CN104974947B - 一种短波单胞属亚种菌及其应用 - Google Patents

一种短波单胞属亚种菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种短波单胞菌属亚种菌（Brevundimonas sp.）SZ‑22，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.8274。所述菌株在肉汤培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，周围不整齐，乳黄色，表面有光泽，有鞭毛；兼性需氧生长；革兰氏染色呈阴性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白反应呈阳性，酪氨酸反应为阴性；V‑P试验呈阴性，硝酸盐还原反应为阳性；能利用D‑葡萄糖，不能利用D‑木糖、L‑阿拉伯糖、甘露醇和柠檬酸盐。短波单胞菌属亚种菌SZ‑22对引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌具有显著拮抗作用。本发明还提供短波单胞菌属亚种菌（Brevundimonas sp.）SZ‑22在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。

Description

一种短波单胞属亚种菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种短波单胞菌属亚种菌及其应用。
背景技术
人参(Panax ginsengC.A.Mey)为五加科人参属多年生宿根阴性双子叶药用植物，是我国的名贵药材，有“百草之王”的美誉。人参在中国、韩国、朝鲜、俄罗斯等国家有大面积种植，其中，中国东北是人参的主产区，已成为当地的重要支柱产业之一。人参的长期人工种植和品种选育难度大导致人参种质退化、病害严重、质量差、产量低。化学农药的大量使用，导致农药残留和环境污染，降低了人参药材的安全性和商品价值。病害防控问题已成为制约人参产业可持续发展的重大问题之一。
人参病害约有20～40种，其中，由毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)引起的人参锈腐病是人参生产中最严重的病害之一，该病发生于根的各部位，严重时发病率达70%以上。病斑呈铁锈色，由点至面扩散至全根，土壤湿度大、透气不好、腐殖质层厚时发病重。
长期以来通过使用化学农药来防治人参锈腐病的结果远远未达到人们预想的效果，而且过量使用化学农药会破坏土壤的微生态环境，加重环境污染，也使有毒物质在参根内大量积累，降低人参的使用安全性和商品价值，因此，人们把防治重点逐步转向生物防治措施和农业防治措施上。利用人参根际土筛选出有益微生物可调节改善土壤微环境，具有拮抗效果的微生物亦可对人参土传病害进行生物防治。
近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌的生存和活动，使这一防治策略发展迅速，其中拮抗细菌在植物病害防治中起到非常重要的作用。其主要优势在于：1)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；2)具有惊人的繁殖速度；3)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的微生态环境比较适宜；4)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；5)有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量。
拮抗细菌的抑菌结果主要造成病原菌畸形、产生泡状物、破坏病原菌的细胞壁、引起细胞内含物外溢，有的造成菌丝扭曲、原生质凝聚、生长点膨大、细胞壁破裂、菌丝崩溃，对孢子萌发有一定抑制作用。
目前国内外应用芽孢杆菌(Bacillus)防治植物病害非常广泛，如马铃薯疮痂病、番茄青枯病、苹果红腐病、小麦赤霉病及其它一些土传和地上部病害，但是应用短波单胞菌属（Brevundimonas）菌株防治植物病害的报道极少，且未见防治人参锈腐病的研究报道。发明内容
本发明的目的在于，针对人参生产上真菌性病害，尤其是人参土传病害发生面积日益扩大，化学药剂防治除易造成环境污染和农药残留外，防效也不理想的实际情况，提出一种短波单胞菌属（Brevundimonas）亚种菌株SZ-22及其在防控引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌(C.destructans)上的应用。
本发明提供了一种防控引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌(C.destructans)的短波单胞菌属亚种SZ-22菌株，该菌株的保藏名称为短波单胞菌SZ-22，分类命名为Brevundimonassp.SZ-22，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期：2013年9月25日，保藏编号：CGMCC No.8274，其16SrDNA序列长度为1274bp，具体如SEQ ID No:l所示。
