CN103667080B - 一种分离植物病原真菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离植物病原真菌的方法。该方法具体可包括如下步骤：1）植物样品前处理：将待分离植物样品受病原真菌侵染的部位用体积比70-75%的酒精进行擦拭，晾干酒精；2）病原真菌的分离培养：将经过步骤1）前处理的植物样品置于分离培养基上，25-28℃培养1-2天；3）病原真菌的纯化培养：将经过步骤2）培养得到的菌落边缘的菌丝转入纯化培养基中25-28℃培养3-4天，重复操作2～3次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘的菌丝转入新的纯化培养基中25-28℃培养3-4天，最终得到纯化的病原真菌。本发明全过程不需严格无菌操作，特别适于田间调查、野外考察过程中的病原收集和分离，大大提高工作效率，此类方法在国内外尚无文献或专利报道。

Description

一种分离植物病原真菌的方法

技术领域

本发明属于植物病原微生物领域，涉及一种分离植物病原真菌的方法。

背景技术

大豆在其生长过程中受到数十种病原菌的危害，病原分离是植物病理研究、植物抗病鉴定、植物抗病生理以及进行病害防控研究中最基本的步骤。通常对病原分离的方法是：首先将受害组织彻底消毒，而后将受害组织接种于适于真菌生长的PDA培养基中，经过3-5次纯化培养后，获得纯化的病原。常规的方法对受害组织的表面消毒要求严格，分离过程的全程需在无菌条件下完成。常规方法的缺陷在于：1）操作过程要求严格的无菌条件，这对于分离一些生长在植物表面的微生物、室外考察、野外收集病原十分不便；2）分离组织因严格的表面消毒常常会杀死对消毒剂敏感的病原，致使病原分离失败或降低病原分离效率。因此，开发一种简便的病原分离方法成为提高病原研究效率的迫切需要。

植物病理学研究表明：多数植物病原为异养生物，其可在马铃薯培养基或其他培养基上快速生长。病原对植物的侵染过程也是病原菌在植物体内生长的过程，利用病原与植物细胞的生长条件不同，将受侵染组织置于有利于病原菌生长的培养基中，可将病原分离出来，经过多次纯化，便可得到适于病理学研究的病原。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、易行的分离植物病原真菌的方法。

本发明所提供的分离植物病原真菌的方法，可包括如下步骤：

（1）植物样品前处理：将待分离植物样品受病原真菌侵染的部位（出现病原真菌病斑的部位）用体积比70-75%（如75%）的酒精进行擦拭，去除表面泥土，晾干酒精；

（2）病原真菌的分离培养：将经过步骤（1）前处理的植物样品置于分离培养基上，25-28℃（如28℃）培养1-2天（直至菌落直径约为1CM左右）；

（3）病原真菌的纯化培养：将经过步骤（2）培养得到的菌落边缘的菌丝转入纯化培养基中25-28℃（如28℃）培养3-4天，重复操作2～4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘的菌丝转入新的纯化培养基中25-28℃（如28℃）培养3-4天，最终得到纯化的病原真菌。

在上述方法中，所述分离培养基可为含有终浓度为100mg/L头孢霉素的PDA固体培养基；所述纯化培养基为不含有任何抗生素的PDA固体培养基。

所述PDA固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L；pH5.0-8.0。

进一步，在本发明中，所述PDA固体培养基是用马铃薯培养基成品粉剂（青岛高科园海博生物技术有限公司产品公司产品，其产品目录号为HB0233）用水配制并灭菌后得到的，其用量为每升培养基中含有40克粉剂。

在上述方法的步骤（1）中，将所述待分离植物样品受病原真菌侵染的部位用酒精进行擦拭并晾干后，还包括将所述待分离植物样品受病原真菌侵染部位的组织切成（0.2～0.3）cm×（0.2～0.3）cm，如0.2cm×0.2cm，再如0.2cm×0.3cm的小块的步骤。将所得（0.2～0.3）cm×（0.2～0.3）cm的小块进行步骤（2）的分离培养。

