质量百分数为：葡萄糖0.8%-1.5%、氯化铵1%-1.8%、磷酸氢二钾0.8%-1.2%、磷酸氢二钠0.8%-1.5%、硫酸镁0.2%-0.8%，余量为水；所述营养液pH自然。优选地，所述橘子皮或所述橙子皮被所述营养液浸没。
更优选地，所述固体发酵培养基的制备方法为：将橘子皮或橙子皮用营养液浸泡，侵泡2-4小时后将所述橘子皮或所述橙子皮捞出装袋，然后再将袋装后的所述橘子皮或所述橙子皮在121℃温度下高压灭菌20-30分钟（优选为121℃灭菌30分钟），冷却后即得固体发酵培养基；其中，所述营养液中的各成分的质量百分数为：葡萄糖1%、氯化铵1.5%、磷酸氢二钾1%、磷酸氢二钠1.2%、硫酸镁0.5%，余量为水；所述营养液pH自然。优选地，所述橘子皮或所述橙子皮被所述营养液浸没。
本发明还提供了一种制备木霉SQR-T037孢子粉的方法，按照上述固体发酵生产木霉SQR-T037的方法，固体发酵培养结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉。
本发明提供了一种采用固体发酵生产功能菌木霉SQR-T037的方法，包括木霉SQR-T037菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备及固体发酵步骤。所述固体发酵使用的固体发酵培养基主要以橘子皮或橙子皮为基质，添加适宜的营养物质组成。运用本发明的方法生产的木霉SQR-T037基质孢子粉，含量最高可达6.5×109cfu/g，发酵含量高，能规模化生产，为该生防菌的大面积推广提供了产能保障。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，若用原料均为市售商品。
本实验所用橘子皮和橙子皮从罐头厂购入，为新鲜果皮。如需大量生产可从罐头厂或者橘子生产地购入橘子皮或橙子皮。
本发明涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
实施例1 采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
1.木霉SQR-T037菌种的活化
将木霉SQR-T037菌种接至PDA斜面培养3-8天。
2.一级液体种子液的制备
将活化后的木霉SQR-T037以3%的接种量接种至盛有200ml马铃薯培养基的500ml三角瓶中，于28℃，120r/min条件下，置于全温恒温摇床发酵培养2天，即得一级液体种子液。
3.二级液体种子液的制备
将一级液体种子液以3%的接种量接种至液体发酵培养基中，于发酵罐中，28℃，180r/min，通气量2.5 L/min条件下，发酵培养3天，即得二级液体种子液；其中，所述液体发酵培养基中各成分的质量百分数为：麸皮1.2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1.5%，余量为水。
4.固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制方法为：先按如下所示配比配制营养液60kg：葡萄糖1%、氯化铵1.5%、磷酸氢二钾1%、磷酸氢二钠1.2%、硫酸镁0.5%、余量为水；所述营养液pH自然；将橘子皮100kg侵入到配制的营养液中，橘子皮被营养液浸没，浸泡3h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的橘子皮于121℃温度下高压灭菌30分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟处理），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按5%的接种量，以均匀喷洒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养8天后，待橘子皮的菌苔全部变绿后出箱。
5.后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为6.5×109cfu/g。检测方法为涂布法，检测培养基为PDA培养基。
实施例2采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
步骤1-3同实施例1。
步骤4：固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制方法为：先按如下所示配比配制营养液50Kg：葡萄糖0.5%、氯化铵0.5%、磷酸氢二钾0.5%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.05%、余量为水；将橘子皮100kg浸入到配制的营养液中，浸泡3h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的橘子皮于121℃温度下高压灭菌30分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟处理），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按10%的接种量，以均匀喷洒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养6天后，待橘子皮的菌苔全部变绿后出箱。
步骤5：后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为4.8×109cfu/g。检测方法为涂布法，检测培养基为PDA培养基。
实施例3采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
步骤1-3同实施例1。
步骤4：固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制方法为：先按如下所示配比配制营养液60Kg：葡萄糖1%、氯化铵1.5%、磷酸氢二钾1%、磷酸氢二钠1.2%、硫酸镁0.5%、余量为水；将橙子皮100kg浸入到配制的营养液中，橙子皮被营养液浸没，浸泡3h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的橙子皮于121℃温度下高压灭菌30分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟处理），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按12%的接种量，以均匀喷洒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养6天后，待橘子皮的菌苔全部变绿后出箱。
步骤5.后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为6.0×109cfu/g。检测方法为涂布法，检培养基为PDA培养基。
实施例4采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
步骤1-3同实施例1。
