CN110819563B - 一株短波单孢杆菌3c及其在促进杏鲍菇生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株短波单孢杆菌3C及其在促进杏鲍菇生长中的应用，该短波单孢杆菌，分类命名为短波单孢菌(Brevundimonas sp.)3C，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏编号CCTCC No:M 2019637，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明经过原始菌种的活化、种子液的制备、发酵液的制备、添加载体，制得食用菌促生菌剂，将其应用于促进杏鲍菇的生长中，菌丝日生长量、菇体平均高度、出菇产量均有明显提高，增加了杏鲍菇生产的经济效益；同时由于促生细菌来源于食用菌根际细菌，借助其菌体或代谢产物增加食用菌产量，具有高效、安全、无毒的特点。

Description

一株短波单孢杆菌3C及其在促进杏鲍菇生长中的应用
技术领域
本发明涉及食用菌生物技术领域，具体涉及一株短波单孢杆菌3C及其在促进杏鲍菇生长中的应用。
背景技术
近几年我国食用菌产业发展迅速，同时随着人们食品安全意识和食品健康理念的增加，人们对食品的要求已经由“吃好”转变为“吃的健康”，进而“一荤一素一菇”的进食理念使得食用菌的需求量较以前有了明显的增加。
杏鲍菇(Pleurotus eryngii)，别名：刺芹侧耳。根据子实体形态特征，国内外的杏鲍菇菌株大致可分为五种类型：保龄球形、棍棒形、鼓槌状形、短柄形和菇盖灰黑色形。其中保龄球形和棍棒形在国内栽培中较为广泛。杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，特别是菌柄组织致密、结实、乳白，可全部食用，且菌柄比菌盖更脆滑、爽口，被称为"平菇王"、"干贝菇"，具有愉快的杏仁香味和如鲍鱼的口感，适合保鲜、加工，深得人们喜爱。杏鲍菇还具有降血脂、降胆固醇、促进胃肠消化、增强机体免疫能力、防止心血管病等功效，是开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。
随着市场需求的多样化和健康生活理念的普及，市场对杏鲍菇产量需求逐年增加。为了提高杏鲍菇的产量，农户一般会采取追肥、覆土或覆草木灰、使用生长调节剂、喷洒杀虫剂等通过化学试剂来增加产量的措施。然而传统的化学肥料促生方式，一方面促生效率低效果不够明显，另一方面污染大、不利于社会主义现代化美丽中国的建设，其次还存在农药残留现象不满足当代公民对绿色健康食品的准求，在此背景下，选择一种优化的食用菌促生方法和用高效环保的微生物制剂代替危害环境的化学试剂从而安全高效的提升食用菌的产量显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一株短波单孢杆菌3C，对杏鲍菇的生长发育具有促进作用；本发明所要解决的另一技术问题是提供一种杏鲍菇促生菌剂，以解决现有技术中化学肥料促生导致的农药残留，污染环境，不满足绿色环保的问题；本发明所要解决的另一技术问题是提供短波单孢杆菌3C在促进杏鲍菇生长中的应用，以解决现有技术中化学肥料促生效率低，效果不明显，不安全环保的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种短波单孢杆菌，其分类命名为短波单孢菌(Brevundimonas sp.)3C，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏编号CCTCC No:M 2019637，保藏地址：中国武汉武汉大学。
所述的短波单孢杆菌在促进食用菌生长中的应用。所述食用菌为杏鲍菇。
一种杏鲍菇促生菌剂，含有所述的短波单孢杆菌3C。
所述的杏鲍菇促生菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将短波单孢菌属3C菌株接种于NA培养基中，28℃培养3～4d，得到活化的菌株；
2)将步骤1)活化的菌株接种于种子扩大培养基中，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养18～24h，制得种子液；
3)将步骤2)制得的种子液按照体积百分比5～10％接种于发酵培养基中，在28～32℃、发酵罐的搅拌转速为150～200r/min、通气量为1:0.5-2vvm的条件下培养48～72h，制得发酵液；
4)通过细菌过滤膜过滤发酵液得到滤液。
发酵液中短波单孢杆菌的浓度为1.0～2.0×109cfu/mL。
所述种子扩大培养基的配方为：淀粉6～20g/L、K2HPO3 4～12g/L、硫酸铵2～5.5g/L、酵母膏0.5～5g/L、蔗糖4～10g/L、MgSO4 2～5g/L、CaCO3 2～5g/L、SiO2 2～10g/L、FeCl30.02～1g/L，pH 7.2～7.4。
所述发酵培养基的配方为：蔗糖2～5g/L、K2HPO3 2～5g/L、酵母膏1.2～5g/L、硫酸铵0.2～5g/L、大豆蛋白胨1.5～5g/L、MgSO4 0.4～5g/L，pH7.2～7.4。
所述的杏鲍菇促生菌剂在杏鲍菇促生中的应用。