在上述方法的步骤（3）中，所述菌落边缘的菌丝具体可为取自菌落边缘处面积为0.3cm×（0.3～0.5）cm，如0.3cm×0.3cm，再如0.3cm×0.5cm的菌丝。

分离纯化后的真菌可用于常规微生物学和植物病理学研究。

在上述方法中，所述植物可为大豆、辣椒、柑桔等常见农作物、蔬菜与水果。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为大豆。

在上述方法中，所述病原真菌为非专性寄生真菌，如寄生在植物体表面的非专性寄生真菌。

进一步，在本发明中，所述病原真菌为炭疽病病原真菌、拟茎点霉种腐病病原真菌、黑斑病病原真菌。

所述炭疽病病原真菌为半知菌纲（Fungiimperficiti）黑盘孢目（Melanconiales）黑盘孢科（Melanconiaceae）刺盘孢菌属（ColletotrichumCorda.）的辣椒炭疽菌（Colletotrichumcapsicii）；所述拟茎点霉种腐病病原真菌为子囊菌纲（Ascomycota）鹿角菌目（Xylariales）腐皮壳菌科（Diaporthaceae）腐皮壳属（DeaportheNitschke）的拟茎点霉菌（Phomopsislongiculla）；所述黑斑病病原真菌为半知菌纲（Fungiimperficiti）链孢霉目（Monilales）黑霉科（Damatiaceae）交链孢霉属（AlternariaNeesexWallr.）的细极链格孢菌（Alternariatenuissima）。

本发明的另一个目的是提供一种在分离植物病原真菌过程中处理待分离样品的方法。

本发明所提供的在分离植物病原真菌过程中处理待分离样品的方法，是将待分离植物样品受病原真菌侵染的部位用体积比70-75%（如75%）的酒精进行擦拭，去除表面泥土，晾干酒精。

在上述方法中，所述植物可为大豆、辣椒、柑桔等常见农作物、蔬菜与水果。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为大豆。

在上述方法中，所述病原真菌为非专性寄生真菌，如寄生在植物体表面的非专性寄生真菌。

进一步，在本发明中，所述病原真菌为炭疽病病原真菌、拟茎点霉种腐病病原真菌、黑斑病病原真菌。

所述炭疽病病原真菌为半知菌纲（Fungiimperficiti）黑盘孢目（Melanconiales）黑盘孢科（Melanconiaceae）刺盘孢菌属（ColletotrichumCorda.）的辣椒炭疽菌（Colletotrichumcapsicii）；所述拟茎点霉种腐病病原真菌为子囊菌纲（Ascomycota）鹿角菌目（Xylariales）腐皮壳菌科（Diaporthaceae）腐皮壳属（DeaportheNitschke）的拟茎点霉菌（Phomopsislongiculla）；所述黑斑病病原真菌为半知菌纲（Fungiimperficiti）链孢霉目（Monilales）黑霉科（Damatiaceae）交链孢霉属（AlternariaNeesexWallr.）的细极链格孢菌（Alternariatenuissima）。

本发明因全过程不需要严格的无菌操作，特别适于田间调查、野外考察过程中的病原收集和分离，大大提高工作效率。具体而言，本发明与常规病原分离方法相比具有如下优点：

1）条件简单：培养过程中无需严格的无菌条件，一般实验室、甚至在不通风的房间均可进行。

2）培养过程简单：全程仅需2种培养基。

3）外植体制备工艺简单，便于掌握：外植体制备仅需去除表面泥土，再将表面吹干即可，无需严格的无菌消毒；一个普通工人稍加培训即可掌握。

4）获得病原种类齐全：由于外植体制备不经严格的表面消毒，入侵的病原不会因严格消毒而脱落或失活，因此分离的病原种类齐全，少有偏差。而采用常规方法分离病原因外植体经过2-3次严格消毒，一些生活在植物组织表层的病原常易失活而导致分离失败或所得病原并非目标病原。

5）成本低：病原分离全过程不需严格的无菌操作，省去了外植体消毒、洗涤等工序，由于样品的即时分离，省去了样品保存的设备投资和保存费用，特别适用于大规模病原分离.

