CN108265009B - 一种用于培养布氏白僵菌的培养基及其培养方法 - Google Patents

一种用于培养布氏白僵菌的培养基及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布氏白僵菌培养基及培养方法，该培养基提高布氏白僵菌产孢量及其对昆虫的毒力，所述培养基的组分及组分含量如下：花生壳+米粉+麦麸+土元蜕，质量比为：1～5∶0.5～1.5∶2～6∶1～3；培养方法包括：1)布氏白僵菌固相发酵培养基种子液的制备，2)固相发酵培养，及3)接种与培养；本发明所采用的培养基，可降低培养成本，又能增加孢子产量，缩短生产周期，且能够提高孢子对昆虫的毒力。

Description

一种用于培养布氏白僵菌的培养基及其培养方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体是指一种用于培养布氏白僵菌的培 养基及其培养方法。
背景技术
布氏白僵菌又名卵胞白僵菌，是一种重要的昆虫病原真菌，能够寄生7 目70多种昆虫。多年来，我国用布氏白僵菌防治农林重要昆虫如马尾松松毛 虫、象甲、天牛等，已获得较好的技术效果。有研究表明，在田间每平方米土 壤以1010孢子处理，能造成次年害虫流行病，而且真菌在虫尸和土壤中的宿存 保证了对下一代害虫的侵染，从而维持其在田间的特效性，因而布氏白僵杀虫 剂是目前防治地下害虫、发展无公害生产的首选生物药剂，在防治林业害虫方 面，布氏白僵菌粉剂，已被大面积推广使用。真菌的大量培养生产是满足田间 应用的前提，但迄今仍无成熟的白僵菌杀虫剂产品，也缺乏高技术的工业化生 产。
基于此，研究并设计了一种利于提高布氏白僵菌产孢量及毒力的培养基及 培养方法。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种利于提高布氏白僵菌产孢量及毒力的培养基 及培养方法，该培养基为布氏白僵菌菌株的生长和分生孢子的生产提供了良 好的营养和空间环境。
本发明通过下述技术方案实现：一株布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)HFBbr001，2017年9月8日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.14157。
一种用于培养布氏白僵菌的培养基，其特征在于，所述培养基的组分及组 分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：1～5∶0.5～1.5∶2～6∶1～3。
进一步地，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦 麸，质量比为：3∶1.5∶4∶3。
更进一步地，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+ 麦麸，质量比为：3∶1∶4∶2。
本发明还提供了一种用于培养布氏白僵菌的培养基的培养方法，其特征在 于：包括如下步骤：1)布氏白僵菌固相发酵培养基种子液的制备
采用SDY+2％麦芽糖培养基制备布氏白僵菌固相发酵培养基种子液；方 法为在超净工作台上用无菌接菌针将活化后的布氏白僵菌孢子均匀接种于 500mL锥形瓶中含SDY+2％麦芽糖培养基液体培养基中，置于恒温摇床内， 条件为温度25±1℃，170rpm培养96h，待培养基变为粘稠状和锥形瓶瓶壁出 现白色黏状物，即为获得布氏白僵菌固相发酵培养基种子液。
2)固相发酵培养
用电子天平称取每处理固体培养基基本组分中花生壳、虫蜕、米粉、麦麸 和麦芽糖质量，先将米粉溶于水制成均匀米粉溶液，然后将虫蜕和麦麸先后溶 于米粉水溶液，再将其与用水浸泡后的花生壳混合，使其制成的溶液恰好在花 生壳表面均匀分布，并置于直径等于40cm铁盆中，同时用纱布封口，然后放 在灭菌锅中121℃高压灭菌20min。
3)接种与培养
将种子培养液分别均匀接种于各处理固相培养基中，接种量为固相培养基 质量的10％菌悬液；培养基置于灭过菌的有网眼的不锈钢托盘中并置于恒温恒 湿光照智能霉菌培养箱中固相发酵，培养基初始含水率为80±5％，25±1℃、 95％RH条件下培养10d，前3d无光黑暗处理，从第4d开始在光照强度 3000LX和光周期10:14h光照:黑暗条件下培养至第10d。
进一步地，所述SDY组成为葡萄糖4％、蛋白胨1％、酵母粉1％。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)本发明通过设置固体培养基，在大米中加入花生壳作载体，花生壳能 增加透气性，提高大米的营养率，增加菌物生长所需的微量元素，并添加土元 蜕，为菌株的生长和分孢子的生产提供了良好的营养和空间环境，提高了产孢 量，缩短生产周期。