所述的应用，将短波单孢菌属3C发酵液与栽培基质按重量比1.5～2:3混合均匀使用。
所述的应用，将短波单孢菌属3C发酵液过滤后，滤液与杏鲍菇栽培基质混合使用。
有益效果：与现有技术相比，本发明从子实体、菌袋、覆土栽培食用菌的土样中筛选分离并鉴定了一种促进杏鲍菇生长的细菌，经过原始菌种的活化、种子液的制备、发酵液的制备、添加载体，制得食用菌促生菌剂，将其应用于促进杏鲍菇的生长中，菌丝日生长量、菇体平均高度、出菇产量均有明显提高，能够有效缩短杏鲍菇的生产周期，增加了杏鲍菇生产的经济效益；同时由于促生细菌来源于食用菌根际细菌，借助其菌体或代谢产物增加食用菌产量，具有高效、安全、无毒的特点，对食用菌产业的优化升级和健康发展具有推动作用。
附图说明
图1是短波单孢菌3C细菌活体本身与杏鲍菇菌株在平板上共培养5d后的结果图；左图是细菌菌液组，右图是无菌水对照组；
图2是短波单孢菌3C细菌代谢物与杏鲍菇菌株在平板上共培养5d后的结果图；左图是细菌菌液过滤液组，右图是无菌水对照组；
图3是短波单胞杆菌3C的革兰氏染色镜检图；
图4是短波单胞杆菌3C对杏鲍菇子实体产量的影响图；
图5是短波单胞杆菌3C的系统进化树图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
1)样品采集与保存
于济宁市常生源菌业有限公司随机采集杏鲍菇的子实体、菌袋、覆土栽培食用菌的土样，采用无菌操作取样，取样后分别放入无菌袋，-20℃保存。
2)细菌的纯化与保存
准确称取待测土样1g，放入装有9mL无菌水的已灭过菌试管中，置摇床上28℃，170r/min，振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸菌液使其混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸均匀，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。
取10-4、10-5、10-6三个梯度涂布平板，用无菌吸管吸取1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的NA培养基上(每个编号设三个重复)。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌涂布棒，更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒置，28℃恒温培养24h。
通过梯度稀释法，从根际土样中共分离得到78个细菌分离物，将其分别挑至NA培养基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15-20g、水1000mL，pH7.2-7.4)上进行划线操作，置于28℃下培养3-4d。
3)增菌培养
将初筛分离纯化后保存的菌株接入NA液体培养基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000mL，pH7.2-7.4)的锥形瓶中，于28℃、180r/min摇床中培养48h，得到培养好的饱和细菌菌液；
4)促生细菌的筛选
a.细菌活体本身的促生功能
用移液枪按无菌操作要求将细菌菌液各取0.2mL于加富培养基(葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨10g、酵母膏3g、琼脂15-20g、水1000mL，pH7.0)中，用涂布棒均匀涂抹，用打孔器取1厘米杏鲍菇菌丝，放于涂好细菌的平板中央。对照组加入0.2mL的无菌水，接种后置于28℃培养箱培养，观察菌丝生长状况；培养5d时结果如图1所示。
b.细菌代谢物的促生功能
取培养好的细菌菌液20mL，通过细菌过滤膜(0.22μm)加入到无菌锥形瓶中，得到滤液，移液枪取0.2mL的菌悬液加入加富平板，用打孔器取杏鲍菇菌丝，放于涂好菌悬液的平板中央。对照组加入0.2mL的无菌水，接种后置于28℃培养箱培养，观察菌丝的生长状况，培养5d时结果如图2所示。
待菌丝生长良好后，与对照组作比较，取较对照组生长更为旺盛的菌即为有促生功能的细菌，对该菌株进行鉴定，包括菌落形态、生理生化性质以及16S rDNA序列进行扩增，获得序列如SEQ ID NO.1所示。菌落形态特征为：菌体短杆状，菌落椭圆形、表面光滑、不透明、颜色灰白色，无芽孢。菌株的生理生化特征如表1所示。
表1菌株的生理生化特征
项目 结果 项目 结果
革兰氏染色 - 蔗糖产酸 -
V.P.反应 - 果糖产酸 -
硝酸盐还原 - 柠檬酸盐 -
氧化酶反应 + 硫化氢产生 -
吲哚生成 - 甲基红实验 +
水解明胶 - 水解淀粉 -
将所测16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，该菌株与Brevundimonas sp.有较近亲缘关系。结合形态特征、生理生化性质及16S rDNA基因序列分析，鉴定为短波单胞菌(Brevundimonas sp.3C。该短波单胞杆菌3C对于杏鲍菇菌丝生长的影响如表2所示。
表2短波单胞杆菌3C对杏鲍菇菌丝生长的影响
菌丝生长情况 生长量(mm/d)
细菌菌液 浓密、较粗壮 5.62a