6）病原分离效率高：由于病原分离无需严格无菌操作，许多病原都能完好的保存在大豆组织当中，很少发生分离出错误病原的现象。从而提高病原分离的准确率，提高了工作效率.

7）适应范围广：本发明因外植体不需严格的表面消毒，可随时随地进行分离，特别适合外出田间作业、长期野外考察的病原采集，对于一些不易长时间离体保存的病原分离更具优势.

8）绿色环保：病原分离时仅对外植体做清水冲洗和酒精消毒，除去了常用的烈性消毒剂如次氯酸钠、升汞等，病原分离过程更加安全、环保。

附图说明

图1为病原真菌的分离培养，A为实施例1中荚部病害的分离；B为实施例2中叶部病原的分离。

图2为实施例1中分离组织在分离培养基生长2天的情况；

图3为实施例1中纯化后的炭疽病原及孢子形态观察：A纯化后的病原培养；B炭疽菌的孢子（1000×光学显微镜下）。

图4为实施例2中纯化的拟茎点霉种腐病原及孢子形态观察：A纯化后的病原培养；B拟茎点霉种腐菌的孢子（1000×光学显微镜下）。

图5为实施例3中纯化的黑斑病原及孢子形态观察：A纯化后的病原培养；B细极链格孢的孢子（400×光学显微镜下）。

图6为实施例1中分离的炭疽病原在豆荚上的回接症状：A为未接种豆荚（接清水的对照），B为接种豆荚。

图7为实施例2中分离的拟茎点霉种腐病原在叶片上的表现：A接种的叶片；B未接种对照（接清水的对照）。

图8为实施例3中分离的黑斑病原在叶片上的表现：A接种的叶片；B未接种叶片（接清水的对照）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

分离培养基：PDA培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，产品编号HB0233），高温121℃，1.05大气压，15分钟灭菌，待温度降至60℃以下时，每升培养基加入1ml浓度为100mg/ml的头孢霉素溶液，混匀后倒9cm×1.5cm平皿，每皿20ml培养基，培养基凝固后备用。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

纯化培养基：PDA培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，产品编号HB0233），高温121℃，1.05大气压，15分钟灭菌，灭菌后倒入9cm×1.5cm平皿，每皿20ml培养基，培养基凝固后备用；本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

其中，PDA培养基如果自己配制，可按照如下配方进行：马铃薯200g煮汁、葡萄糖20g、琼脂15g，用水定容至1L。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤即可（取滤液）。

实施例1、大豆炭疽病病原真菌的分离

一、采用本发明方法分离大豆炭疽病病原真菌

1、实验方法

1）植物样品前处理：

于大豆鼓荚期选取表面的有炭疽病斑（不规则褐斑）的豆荚，清水洗去表面灰尘，用75%（体积分数）酒精棉球擦拭豆荚表面，去除表面泥土，于通风处吹干；用手术刀切取褐斑部位大小约为0.2cm×0.2cm的组织块，待用。本操作可在开放环境下进行。

2）病原真菌的分离培养：

将步骤1）所得组织块置于分离培养基上（如图1中A所示），于28℃恒温培养箱中培养1-2天（如图2所示），直至菌落直径约为1-1.5CM，每皿5块，每份样品做3皿。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

3）病原真菌的纯化培养：

将经过步骤2）培养得到的菌落边缘（外植体周围）面积为0.3cm×0.5cm的菌丝转入纯化培养基中置于28℃恒温培养箱中培养3-4天，如此反复2～4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘面积为0.3cm×0.5cm的菌丝转入新的纯化培养基中28℃培养3-4天，最终得到纯化后的病原真菌（图3中A）。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

4）病原真菌的鉴定：

A、序列测定

将步骤3）获得的纯化后的病原真菌于纯化培养基上培养1-2周后，用手术刀刮取约1cm²大小菌斑，于0.1MTris-HClpH8.0提取液中提取病原DNA，提取的DNA用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系组成成分为：l0×PCR缓冲液25μL、dNTP各0.2mmol/L、上下游引物各10pmol/L、DNA模板10ng、TaqDNA聚合酶1.0U。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃30s55℃50s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物进行测序后比对确定病原。