GGCGGACGGG TGAGTAACAC GTGGGAACGT GCCTTTTGGTTCGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAAT ACCGAATGTG CCCTTCGGGG GAAAGATTTATCGCCATTAGAGCGGCCCGC GTCTGATTAG CTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGC GACGATCAGT AGCTGGTCTGAGAGGATGAT CAGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCGCAATGG GCGAAAGCCT GACGCAGCCA TGCCGCGTGA ATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCT TTCACCGGGG ACGATATGAC GGTACCCGGAGAAGAAGCCC CGGCTAACTT CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGAAGGGGCTAGCGTTGC TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GGGCGCGTAGGCGGATCGTTAAGTCAGGGG TGAAATCCCG GGGCTCAACC TCGGAATTGC CCTTGATACTGGCGATCTTGAGTATGAGAG AGGTATGTGG AACTCCGAGT GTAGAGGTGAAATTCGTAGA TATTCGGAAG AACACCAGTGGCGAAGGCGA CATACTGGCTCATTACTGAC GCTGAGGCGC GAAAGCGTGG GGAGCACACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGATT GCTAGTTGTC GGGCTGCATGCAGTTCGGTGACGCAGCTAA CGCATTAAGC AATCCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATT AAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCA CAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGAA GCAACGCGCA GAACCTTACCACCTTTTGACATGCCTGGAC CGCCACGGAG ACGTGGCTTT CCCTTCGGGG ACTAGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCT CGCCATTAGTTGCCATCATT TAGTTGGGAACTCTAATGGG ACTGCCGGTG CTAAGCCGGA GGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATG GCCCTTACAG GGTGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGCGACTACAGAGGGTTAATCCTTAA AAGTCGTCTC AGTTCGGATT GTCCTCTGCAACTCGAGGGC ATGAAGTTGG AATCGCTAGTAATCGCGGAT CAGCATGCCGCGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTCTA CCCGAAGGCG GTGC。
应用BLAST软件和DNAMAN软件等进行分析，将SZ-22菌株的16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与SZ-22菌株相似性最高的是Brevundimonas sp.，同源性达到99%。根据MEGA5.10Beta2软件以UPGMA法构建系统发育树发现，SZ-22与Brevundimonas diminuta同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近，亲源性达到了99.5%。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认本发明的菌株SZ-22为短波单胞菌属亚种菌（Brevundimonas sp.）。
本发明的短波单胞属亚种菌SZ-22在肉汤培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，周围不整齐，乳黄色，表面有光泽，有鞭毛；兼性需氧生长；革兰氏染色呈阴性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白反应呈阳性，酪氨酸反应为阴性；V-P试验呈阴性，硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，不能利用D-木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；在含有2%～10%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基上均能生长。所述的肉汤培养基的配方为：葡萄糖25.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl3.0g，琼脂22g，水1000mL，pH7.0；所述的牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl2.0-10.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8-7.2。
本发明还涉及短波单胞菌属亚种菌SZ-22在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用，所述植物优选为人参，所述真菌优选为引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌(C.destructans)。本发明的短波单胞属亚种菌SZ-22对人参还具有促生长作用。
本发明还涉及含有短波单胞菌属亚种菌SZ-22的全培养液培养物的微生物制剂，其可通过以下制备方法制备得到：
（1）将短波单胞菌属亚种菌SZ-22试管种接种于用1000mL三角瓶装的150mLNPC培养液中，在160r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；
（2）将发酵菌液在以种子罐体积15%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为12～15%，总装罐量为50%，搅拌速度220rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；