步骤4：固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制：先按如下所示配比配制营养液60Kg：葡萄糖2%、氯化铵1.5%、磷酸氢二钾1%、磷酸氢二钠1.2%、硫酸镁0.5%、余量为水；将橘子皮100kg浸入到配制的营养液中，橘子皮被营养液浸没，浸泡2.5h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的橘子皮于121℃温度下高压灭菌30分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按10%的接种量，以均匀喷洒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养7天后，待橘子皮的菌苔全部变绿后出箱。
步骤5：后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为5.8×109cfu/g。，检测方法为涂布法，检测培养基为PDA培养基。
实施例5采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
步骤1-3同实施例1。
步骤4：固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制：先按如下所示配比配制营养液60kg：葡萄糖1.5%、氯化铵1.8%、磷酸氢二钾1.2%、磷酸氢二钠1.5%、硫酸镁0.8%、余量为水；将橙子皮100kg浸入到配制的营养液中，橘子皮被营养液浸没，浸泡2h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的橘子皮于121℃温度下高压灭菌20分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按8%的接种量，以均匀倾倒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养9天后，待橘子皮的菌苔全部变绿后出箱。
步骤5：后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为5.6×109cfu/g。，检测方法为涂布法，检测培养基为PDA培养基。
实施例6采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
步骤1-3同实施例1。
步骤4：固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制：先按如下所示配比配制营养液60kg：葡萄糖0.8%、氯化铵1 %、磷酸氢二钾0.8%、磷酸氢二钠0.8%、硫酸镁0.2%、余量为水；将橘子皮100kg浸入到配制的营养液中，橘子皮被营养液浸没，浸泡4h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的于121℃温度下高压灭菌25分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按11%的接种量，以均匀喷洒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养6天后，待橘子皮的菌苔90%以上变绿后出箱。
步骤5：后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为5.0×109cfu/g。，检测方法为涂布法，检测培养基为PDA培养基。
实施例7采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法
包括以下步骤：
步骤1-3同实施例1。
步骤4：固体发酵
（1）固体发酵步骤中使用的固体发酵培养基的配制：先按如下所示配比配制营养液60kg：葡萄糖2%、氯化铵2 %、磷酸氢二钾2%、磷酸氢二钠1.5%、硫酸镁1%、余量为水；将橘子皮100kg浸入到配制的营养液中，橘子皮被营养液浸没，浸泡2.5h后将橘子皮捞出装袋，将袋装的橘子皮于121℃温度下高压灭菌30分钟，冷却备用。
（2）固体发酵：将所制备的固体发酵培养基倒入已灭菌的不锈钢浅盘里（不锈钢浅盘经121℃灭菌30分钟），1Kg/盘；然后将二级液体种子液按6%的接种量，以均匀喷洒的方式接种至上述固体发酵培养基中；用经过灭菌处理的铲子将种子液和固体发酵培养基搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养7天后，待橘子皮的菌苔全部变绿后出箱。
步骤5：后处理
固体发酵结束后，将发酵基质于30℃烘干，干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉，检测其含量为5.4×109cfu/g。检测方法为涂布法，检测培养基为PDA培养基。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法，其特征在于，包括以下步骤：木霉SQR-T037菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备及固体发酵；
其中，在固体发酵步骤中，所使用的固体发酵培养基的制备方法为：将橘子皮或橙子皮用营养液浸泡，浸泡2-4小时后将所述橘子皮或所述橙子皮捞出装袋，然后再将装袋后的所述橘子皮或所述橙子皮在121℃温度下高压灭菌20-30分钟，冷却后即得固体发酵培养基；其中，所述营养液的各成分的质量百分数为：葡萄糖0.5％-2％、氯化铵0.5％-2％、磷酸氢二钾0.5％-2％、磷酸氢二钠0.2％-1.5％、硫酸镁0.05％-1％，余量为水；
所述一级液体种子液的制备方法为：将活化后的木霉SQR-T037以3％的接种量接种至盛有200mL马铃薯培养基的500mL三角瓶中，于28℃，120r/min条件下，置于全温恒温摇床上发酵培养2天，即得一级液体种子液；
所述二级液体种子液的制备方法为：将所述一级液体种子液以3％的接种量接种至液体发酵培养基中，于发酵罐中，28℃，180r/min，通气量2.5 L/min条件下，发酵培养3天，即得二级液体种子液；其中，所述液体发酵培养基中各成分的质量百分数为：麸皮1.2％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾1.5％，余量为水；
所述固体发酵的方法为：将所述二级液体种子液按5％-12％的接种量接种所述的固体发酵培养基中；搅拌均匀后放入固体发酵培养箱中培养，培养温度为28℃，通入无菌空气，通气量为3 L/min，培养6-9天后，待橘子皮或橙子皮上的菌苔90％以上变绿后出箱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述二级液体种子液以喷洒或倾倒的方式均匀接种至所述的固体发酵培养基中。
3.一种木霉SQR-T037孢子粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用固体发酵生成木霉SQR-T037；
固体发酵培养结束后，将发酵基质干燥后粉碎，即得木霉SQR-T037孢子粉；其中，所述采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法为权利要求1-2任一项所述的采用固体发酵生产木霉SQR-T037的方法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵基质干燥的温度为30℃。
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