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；

ITS4：5’-TATCCCTACCTGATCCGAG-3’。

B、形态观察：取5ml左右清水对已纯化培养约2周的培养物进行冲洗，将孢子洗下，收集于10ml离心管中，取1-2μl滴于载玻片上，加盖玻片于光学显微镜下镜检，观察孢子形态，按魏景超著《真菌鉴定手册》分类方法进行鉴定。

C、回接实验

将病原真菌回接至未感病的大豆豆荚上，具体操作如下：用玻棒将培养7-14天的菌丝刮下，镜检后稀释成10⁶孢子/ml菌悬液，用移液器将菌悬液接种于豆荚表面，每个豆荚接种10-20μl，清水接种为对照，只接种一侧即可，接种后将豆荚置于15×2.5CM的平皿中，平皿底部垫一张直径为15CM的滤纸，滤纸用清水浸湿，倒去多余的水分，盖好顶盖，每皿放6-10个豆荚，每个处理接种3皿，于24-28℃处黑暗培养48小时，48小时后将培养皿移至光周期12h/12h，光强140-400μmol/s/m²，24-28℃条件下，接种一周后统计发病荚数。炭疽病斑为深褐色，病斑中有黑色点状孢子盘，孢子盘中有大量孢子溢出，孢子呈灰白色粘液状。

以上实验进行4次重复。

2、实验结果

结果显示，在4次重复分离的共60份感病组织中，全部均长出病原菌丝。DNA序列比对结果显示，其中57份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：HQ271468.1所示的大豆炭疽病病原真菌——辣椒炭疽菌（Colletotrichumcapsicii）的核糖体5.8S核糖体rRNA基因序列的序列同源性100%，从而确定这57份病原真菌均为大豆炭疽病病原真菌——辣椒炭疽菌。这57份病原真菌光镜下孢子形态的检测结果如图3中B所示，分生孢子呈新月形，两端较尖，无色，18～30×3-8μm，400-1000倍镜下可见1-4个油滴，与文献中记载相符。进一步，将这57份病原真菌回接至大豆豆荚上，结果显示均可产生炭疽致病病斑（图6）。60份样品中另外3份病原真菌的PCR扩增产物的序列均与GenBank：JQ899032.1所示的大豆种腐病原——拟茎点霉种腐病原真菌（Phomopsislongiculla）的5.8S核糖体rRNA基因序列的序列同源性100%，从而确定这3份病原真菌均为种腐病菌——大豆拟茎点霉种腐菌（Phomopsislongiculla）。进一步，将这3份病原真菌回接至大豆豆荚上，均不能产生炭疽菌致病病斑。综上所述，可见采用本发明方法从大豆上分离大豆炭疽病病原真菌，其准确率可达到95%。

二、采用传统方法分离大豆炭疽病病原真菌

1、实验方法

1）植物样品前处理：

于大豆鼓荚期选取表面的有炭疽致病病斑（不规则褐斑）的豆荚，清水洗去表面灰尘。下面过程需在超净台上完成，将豆荚置于75%（体积分数）酒精中浸泡3分钟，而后将豆荚置于1%（体积分数）次氯酸钠水溶液中浸泡20分钟，豆荚从次氯酸钠溶液中取出后，用无菌水冲洗4次，用手术刀切取病、健交界处大小约为0.2cm×0.2cm的组织块，待用。

2）病原真菌的分离培养：

将步骤1）所得组织块置于分离培养基上，于28℃恒温培养箱中培养1-2天，至菌落直径为1-1.5CM时，每皿5块，每份样品做3皿。

3）病原真菌的纯化培养：

将经过步骤2）培养得到的菌落边缘（外植体周围）面积为0.3cm×0.5cm的菌丝转入纯化培养基中置于28℃恒温培养箱中培养3-4天，如此反复2～4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘面积为0.3cm×0.5cm的菌丝转入新的纯化培养基中28℃培养3-4天，最终得到纯化后的病原真菌。