滤液 浓密，较粗壮 5.20a
对照组 稀疏、纤细 4.25b
实施例2
1)菌剂制备
将短波单胞杆菌的活化菌株接种于种子扩大培养基(淀粉6～20g/L、K2HPO3 4～12g/L、硫酸铵2～5.5g/L、酵母膏0.5～5g/L、蔗糖4～10g/L、MgSO42～5g/L、CaCO3 2～5g/L、SiO2 2～10g/L、FeCl3 0.02～1g/L，pH 7.2～7.4)中，在28～32℃、150～200r/min的条件下培养18～24h，制得种子液；
将制得的种子液接种于发酵培养基(蔗糖2～5g/L、K2HPO3 2～5g/L、酵母膏1.2～5g/L、硫酸铵0.2～5g/L、大豆蛋白胨1.5～5g/L、MgSO4 0.4～5g/L，pH7.2～7.4)中，接种量5～10％(体积百分比)，在28～32℃、控制发酵罐的搅拌转速为150～200r/min的条件下培养48～72h，控制通气量1:0.5-2vvm，即得发酵液。短波单胞杆菌在发酵液中的有效菌数在1.0×109cfu/mL～2.0×109cfu/mL。通过细菌过滤膜(0.22μm)过滤发酵液得到滤液。
固态促生菌剂的制备方法为：将上述发酵液与载体混匀，制备成固态促生菌剂，载体为玉米秸秆粉，发酵液与载体的重量比为1.5～2:3，玉米秸秆粉中含有可溶性碳、氮源等营养物质可被菌种分解，载菌效果好，活菌量高，原料的生产和采集环保无公害，制备的菌剂产品使用方便，载体基质施入菌袋或土壤中后可降解，不会对食用菌生长环境产生负面影响。
2)短波单孢杆菌在促进食用菌生长中的应用
采用的杏鲍菇来自于济宁市常生源菌业有限公司，并在食用菌基地日光温室中培养，进行产量对比试验。基地中温度适宜、水分含量适中，适合于正常的杏鲍菇生长。
采用23cm×36cm的聚乙烯袋栽培杏鲍菇。拌料时应将各种料混匀，每袋装料1.5kg，然后在袋的一头加套环再用塑料膜封口，高压灭菌2h，灭菌后待料温自然降至常温时，在菌袋开口后向菌袋施入该促生菌菌液(发酵液或滤液)，施入量为每千克培养料5mL，再接入杏鲍菇菌种，套上颈圈，接种量为每袋培养料重量的5％。对照组施入相同量的无菌水，每个处理6个重复。
所用的培养料成分为：木屑60％，玉米粉20％，麦麸15％，豆粉3％，石膏1％，石灰1％，，料水比1:1.3。
接种完毕后，将菌袋稀疏立式码放，以利通风。发菌期在智能温控的菇房中进行，菌丝生长温度为24～27℃，湿度65～70％，注意避光；子实体生长温度10～18℃，出菇阶段空气相对湿度85～95％。要常通风换气，保持空气新鲜，增加散射光照。发菌期间应每隔7～10天检查一次，发现有杂菌者应立即捡出，以防蔓延。按常规栽培方法进行出菇管理，当菌丝吃料定植后，沿菌丝生长点进行划线，10d后再划线，然后测量两条线之间的距离，计算日均生长速度，观察菌丝生长情况；待子实体长出后，记录菌丝萌发及子实体商品的性状，以及对应的出菇产量，具体见表3，表4所示。
表3短波单孢杆菌3C对杏鲍菇菌丝生长的影响
Figure BDA0002277876120000061
Figure BDA0002277876120000071
注：“+”越多表示菌丝生长越好。
表4短波单孢杆菌3C对杏鲍菇子实体生长及产量的影响
项目 发酵液 滤液 对照组
出菇整齐度 ++++ ++++ +++
子实体商品外观 ++++ ++++ +++
菇体平均高度/cm 14.1 13.8 11.8
出菇平均产量(g/袋) 477.5 473.9 450.6
注：“+”越多表示子实体生长越好。
结果表明，该菌株可有效促进杏鲍菇的生长，菌丝日生长量、菇体平均高度、出菇产量均有明显提高，能够有效缩短杏鲍菇的生产周期，增加了杏鲍菇生产的经济效益。
需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 曲阜师范大学
<120> 一株短波单孢杆菌3C及其在促进杏鲍菇生长中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> Brevundimonas sp.3C
<400> 1
ccccggggcc ggcaggccta cacatgcaag tcgaacgaac tcttcggagt tagtggcgga 60
cgggtgagta acacgtggga acgtgccttt tggttcggaa taactcaggg aaacttgtgc 120
taataccgaa tgtgcccttc gggggaaaga tttatcgcca ttagagcggc ccgcgtctga 180
ttagctagtt ggtgaggtaa aagctcacca aggcgacgat cagtagctgg tctgagagga 240
tgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
atcttgcgca atgggcgaaa gcctgacgca gccatgccgc gtgaatgatg aaggtcttag 360
gattgtaaaa ttctttcacc ggggacgata atgacggtac ccggagaaga agccccggct 420
aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgctcgg aattactggg 480