(2)本发明的固体培养基产出的孢子对昆虫的毒力提高，为进一步降低真 菌杀虫剂生产总成本提供一种新的途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限 于此。
实施例1：固相培养基组分为大米的制备方法
1)布氏白僵菌固相发酵培养基种子液的制备。
采用SDY+2％麦芽糖培养基制备布氏白僵菌固相发酵培养基种子液；方 法为在超净工作台上用无菌接菌针将活化后的布氏白僵菌孢子均匀接种于 500mL锥形瓶中含SDY+2％麦芽糖培养基液体培养基中，置于恒温摇床内， 条件为温度25±1℃，170rpm培养96h，待培养基变为粘稠状和锥形瓶瓶壁出 现白色黏状物，即为获得布氏白僵菌固相发酵培养基种子液。
2)固相发酵培养
用电子天平准确称取市场购买的廉价大米1000g，并置于直径等于40cm 铁盆中，同时向铁盆中加适量水并用纱布封口，然后放在灭菌锅中121℃高压 灭菌20min，冷却后作为待用固相培养基。
3)接种与培养
将种子培养液分别均匀接种于各处理固相培养基中，接种量为固相培养基 质量的10％菌悬液；培养基置于灭过菌的有网眼的不锈钢托盘中并置于恒温恒 湿光照智能霉菌培养箱中固相发酵，培养基初始含水率为80±5％，25±1℃、 95％RH条件下培养10d，前3d无光黑暗处理，从第4d开始在光照强度 3000LX和光周期10:14h光照:黑暗条件下培养至第10d。
实施例2：固相培养基组分为米粉+花生壳质量比为1：1的制备方法
与实施例1制备方法相同，步骤2)固相发酵培养为：用电子天平准确称 取市场购买的廉价大米和花生壳各500g，用小型粉碎机将大米粉碎成米粉， 将花生粉碎成近片状。将粉碎的米粉溶于水制成均匀米粉溶液并将其均匀分布 在用水浸泡过的花生壳上，并置于直径等于40cm铁盆中，同时用纱布封口， 然后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20min，冷却后作为待用固相培养基。
实施例3：固相培养基组分为米粉+花生壳质量比为2:3的制备方法
分别应用电子天平准确称取市场购买的廉价大米400g和花生壳600g，应 用实例2方法制备米粉和花生壳均匀混合物，灭菌冷却后作为待用固相培养 基。
实施例4：固相培养基组分为米粉+花生壳+麦麸质量比为3∶4∶3的的制备方 法
分别应用电子天平准确称取市场购买的廉价大米300g、花生壳400g和麦 麸300g，应用实例2方法制备米粉、花生壳和麦麸均匀混合物，灭菌冷却后 作为待用固相培养基。
实施例5：
与实施例1制备方法相同，步骤2)固相发酵培养为：用电子天平准确称 取每处理固体培养基基本组分中米粉、土元蜕、花生壳、麦麸质量分别为300g、 100g、400g、200g，先将米粉溶于水制成均匀米粉溶液，然后将虫蜕和麦麸先 后溶于米粉水溶液，再将其与用水浸泡后的花生壳混合，使其制成的溶液恰好 在花生壳表面均匀分布，并置于直径等于40cm铁盆中，同时用纱布封口，然 后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20min。
测定1：产孢量检测
待布氏白僵菌菌丝在各处理固相培养基上充分产孢后，将各处理置于无菌 低温电热干燥箱(型号：YB1450)中25±1℃、干燥48h。用取样器(直径： D＝20mm、高：H＝40mm)从培养基质中随机多点取样，均匀混合后从中称 取1g，置于250ml锥形瓶中，加100ml 0.02％吐温-80无菌水溶液和若干玻 璃珠，用SK-1型快速混匀器振荡15min，将得到的孢子液过滤稀释后，用血 球计数板(型号：16格×25格)在显微镜(型号：CKX31)下显微计数，重 复3次，取平均值。同时取样用烘干法测定基质含水量，以每克干基质的孢子 含量作为产孢量。
布氏白僵菌孢子数/ml＝100小格内孢子个数/100×400×104×稀释倍数
表1布氏白僵菌在不同配方固相培养基上的产孢量
Figure BDA0001591490900000051
Figure BDA0001591490900000061
筛选的5个布氏白僵菌固相培养基配方以花生壳+米粉+麦麸+土元蜕组合 在相同培养条件下的产孢量最高。当布氏白僵菌固相培养基以花生壳和米粉为 主料时，在其中加入麦麸，产孢量明显提高，表明布氏白僵菌在固相发酵时需 要多种营养成分。当以布氏白僵菌固相培养基以花生壳、米粉和麦麸为主料时， 在其中加入土元蜕，产孢量进一步提高。
测定2：不同固相培养基配方培养的孢子对蛴螬的毒力
采用浸渍法测定不同菌种(菌株)对蛴螬的毒力。用无菌镊子将饲养好的 3龄蛴螬置于制备好的各个固相培养基配方培养的孢子浓度1.0×108个孢子/ml 菌悬液和对照0.02％的吐温-80无菌水溶液中10s，并在滤纸上晾干后置于含 200g无菌土(湿度大于80％)的透明一次性杯中，每个杯中1头，每个杯中 放置一株发芽的花生作为饲料。每处理10头3龄蛴螬(由安徽省庐江县植保 站提供，种类为暗黑鳃金龟幼虫)，重复3次。各个处理均置于恒温恒湿培养 箱中(温度：25±1℃，湿度：大于80％)。处理2d后每隔1d观察记录各个 处理蛴螬累计死亡数和僵虫数。