4）病原真菌的鉴定：

同步骤一。

以上实验进行4次重复。

2、实验结果

结果显示，在4次重复分离的共60份感病组织中，仅21份长出病原菌丝。DNA序列比对结果显示，其中2份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：KC119203.1所示的镰刀菌的5.8S核糖体rRNA基因序列的同源性100%，从而确定这2份病原真菌均为镰刀菌；4份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：AY681177.1所示的脉孢菌的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这4份病原真菌均为脉孢菌；其余15份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：JQ899032.1所示的大豆种腐病原菌——拟茎点霉种腐菌（Phomopsislongiculla）的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这15份病原真菌均为大豆拟茎点霉种腐病病原真菌——大豆拟茎点霉种腐菌（Phomopsislongiculla）。进一步，将这21份病原真菌回接至大豆豆荚上，均不能产生炭疽菌致病病斑。综上所述，可见采用传统方法从大豆上分离大豆炭疽病病原真菌，分离失败。分析其原因有两种可能，一是大豆炭疽病病原真菌分布在大豆豆荚的表面易被洗掉，二是大豆炭疽病病原真菌对消毒液特别敏感，经处理后失去了活力。

实施例2、大豆拟茎点霉种腐病病原真菌的分离

一、采用本发明分离拟茎点霉种腐病病原真菌

1、实验方法

1）植物样品前处理：

于大豆出苗1周后，取子叶有拟茎点霉种腐病致病病斑（红褐斑）的植株，将子叶用清水洗净后，75%（体积分数）酒精棉球擦干子叶表面，去除表面泥土，于通风处吹干；用手术刀切取褐斑部位大小约为0.2cm×0.2cm的组织块，待用。本操作可在开放环境下进行。

2）病原真菌的分离培养：

将步骤1）所得组织块置于分离培养基上（如图1中B所示），于28℃恒温培养箱中培养1-2天，至菌落直径为1-1.5CM时，每皿5块，每份样品做3皿。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

3）病原真菌的纯化培养：

将经过步骤2）培养得到的菌落边缘（外植体周围）面积为0.3cm×0.5cm的菌丝转入纯化培养基中置于28℃恒温培养箱中培养3-4天，如此反复2-4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘面积为0.3cm×0.5cm的菌丝转入新的纯化培养基中28℃培养3-4天，最终得到纯化后的病原真菌（图4中A）。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

4）病原真菌的鉴定：

A、形态学鉴定：取5ml左右清水对已纯化培养约2周的培养物进行冲洗，将孢子洗下，收集于10ml离心管中，取1-2μl滴于载玻片上，加盖玻片于光学显微镜下镜检，观察孢子形态，按魏景超著《真菌鉴定手册》分类方法进行鉴定。

B、序列测定

将步骤3）获得的纯化后的病原真菌于纯化培养基上培养1-2周后，用手术刀刮取约1cm²大小菌斑，于0.1MTris-HClpH8.0提取液中提取病原DNA，提取的DNA用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系组成成分为：l0×PCR缓冲液25μL、dNTP各0.2mmol/L、上下游引物各10pmol/L、DNA模板10ng、TaqDNA聚合酶1.0U。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃30s、55℃50s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物进行测序后比对确定病原。

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；

ITS4：5’-TATCCCTACCTGATCCGAG-3’。

C、回接实验

将经序列测定的病原真菌回接至未感病的大豆叶片上，具体操作如下：用玻棒将培养7-14天的菌丝刮下，镜检后稀释成10⁶孢子/ml菌悬液，用移液器将菌悬液接种于15日龄植株的叶片上，每个叶片接种4个点，分位于主叶脉两侧，每点接种5-10μl，清水接种为对照，接种后将叶片置于15×2.5CM的平皿中，正面向上，平皿底部垫一张直径为15CM的滤纸，滤纸用清水浸湿，倒去多余的水分，每皿放5个叶片，盖好顶盖，每个处理接种3皿，于24-28C处黑暗培养48小时，48小时后将培养皿移至光周期12h/12h，光强140-400μmol/s/m²，24-28C条件下，接种一周后统计发病点数。

