CN110093282A - 一种三七根部病害柱孢属真菌的分离方法 - Google Patents

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杨建忠
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Abstract

本发明公开了一种三七根部病害柱孢属真菌的分离方法。本发明是将黑腐、褐腐或锈腐的三七病组织用无菌水清洗后，加入无菌水将三七病组织捣碎至浆状，过滤弃滤渣，过滤液中再加入无菌水，梯度稀释，将多个梯度的稀释液分别加入含有NaFeEDTA的PDA或PSA培养基上，黑暗条件下恒温培养10‑20天后，培养基上有锈色、栗色、咖啡色、褐色或是黑褐色的菌落即为三七根部病害柱孢属真菌。本发明分离方法操作简单，成本低廉，分离频率达150％以上，弥补了现有技术分离三七根部病害柱孢属真菌的分离频率仅有10％的不足，提高了分离效率，有助于推进三七根腐病柱孢属真菌的研究与防治。

Description

一种三七根部病害柱孢属真菌的分离方法
技术领域
本发明属于真菌分离培养技术领域，具体地说，涉及一种三七根部病害柱孢属真菌的分离方法。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)，又名田七、金不换，为五加科人参属多年生宿根草本植物，是原产于云南文山的名贵中药材。目前，文山三七产值已近200亿元，成了云南省文山州的重要经济支柱产业。由于大面积连片种植，以及生长周期长，三七病害种类多，流行时期长。三七根腐病是三七生产中危害最为严重的一类病害，它的症状有多种，病原多样化，如：藨草镰孢霉，腐皮镰刀菌，腐皮镰刀菌根生专化型，尖孢镰刀菌和串珠镰孢中间变种，双胞柱孢、毁灭柱孢、毁灭柱孢毁灭变种，毁灭柱孢粗孢变种等等20余种。研究发现，由柱孢属真菌引起的三七根部病害发病率很高，在10％-30％之间，最高可达90％。然而，引进三七根腐病的柱孢属真菌的研究进展缓慢，主要原因是柱孢属真菌的分离困难较大。
三七根腐病病原菌常见的分离方法为组织分离法(方中达，1998：125)，这种方法的优点是操作简单，可以尽可能的分离到病组织中的微生物，适用于未知病原物的根腐病组织。这种方法的缺点是，分离的微生物数量很大，后续的纯化及致病性测定工作量较大，不适合已知症状及主要病原物种类的根腐病组织的病原物的分离。
柱孢属真菌的菌落颜色特点鲜明，为锈色、栗色、咖啡色、褐色或是黑褐色。见文献Cabral A,Groenewald J Z,Rego C,Oliveira H,Crous P W.Cylindrocarpon root rot:multi-gene analysis reveals novel species within the Ilyonectria radicicolaspecies complex[J].Mycol Progress,2012,11:655–688；以及文献毛忠顺，等(2014)西北农林科技大学学报(自然科学版)，42(8)：169-177；Mao等(2014)，Plant disease，2014，98(1):162.的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效的三七根部病害柱孢属真菌的分离方法。
本发明提高的一种三七根部病害柱孢属真菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)将黑腐、褐腐或锈腐的三七病组织表面消毒后，用无菌水清洗，
(2)加入无菌水将三七病组织捣碎至浆状，过滤弃滤渣，
(3)过滤液中再加入无菌水，逐次梯度稀释，
(4)将多个梯度的稀释液分别加入含有Fe3+的PDA或PSA培养基上，黑暗条件下恒温培养，待培养基上有锈色、栗色、咖啡色、褐色或是黑褐色的菌落即为三七根部病害柱孢属真菌。
步骤(1)中的三七病组织大小为(4-8)mm×(4-8)mm。
步骤(1)中采用75％酒精消毒2min，以杀灭三七组织表面的微生物，柱孢属真菌已经深入组织内部，不会因该消毒操作而被杀灭。
本发明提高的分离方法中，步骤(2)是将三七病组织放入10mL无菌离心管中，加入1mL无菌水，用灭菌摄子捣碎至浆状，用无菌水定容至10mL；用2层灭菌纱布过滤，取100μL滤液。
本发明提高的分离方法中，上述步骤(2)的滤液加至2mL无菌离心管中，再加入900μL无菌水，振荡混均后，即为10-2稀释液；以同样的方法，稀释到10-4
本发明提高的上述分离方法中，步骤(4)的含有Fe3+的PDA或PSA培养基中，Fe3+的浓度为1-4mmol·L-1。
优选地，PDA或PSA培养基中含2-4mmol·L-1的Fe3+。
更优选地，PDA或PSA培养基中含4mmol·L-1的Fe3+。本发明进一步研究发现，PDA或PSA培养基中Fe3+浓度持续增高至4mmol·L-1，并且自4mmol·L-1后，随着浓度的增加，其分离柱孢属真菌的效果与4mmol·L-1的相当，基于节约成本考虑，本发明建议PDA或PSA培养基中Fe3+的浓度不超过4mmol·L-1。
本发明的实施例中，本发明选用NaFeEDTA按照上述对Fe3+浓度的要求添加入PDA或PSA培养基中。