（3）将种子罐中发酵菌种的20%接种于发酵罐中的NPC培养液中发酵培养，溶氧量为12～15%，总装罐量为50%，搅拌速度220rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐中的发酵液进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物生物量为109cfu/mL以上时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得微生物制剂；发酵罐中发酵时间为24～36小时。
NPC培养液的配方为：葡萄糖120.0g，玉米浆25.0g，(NH4)2SO425.0g，K2HPO40.15g，MgSO4·7H2O1g，ZnSO4·H2O0.01g，MnSO4·H2O0.01g，生物素100μg/L，硫胺素100μg/L，谷氨酸钠(MSG)50.0g，CaCO330g，水1000mL，pH7.0～7.2；制备方法为：称取葡萄糖、玉米浆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、生物素、硫胺素、谷氨酸钠(MSG)、CaCO3放入1000mL水中，充分混匀后用5%NaOH溶液将pH调整至7.0～7.2，1000mL三角瓶中装量为150mL，用双层封口膜封好三角瓶口，115℃湿热灭菌7min，冷却后备用。
发酵培养液的配方以g/L计为：葡萄糖130g，玉米浆40g，(NH4)2SO425.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O1.0g，ZnSO4·H2O0.05g，MnSO4·H2O0.01g，生物素1×10-4g，硫胺素1×10-4g，余量为水，pH6.8～7.0；制备方法为：在种子罐中加入所需的水，按比例加入葡萄糖、玉米浆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、生物素、硫胺素，充分搅拌，用15%的氨水将pH调整至6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽115℃灭菌30min，冷却后立即接种。
在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐中发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。
通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。本发明的微生物制剂在人参锈腐病病的发病初期，可以以稀释液的形式均匀地施加到土壤中，微生物制剂与水的稀释的体积比为1:300。另外，稀释液中还可以添加助剂有机硅，有机硅与稀释液的体积比为1:5000。
本发明的优点在于，保藏号为CGMCC No.8274的短波单胞菌属亚种菌SZ-22对由毁灭柱孢菌(C.destructans)引起的人参锈腐病有良好的防治效果，对人参具有促生长作用，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境；同时，生防菌剂稀释后直接施加到土壤中对植物进行灌根处理即可发挥其杀菌作用，能显著改善人参根际环境中微生物群落的合理结构，形成一个生物多样化的人参根际土壤微生态环境，从而有效地、持久地控制人参锈腐病的流行。
附图说明
图1：本发明的短波单胞菌SZ-22菌株对人参锈腐病(C.destructans)菌丝的生长平板抑制作用。
图2：SZ-22对人参的促生长作用（A：空白，B：浇注SZ-22菌悬液）。
图3：SZ-22对毁灭柱孢菌引起的人参锈腐病的防治效果（A：空白，B：浇注SZ-22菌悬液）。
具体实施方式
实施例1
短波单胞菌属亚种菌(Brevundimonas sp.)SZ-22菌株的分离和保藏
该菌株自吉林省抚松县万良镇人参栽培基地多年生人参根际周围30cm以内的土壤分离得到，采集上述土壤样品，风干后过筛。称取样品10g，放入装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡10-30min，使样品与无菌水混合均匀，制得样品悬液，静置5min。在无菌条件下取1mL上清液，加入9mL0.05%SDS水溶液（十二烷基硫酸钠水溶液），40℃保温20min，取1mL，加入9mL无菌水，按梯度依次制成10-3、10-4、10-5的稀释液。分别吸取100μL各稀释液加入到牛肉膏蛋白胨（NB）平板上，采用平板稀释法均匀涂布，每处理3次重复，34℃培养箱培养1～2天。挑选单菌落转接到NB平板培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。牛肉膏蛋白胨（NB）培养基的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8～7.2。
该菌株在肉汤培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，周围不整齐，乳黄色，表面有光泽，有鞭毛；兼性需氧生长；革兰氏染色呈阴性；接触酶测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白反应呈阳性，酪氨酸反应为阴性；V-P试验呈阴性，硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，不能利用D-木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；在含有2%～10%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基上均能生长。肉汤培养基的配方为：葡萄糖25.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl3.0g，琼脂22g，水1000mL，pH7.0。含有2%～10%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl2.0-10.0g，琼脂17g，水1000mL，pH6.8-7.2。