以上实验进行4次重复。

2、实验结果

结果显示，在4次重复分离的共60份感病组织中，全部均长出病原菌丝。通过形态学鉴定其中7份为镰刀菌，53份为拟茎点霉种腐病病原真菌，这53份病原真菌光镜下孢子形态的检测结果如图4中B所示，分生孢子多（90%以上）为α型孢子，β型孢子少见，分生孢子呈长圆，两端圆滑，无色，6～10.5×2.4-3.3μm，1000倍镜下可见孢子两端有1-2个油滴，与文献中记载相符。DNA序列比对结果显示，53份从形态学上鉴定为拟茎点霉种腐病病原真菌的病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：JQ899032.1所示的大豆种腐病原菌——拟茎点霉种腐菌（Phomopsislongiculla）的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这53份病原真菌均为种腐病原菌——大豆拟茎点霉菌（Phomopsislongiculla）。进一步，将这53份病原真菌回接至大豆子叶上，结果显示均可产生种腐病斑（图7）。7份从形态学上鉴定为镰刀菌的病原真菌的PCR扩增产物的序列均与GenBank：KC119203.1所示的镰刀菌的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这7份病原真菌均为镰刀菌。进一步，将这7份病原真菌回接至大豆子叶上，均不能产生拟茎点霉种腐病致病病斑。综上所述，可见采用本发明方法从大豆上分离大豆拟茎点霉种腐病病原真菌，其准确率可达到88.3%。

二、采用传统方法分离拟茎点霉种腐病病原真菌

1、实验方法

1）植物样品前处理：

于大豆出苗1周后，取子叶有拟茎点霉种腐病致病病斑（红褐斑）的植株，将子叶用清水洗净。下面过程需在超净台上完成，将感病子叶置于75%（体积分数）酒精中浸泡3分钟，而后转至1%（体积分数）次氯酸钠水溶液中浸泡20分钟，子叶从次氯酸钠溶液中取出后，用无菌水冲洗4次，用手术刀切取病、健交界处0.2cm×0.2cm的组织块，待用。

2）病原真菌的分离培养：

将步骤1）所得组织块置于分离培养基上，于28℃恒温培养箱中培养1-2天，至菌落直径为1-1.5CM时，每皿5块，每份样品做3皿。

3）病原真菌的纯化培养：

将经过步骤2）培养得到的菌落边缘（外植体周围）0.3cm×0.5cm的菌丝转入纯化培养基中置于28℃恒温培养箱中培养3-4天，如此反复2-4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘0.3cm×0.5cm的菌丝转入新的纯化培养基中28℃培养3-4天，最终得到纯化后的病原真菌。

4）病原真菌的鉴定：

同步骤一。

以上实验进行4次重复。

2、实验结果

结果显示，在4次重复分离的共60份感病组织中，仅31份长出病原菌丝。通过形态学鉴定其中7份为镰刀菌，24份为拟茎点霉种腐病病原真菌。DNA序列比对结果显示，24份从形态学上鉴定为拟茎点霉种腐病病原真菌的病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：JQ899032.1所示的大豆种腐病原菌——拟茎点霉种腐菌（Phomopsislongiculla）的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这24份病原真菌均为大豆拟茎点霉种腐病病原菌——拟茎点霉种腐菌（Phomopsislongiculla）。进一步，将这24份病原真菌回接至大豆子叶上，结果显示均可产生种腐病病斑。7份从形态学上鉴定为镰刀菌的病原真菌的PCR扩增产物的序列均与GenBank：KC119203.1所示的镰刀菌的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这7份病原真菌均为镰刀菌。进一步，将这7份病原真菌回接至大豆子叶上，均不能产生拟茎点霉种腐病致病病斑。综上所述，可见采用传统方法从大豆上分离大豆拟茎点霉种腐病病原真菌，其准确率为77.4%。