表2不同固相培养基配方培养的孢子对蛴螬的毒力
Figure BDA0001591490900000062
不同固相培养基配方培养的孢子对蛴螬的毒力结果表明，处理后15d后， 以米粉+土元蜕+花生壳+麦麸作为布氏白僵菌固相培养基产出的孢子对蛴螬 的毒力最高，其累积校正死亡率达81.6，LT50最小为4.9d。
测定3：进一步对米粉+土元蜕+花生壳+麦麸的配方进行优化
表3.各组配方的产孢量和孢子对蛴螬的毒力
Figure BDA0001591490900000071
以米粉、土元蜕、花生壳和麦麸为培养基组成成分，研究出布氏白僵菌固 相发酵最佳配方。布氏白僵菌发酵最佳配方组合为：300g米粉、150g土元 蜕、400g花生壳、300g麦麸。在此最佳组合为固相培养基的条件下得到产 孢量为21.96×109个/g，对昆虫毒力最高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制， 凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均 落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于培养布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）的培养基，其特征在于，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：1~5∶0.5~1.5∶2~6∶1~3。
2.根据权利要求1所述的用于培养布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）的培养基，其特征在于，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：3∶1.5∶4∶3。
3.根据权利要求1所述的用于培养布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）的培养基，其特征在于，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：3∶1∶4∶2。
4.一种用于培养布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）布氏白僵菌固相发酵培养基种子液的制备
采用SDY+2%麦芽糖培养基制备布氏白僵菌固相发酵培养基种子液；方法为在超净工作台上用无菌接菌针将活化后的布氏白僵菌孢子均匀接种于500 mL锥形瓶中含SDY+2%麦芽糖培养基液体培养基中，置于恒温摇床内，条件为温度25±1℃，170 rpm培养96 h，待培养基变为粘稠状和锥形瓶瓶壁出现白色黏状物，即为获得布氏白僵菌固相发酵培养基种子液；
2）固相发酵培养基制备
用电子天平称取每处理固体培养基基本组分中花生壳、土元蜕、米粉、麦麸质量，先将米粉溶于水制成均匀米粉溶液，然后将土元蜕和麦麸先后溶于米粉水溶液，再将其与用水浸泡后的花生壳混合，使其制成的溶液恰好在花生壳表面均匀分布，并置于直径等于40 cm铁盆中，同时用纱布封口，然后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20 min；
3）接种与培养
将种子培养液分别均匀接种于各处理固相培养基中，接种量为固相培养基质量的10%；培养基置于灭过菌的有网眼的不锈钢托盘中并置于恒温恒湿光照智能霉菌培养箱中固相发酵，培养基初始含水率为80±5%，25±1℃、95%RH条件下培养10d，前3 d无光黑暗处理，从第4d开始在光照强度3000LX和光周期10:14 h 光照:黑暗条件下培养至第10 d；
所述培养基中花生壳、土元蜕、米粉、麦麸的配比按照权利要求1-3中任一项培养基组分含量的比例。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述SDY组成为葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母粉1%。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述布氏白僵菌为布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）HFBbr001，2017年9月8日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.14157。
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