该菌株于2013年9月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8274。
该菌株我们命名SZ-22，分类命名为：短波单胞属亚种(Brevundimonas sp.)。
实施例2
短波单胞属亚种菌SZ-22对人参真菌性病害病原菌毁灭柱孢菌(C.destructans)生长的抑制作用
采用滤纸片法测定菌株SZ-22对毁灭柱孢菌(C.destructans)的拮抗作用：用直径8mm的打孔器将活化好的上述引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌菌落制成相应尺寸的菌饼，无菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板（直径90mm）的正中央，同时将4片直径为1cm的灭菌滤纸圆片粘于距平板中心25mm处的4个角点上。将菌株SZ-22制成菌悬液（浓度约为108cfu/mL），其中3片滤纸圆片每片点接20μL菌悬液，1片滤纸圆片点接20μL无菌水，作为处理组，每个处理重复3次；另在一块平板的四个角点的4片滤纸圆片上均分别点接20μL无菌水，作为对照组，均置于28℃培养箱培养6～7天，待对照组病原菌菌落长满平板，测量处理组病原菌菌落直径（单位：mm），并按照如下公式计算抑菌率。重复3次，结果取平均值。
抑菌率(%)=［(A－B)/(A－8)］×100%
注：A为对照组病原菌菌落直径，即90mm；B为处理组病原菌菌落直径。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的制备方法：称取去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加入水1000mL，调节pH为7.0。在沸水浴上加热20min，纱布过滤后定容到1000mL，加琼脂22g熔化后分装湿热灭菌(121℃，30min)。
上述菌悬液的制备方法：保藏的菌株SZ-22通过平板划线方式活化2天后，用接种环取3～4块直径1cm的细菌菌落，接入到200mL含50mL肉汤培养液的三角锥形瓶中，摇床30℃，180r/min培养48h后制成浓度约为108cfu/mL的细菌菌悬液。肉汤培养液的配方为：葡萄糖25.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl3.0g，水1000mL，pH7.0。
结果如表1所示，菌株SZ-22对引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌具有明显的抑制作用。
表1菌株SZ-22对引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌的抑制作用
实施例3
短波单胞菌属亚种菌SZ-22对人参锈腐病病原菌毁灭柱孢菌(C.destructans)的拮抗活性实验
采用牛津杯法测定菌株SZ-22对人参锈病病原菌毁灭柱孢菌(C.destructans)的拮抗活性：将SZ-22菌株制成菌悬液后收集(制备方法同实例2)，在4℃条件下，12000r/min离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液4℃保存备用。无菌条件下在PDA平板（直径90mm）中央接种直径为8mm的人参病菌菌饼，然后将4个无菌牛津杯放于距平板中心约25mm的4个对称角点，每杯内滴加100μl滤液，每处理3次重复，28℃培养5天后测量抑菌带宽度。结果表明，SZ-22对毁灭柱孢菌的抑菌带为9.50mm，具有明显的抑制效果（表2）。
表2短波单胞属亚种菌SZ-22对引起人参锈腐病的毁灭柱孢菌的拮抗活性
注：参考Vestberg法，“+”、“++”、“+++”分别表示抑菌带半径为<5mm、5-10mm、>10mm。
实施例4
短波单胞菌属亚种菌SZ-22对人参的促生作用
制备SZ-22菌株菌悬液(30℃、180r/m、48h、浓度约为108cfu/mL，制备方法同实施例2)。将人参新林土：蛭石按照2:1比例配制基质，灭菌后填装于同体积花盆中。应用取于抚松万良县的3年生人参苗，小心抖落附着于根部的土壤，随机分组。将处理组人参苗浸泡于预先配置好的SZ-22菌悬液中，25-30min后取出，分别移栽于装有灭菌土的花盆中，每盆5株。每盆用SZ-22菌悬液(含菌量约为108cfu/mL)的200倍无菌水稀释液50mL灌根，每处理3盆，随机排列，温室保湿培养；对照组用无菌培养液浸苗，处理方式同上，每处理3次盆，随机排列，温室保湿培养，分别浇灌30mL的无菌培养液（除不含有SZ-22外，其余成分与处理组相同）。待人参苗长至30天后，分别随机选取处理组和对照组各5株人参苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、根长、整株鲜重和根鲜重指标。然后180℃烘干至恒重，测整株干重和根干重。
室内盆栽测定结果表明(表3所示)，接种SZ-22菌株于灭菌土种植人参时，人参植株株高、整株鲜重、根鲜重、根长、整株干重及根干重较无菌培养液均有不同程度的增加，证明SZ-22菌株对人参生长具有极显著的促进作用（图3）。同时，也说明SZ-22对人参是安全的。
表3短波单胞菌属亚种菌SZ-22对人参生长的促进作用
实施例5
短波单胞菌属亚种菌SZ-22定殖试验。
短波单胞菌属亚种菌SZ-22在人参根茎叶的定殖
将用利福平(300μg/mL)标记过的短波单胞属亚种菌SZ-22接种于肉汤培养液，30℃，180r/m，摇床24h，制成含菌量约为108cfu/mL的标记菌株菌悬液。将3年生人参苗（抚松）播种于装有自然土（取自吉林省抚松县林地土）及灭菌土（取自抚松县林地土在121℃湿热灭菌2h）的花盆中。苗高10cm定苗，每盆3株，向人参苗根部土壤注入10mL标记过的短波单胞属亚种菌SZ-22菌悬液，10d后分别采集人参苗的叶子和根茎部各1.0g，将其表面消毒后，分别加2mL无菌水研磨，取上清液分别涂布于含利福平(300μg/mL)的NB平板上。32℃培养4天，观察平板是否有短波单胞属亚种菌SZ-22菌落长出。结果表明，叶子和根茎部均能回收到短波单胞属亚种菌SZ-22。这说明SZ-22能在人参体内较长时间存在，其具有内生性。
短波单胞菌属亚种菌SZ-22在土壤中的定殖