实施例3、大豆黑斑病病原真菌的分离

一、采用本发明方法分离大豆黑斑病病原真菌

1、实验方法

1）植物样品前处理：

于大豆盛花期选取有黑斑症状的叶片，清水洗去表面灰尘，75%（体积分数）酒精棉球擦干叶片表面，去除表面泥土，于通风处吹干；用手术刀切取黑斑部位大小约为0.2cm×0.3cm的组织块，待用。本操作可在开放环境下进行。

2）病原真菌的分离培养：

将步骤1）所得组织块置于分离培养基，于28℃恒温培养箱中培养1-2天至菌落直径为1-1.5CM时，每皿5块，每份样品做3皿。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

3）病原真菌的纯化培养：

将经过步骤2）培养得到的菌落边缘（外植体周围）面积为0.3cm×0.3cm的菌丝转入纯化培养基中置于28℃恒温培养箱中培养3-4天，如此反复2～4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘面积为0.3cm×0.3cm的菌丝转入新的纯化培养基中28℃培养3-4天，最终得到纯化后的病原真菌（图5中A）。本操作的最适工作环境为超净工作台，如无此条件，可无空气流动的房间中在酒精灯附近操作。

4）病原真菌的鉴定：

A、形态观察：取5ml左右清水对已纯化培养约2周的培养物进行冲洗，将孢子洗下，收集于10ml离心管中，取1-2μl滴于载玻片上，加盖玻片于光学显微镜下镜检，观察孢子形态，按魏景超著《真菌鉴定手册》分类方法进行鉴定。

B、序列测定

将步骤3）获得的纯化后的病原真菌于纯化培养基上培养1-2周后，用手术刀刮取约1cm²大小菌斑，于0.1MTris-HClpH8.0提取液中提取病原DNA，提取的DNA用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系组成成分为：l0×PCR缓冲液25μL、dNTP各0.2mmol/L、上下游引物各10pmol/L、DNA模板10ng、TaqDNA聚合酶1.0U。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃30s、55℃50s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物进行测序后比对确定病原。

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；

ITS4：5’-TATCCCTACCTGATCCGAG-3’。

C、回接实验

将经序列测定的病原真菌回接至未感病的大豆叶片上，具体操作如下：用玻棒将培养7-14天的菌丝刮下，镜检后稀释成10⁶孢子/ml菌悬液，用移液器将菌悬液接种于15日龄植株的叶片上，每个叶片接种4个点，分位于主叶脉两侧，每点接种5-10μl，清水接种为对照，接种后将叶片置于15×2.5CM的平皿中，正面向上，平皿底部垫一张直径为15CM的滤纸，滤纸用清水浸湿，倒去多余的水分，每皿放5个叶片，盖好顶盖，每个处理接种3皿，于24-28C处黑暗培养48小时，48小时后将培养皿移至光周期12h/12h，光强140-400μmol/s/m²，24-28C条件下，接种一周后统计发病点数。

以上实验进行4次重复。

2、实验结果

结果显示，在4次重复分离的共60份感病组织中，全部均长出病原菌丝。通过形态学鉴定其中5份为镰刀菌，55份为大豆黑斑病病原真菌，这55份病原真菌光镜下孢子形态的检测结果如图5中B所示，分生孢子棒槌状，中间有2-3横隔，褐色，50～70×10-22μm，与文献中记载相符。DNA序列比对结果显示，这55份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：AB369450.1所示的大豆黑斑病病原真菌——细极链格孢菌（Alternariatenuissima）的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这55份病原真菌均为大豆黑斑病病原真菌——细极链格孢菌（Alternariatenuissima）。进一步，将这55份病原真菌回接至大豆叶片上，结果显示均可产生黑斑症状（图8）。60份样品中另外5份病原真菌的PCR扩增产物的序列均与GenBank：KC119203.1所示的镰刀菌的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这5份病原真菌均为镰刀菌。进一步，将这5份病原真菌回接至大豆叶片上，均不能产生黑斑症状。综上所述，可见采用本发明方法从大豆上分离大豆黑斑病病原真菌，其准确率可达到91.7%。