cgtaaagggc gcgtaggcgg atcgttaagt cagaggtgaa atcccagggc tcaaccctgg 540
aactgccttt gatactggcg atcttgagta tgagagaggt atgtggaact ccgagtgtag 600
aggtgaaatt cgtagatatt cggaagaaca ccagtggcga aggcgacata ctggctcatt 660
actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 720
gccgtaaacg atgattgcta gttgtcgggc tgcatgcagt tcggtgacgc agctaacgca 780
ttaagcaatc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccacct 900
tttgacatgc ctggaccgcc acggagacgt ggctttccct tcggggacta ggacacaggt 960
gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1020
aaccctcgcc attagttgcc atcatttagt tgggaactct aatgggactg ccggtgctaa 1080
gccggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttacagggtg ggctacacac 1140
gtgctacaat ggcgactaca gagggttaat ccttaaaagt cgtctcagtt cggattgtcc 1200
tctgcaactc gagggcatga agttggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1260
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttctacccg 1320
aaggcggtgc gctaaccagc aatggaggca gccgaccatc gt 1362

Claims (10)

1.一株短波单孢菌属（Brevundimonassp.）菌株3C，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏编号CCTCC No:M 2019637，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的短波单孢菌属菌株3C在促进杏鲍菇生长中的应用。
3.一种杏鲍菇促生菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的短波单孢菌属菌株3C。
4.权利要求3所述的杏鲍菇促生菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将短波单孢菌属菌株3C接种于NA培养基中，28 ℃培养3～4 d，得到活化的菌株；
2）将步骤1）活化的菌株接种于种子扩大培养基中，在28～32 ℃、150～200 r/min的条件下培养18～24 h，制得种子液；
3）将步骤2）制得的种子液按照体积百分比5～10%接种于发酵培养基中，在28～32 ℃、发酵罐的搅拌转速为150～200 r/min、通气量为1:0.5-2 vvm的条件下培养48～72 h，制得发酵液；
4）通过细菌过滤膜过滤发酵液得到滤液。
5.根据权利要求4所述的杏鲍菇促生菌剂的制备方法，其特征在于，发酵液中短波单孢菌属菌株3C的浓度为1.0～2.0×109 cfu/mL。
6.根据权利要求4所述的杏鲍菇促生菌剂的制备方法，其特征在于，所述种子扩大培养基的配方为：淀粉6～20 g/L、K2HPO3 4～12 g/L、硫酸铵2～5.5 g/L、酵母膏0.5～5 g/L、蔗糖4～10 g/L、MgSO4 2～5 g/L、CaCO3 2～5 g/L、SiO2 2～10 g/L、FeCl3 0.02～1 g/L，pH7.2～7.4。
7.根据权利要求4所述的杏鲍菇促生菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：蔗糖2～5 g/L、K2HPO3 2～5 g/L、酵母膏1.2～5 g/L、硫酸铵0.2～5 g/L、大豆蛋白胨1.5～5 g/L、MgSO4 0.4～5 g/L，pH7.2～7.4。
8.权利要求3-7任一项所述的杏鲍菇促生菌剂在杏鲍菇促生中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将短波单孢菌属菌株3C发酵液与杏鲍菇栽培基质按重量比1.5～2:3混合使用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将短波单孢菌属菌株3C发酵液过滤后，滤液与杏鲍菇栽培基质混合使用。
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