将用利福平(300μg/mL)标记过的短波单胞属亚种菌SZ-22接种于肉汤培养液，30℃，180r/m，摇床24h，制成含菌量约为108cfu/mL的标记菌株菌悬液。分别把自然土及灭菌土装于花盆中，每盆1kg土，向土壤中注入100mL标记过的短波单胞属亚种菌SZ-22菌悬液拌土。室温下放置，每隔7天分离1次土壤内的细菌（土壤先经梯度稀释后，取10-3、10-4、10-5的土壤稀释液进行平板涂布），计算含菌量。结果表明，28天后自然土和灭菌土中的定殖菌量均能达到105cfu/g土以上。这说明SZ-22在土壤中具有较强的定殖能力。
实施例6
短波单胞菌属亚种菌SZ-22发酵菌液的制备
短波单胞菌属亚种菌SZ-22试管种接种于用1000mL三角瓶装的150mL NPC培养液中，在160r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液。
NPC培养液的配方为：葡萄糖120.0g，玉米浆25.0g，(NH4)2SO425.0g，K2HPO40.15g，MgSO4·7H2O1g，ZnSO4·H2O0.01g，MnSO4·H2O0.01g，生物素100μg/L，硫胺素100μg/L，谷氨酸钠(MSG)50.0g，CaCO330g，水1000mL，pH7.0～7.2；制备方法为：称取葡萄糖、玉米浆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、生物素、硫胺素、谷氨酸钠(MSG)、CaCO3放入1000mL水中，充分混匀后用5%NaOH溶液将pH调整至7.0～7.2，1000mL三角瓶中装量为150mL，用双层封口膜封好三角瓶口，115℃湿热灭菌7min，冷却后备用。
实施例7
短波单胞菌属亚种菌SZ-22微生物制剂的制备
短波单胞菌属亚种菌SZ-22微生物制剂含有短波单胞属菌亚种菌SZ-22的全培养液培养物，制备方法如下：
(1)将实施例6中培养好的发酵菌液在以种子罐体积15%接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为12～15%，总装罐量为50%，搅拌速度220rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；
(2)将种子罐中发酵菌种的20%接种于发酵罐中的NPC培养液中发酵培养，溶氧量为12～15%，总装罐量为50%，搅拌速度220rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐中的发酵液进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物生物量为109cfu/mL以上时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得微生物制剂；发酵罐中发酵时间为24～36小时。
发酵培养液配方以g/L计为：葡萄糖130g，玉米浆40g，(NH4)2SO425.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O1.0g，ZnSO4·H2O0.05g，MnSO4·H2O0.01g，生物素1×10-4g，硫胺素1×10-4g，余量为水，pH6.8～7.0；制备方法为：在种子罐中加入所需的水，按比例加入葡萄糖、玉米浆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、生物素、硫胺素，充分搅拌，将发酵培养液pH调整至6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽115℃灭菌30min，冷却后立即接种。
实施例8
短波单胞菌属亚种菌SZ-22对毁灭柱孢菌(C.destructans)引起的人参锈腐病的田间防治试验
人参锈腐病防治试验于2013年安排在吉林农业大学药用植物园人参实验田进行，试验用地为平原田块，土壤为林地土壤。人参于5月19日移栽，随机区组排列，每小区种有人参20株，4次重复。移栽前，处理组用实施例7制备的SZ-22微生物制剂的300倍无菌水稀释液蘸根，人参开始发病时对人参灌根，每株灌上述300倍稀释液50mL，分别于5月29日和6月8日灌根两次。以50%多菌灵可湿性粉剂的1000倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照。5月29日、6月18日各调查一次病情指数，调查结果如表4。
如上防效试验计算方法：感染指数=[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100，
相对防效(%)=(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
如表4所示，SZ-22对人参锈腐病有较好的防效，防治效果比该病害主用药剂略优。
表4短波单胞菌属亚种菌SZ-22对人参锈腐病的防治效果试验
实施例9
应用TaKaRa MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒（宝生物工程(大连)有限公司）方法提取总DNA，自行合成的PCR引物序列为16S1F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，16S1R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以SZ-22菌体基因组DNA为模板，经PCR反应扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1500bp左右的特异性片段，测定该片段序列（采用TIANGEN凝胶回收试剂盒于生工生物工程（上海）股份有限公司测序），结果表明，测得SZ-22菌株为1274bp，具体如SEQ ID No：1所示。将测得的16srDNA序列应用BLAST软件和DNAMAN软件以及clustalx拼接软件进行分析，发现，SZ-22菌株测得的序列与短波单胞属亚种菌16srDNA部分基因组序列比对，同源性达到99%。