二、采用传统方法分离大豆黑斑病病原真菌

1、实验方法

1）植物样品前处理：

于大豆盛花期选取有黑斑症状的叶片，清水洗去表面灰尘。下面过程需在超净台上完成，将感病叶片置于75%（体积分数）酒精中浸泡3分钟，而后转至1%（体积分数）次氯酸钠水溶液中浸泡20分钟，叶片从次氯酸钠溶液中取出后，用无菌水冲洗4次，用手术刀切取病、健交界处大小约为0.2cm×0.3cm的组织块，待用。

2）病原真菌的分离培养：

将步骤1）所得组织块置于分离培养基，于28℃恒温培养箱中培养1-2天，至菌落直径为1-1.5CM时，每皿5块，每份样品做3皿。

3）病原真菌的纯化培养：

将经过步骤2）培养得到的菌落边缘（外植体周围）0.3cm×0.3cm的菌丝转入纯化培养基中置于28℃恒温培养箱中培养3-4天，如此反复2～4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘0.3cm×0.3cm的菌丝转入新的纯化培养基中28℃培养3-4天，最终得到纯化后的病原真菌。

4）病原真菌的鉴定：

同步骤一。

以上实验进行4次重复。

2、实验结果

结果显示，在4次重复分离的共60份感病组织中，仅38份长出病原菌丝。DNA序列比对结果显示，其中30份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：KC119203.1所示的镰刀菌的5.8S核糖体rRNA基因的序列同源性100%，从而确定这30份病原真菌均为镰刀菌，进一步将这30份病原真菌回接至大豆叶片上，均不能产生黑斑症状。60份样品中的另外8份病原真菌的PCR扩增产物的序列与GenBank：AB369450.1所示的大豆黑斑病病原真菌——细极链格孢菌（Alternariatenuissima）的5.8S核糖体rRNA的序列同源性100%，从而确定这8份病原真菌均为大豆黑斑病病原真菌——细极链格孢菌（Alternariatenuissima），进一步将这8份病原真菌回接至大豆叶片上，均产生黑斑症状。综上所述，可见采用传统方法从大豆上分离大豆黑斑病病原真菌，其准确率仅为21.1%。

Claims (8)

1.分离植物病原真菌的方法，包括如下步骤：

(1)植物样品前处理：将待分离植物样品受病原真菌侵染的部位用体积比70-75％的酒精进行擦拭，去除表面泥土，晾干酒精；

(2)病原真菌的分离培养：将经过步骤(1)前处理的植物样品置于分离培养基上，25-28℃培养1-2天；

(3)病原真菌的纯化培养：将经过步骤(2)培养得到的菌落边缘的菌丝转入纯化培养基中25-28℃培养3-4天，重复操作2～4次，每次重复均将上一次培养所得菌落边缘的菌丝转入新的纯化培养基中25-28℃培养3-4天，最终得到纯化的病原真菌；

所述植物为大豆；

所述病原真菌为非专性寄生真菌；

所述病原真菌为寄生在植物体表面的病原真菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分离培养基为含有终浓度为100mg/L头孢霉素的PDA固体培养基；所述纯化培养基为不含有任何抗生素的PDA固体培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，将所述待分离植物样品受病原真菌侵染的部位用酒精进行擦拭并晾干后，还包括将所述待分离植物样品受病原真菌侵染部位的组织切成(0.2～0.3)cm×(0.2～0.3)cm的小块的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述菌落边缘的菌丝为取自菌落边缘处面积为0.3cm×(0.3～0.5)cm的菌丝。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病原真菌为炭疽病病原真菌、拟茎点霉种腐病病原真菌或黑斑病病原真菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述炭疽病病原真菌为辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsicii)。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述拟茎点霉种腐病病原真菌为拟茎点霉菌(Phomopsislongiculla)。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述黑斑病病原真菌为细极链格孢菌(Alternariatenuissima)。