利用MEGA5.10Beta2软件以UPGMA法构建系统发育树1000次随机抽样，计算自引导值(Bootstrap)，SZ-22与Brevundimonas diminuta同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近，亲源性达到了99.5%。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认菌株SZ-22为短波单胞属亚种菌（Brevundimonas sp.）。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求限定的范围，在本专利的启示下，结合本领域的基本常识，将所述菌株用于由毁灭柱孢菌(C.destructans)引起的人参锈腐病的防治中，都属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种短波单胞属亚种菌(Brevundimonas sp.)SZ-22，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.8274。
2.权利要求1所述的短波单胞属亚种菌SZ-22在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用，其中，所述真菌为毁灭柱孢菌(Cylindrocarpondestructans)。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为人参。
4.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1的短波单胞属亚种菌SZ-22的全培养液培养物。
5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，其是通过以下制备方法制备得到的：
(1)将如权利要求1所述的短波单胞属亚种菌SZ-22试管种接种于用1000mL三角瓶装的150mL NPC培养液中，在160r/min，30℃下培养36小时，获得发酵菌液；
(2)将发酵菌液在以种子罐体积15％接种于种子罐中的发酵培养液中发酵培养，溶氧量为12～15％，总装罐量为50％，搅拌速度220rpm，种子罐的温度28～32℃，接种发酵菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间为14～18小时；
(3)将种子罐中发酵菌种的20％接种于发酵罐中的NPC培养液中发酵培养，溶氧量为12～15％，总装罐量为50％，搅拌速度220rpm，发酵罐的温度28～32℃，接种发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵罐中的发酵液进行发酵质量检测，观察菌含量，直到发酵罐中发酵液中的最终培养物生物量为109cfu/mL以上时，立即将发酵液出罐，进行分装，获得微生物制剂；发酵罐中发酵时间为24～36小时；
其中，所述的NPC培养液的配方为：葡萄糖120.0g，玉米浆25.0g，(NH4)2SO4 25.0g，K2HPO4 0.15g，MgSO4·7H2O 1g，ZnSO4·H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，生物素100μg/L，硫胺素100μg/L，谷氨酸钠(MSG)50.0g，CaCO3 30g，水1000mL，pH 7.0～7.2。
6.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述的发酵培养液配方以g/L计为：葡萄糖130g，玉米浆40g，(NH4)2SO4 25.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 1.0g，ZnSO4·H2O0.05g，MnSO4·H2O 0.01g，生物素1×10-4g，硫胺素1×10-4g，余量为水，pH 6.8～7.0。
7.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述的NPC培养液是这样配制的：称取葡萄糖、玉米浆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、生物素、硫胺素、谷氨酸钠(MSG)、CaCO3放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整至7.0～7.2，1000mL三角瓶中装量为150mL，用双层封口膜封好三角瓶口，115℃湿热灭菌7min，冷却后备用。
8.如权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，所述的发酵培养液是这样配制的：在种子罐中加入所需的水，按比例加入葡萄糖、玉米浆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、生物素、硫胺素，充分搅拌，将发酵培养液pH调整至6.8～7.0，密封加料孔，用高温蒸汽115℃灭菌30min，冷却后立即接种。
9.如权利要求5-8中任一项所述的微生物制剂，其特征在于，在种子罐或发酵罐的发酵过程中，当出现较多泡沫时，加入消泡剂，所述的消泡剂为有机硅，加入量以种子罐或发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐中发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。
10.如权利要求5-9中任一项所述的微生物制剂在防治人参真菌病害中的应用，其中，所述真菌为毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，在人参真菌性病害发病初期，将所述微生物制剂的稀释液均匀地施加到土壤中，所述的稀释液中微生物制剂与水的稀释的体积比为1:300。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的稀释液中还添加了助剂有机硅，所述助剂有机硅与稀释液的体积比为1:5000。
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