本发明的分离方法的步骤(4)中，黑暗条件下恒温23-28℃培养7-15天。
本发明还提供一种培养基，其为含有Fe3+的PDA或PSA培养基。
优选地，所述培养基中含有1-4mmol·L-1的Fe3+。
更优选地，所述培养基中含有2-4mmol·L-1的Fe3+。
最优选地，所述培养基中含有3-4mmol·L-1的Fe3+。
本发明一个优选的实施方式是，所述的培养基中含有1-4mmol·L-1的NaFeEDTA。
本发明提供了上述培养基在分离培养柱孢属真菌中的应用。
本发明提供了上述培养基在分离培养人参属植物根部柱孢属真菌中的应用。
本发明实施例提供的是上述培养基在分离培养三七根部柱孢属真菌中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明在PDA或PSA培养基中加入Fe3+，能够有效地从由柱孢属真菌侵染引起的三七根腐病标样中，分离到相应的柱孢属真菌，分离培养7-15，分离频率(一次分离中所获得的病原微生物的菌株数占分离所用样品数的百分数)达150％以上，弥补了现有技术分离三七根部病害柱孢属真菌的分离频率仅有10％的不足，分离方法操作简单，成本低廉，有助于推进三七根腐病柱孢属真菌的研究与防治。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1、材料与方法
(1)原料的准备
到三七田间采集根部发生褐色、黑色和锈色腐烂的植株，在8小时内，带回实验室，或不能在8小时内带回实验室，应在0-5℃下保存。
(2)培养基的制作
制作PSA和PDA培养基1000mL，分别加入NaFeEDTA(Milipore Sigma，德国)1、2、3、4mmol，以不加入NaFeEDTA的纯PDA培养基和纯PSA培养基为对照(CK)，121℃，灭菌20min，取出，在超净工作台上，倒入灭菌培养皿(D＝9mm)中，冷却，备用。
(3)根腐病材料的处理
将三七根腐病材料用自来水洗净，小心，不要碰到腐烂部位，凉干，在超净工作台上，取1g黑腐、褐腐和锈腐的三七病组织(5mm×5mm)，用75％酒精消毒2min，用无菌水清洗3次，将病组织放入10mL无菌离心管中，加入1mL无菌水，用灭菌摄子捣碎至浆状，用无菌水定容至10mL；用2层灭菌纱布过虑，取100μL，加至2mL无菌离心管中，再加入900μL无菌水，振荡混均后，即为10-2稀释液；以同样的方法，稀释到10-4备用；
(4)涂平板
取上述已准备好的10-2，10-3，10-4稀释液100μL，加入到含有NaFeEDTA的PDA平板上和PSA平板上，用灭菌玻璃拖棒，涂布均匀，每种稀释液涂布5皿。在FeSO4浓度为4mmol·L-1的PDA培养基和PSA培养基上，涂布10-2释液，以比较Fe2+和Fe3+对分离到的柱孢属真菌的影响。
(5)培养
用封口膜(美国)将涂布好三七根腐病标样稀释液的培养皿封好接合部，黑暗条件下，25℃恒温培养。
(7)观察、记数及数据分析
15天后，取出培养皿，观察菌落形态，记录锈色菌落的数目，将数据录入Excel后，导入SPSS17.0中，进行显著性分析。
随机取锈色菌落15个，分别提取基因组DNA进行PCR检测，以确定菌种属。连续5天均随机取锈色菌落15个，重复相同的PCR鉴定操作。采用美国Omega真菌试剂盒Fungal DNAKit提取基因组DNA。病原菌ITS的PCR扩增：利用引物对ITS1F和ITS4(参见文献毛忠顺，等，西北农林科技大学学报(自然科学版),2014,42(08):169-177)进行ITS-PCR扩增。PCR扩增采用50μL体系：引物ITS1F/ITS4 0.2μmol/L，Taq DNA聚合酶2U，模板DNA2μL，不足部分用无菌超纯水补足。扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃最终延伸7min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(70V，65min)检测，符合预期片段大小(约600bp)后，进行纯化和测序。测序结果采用Chromas 2.4.1、SeqMan、SeqBuilder分析校对后，在NCBI上进行BLAST比对，通过比对分析、剪辑，获得确切的ITS片段，再在NCBI数据中进行再进BLAST比对，即可发现与目的基因相似度(Identity)在100％的柱孢真菌的物种，从而在分子水平确定分离得到的微生物为柱孢属真菌。结果发现，连续5天，每天随机取的15个锈色菌落，均鉴定为柱孢属真菌。
2、结果
(1)NaFeEDTA对柱孢属真菌菌落产生数量的影响
在PDA上和PSA上(均不含NaFeEDTA)，根腐病标样稀释倍数从10-2-10-4都没有长出锈色、栗色、咖啡色、褐色或是黑褐色的菌落，说明不能分离到柱孢属真菌。
而在含有NaFeEDTA的PDA培养基上，随着NaFeEDTA浓度的增加，三七根腐病标样稀释液在PDA上长出的菌落数不断增加。同时，而且随着稀释液浓度的增加，产生的菌落数也不断增加。在NaFeEDTA的浓度为4mmol·L-1，稀释液浓度为10-2时，PDA上产生的菌落数最多，平均为16.4(见表1)，当NaFeEDTA的浓度为4mmol·L-1时，稀释液浓度为10-2时，PSA上产生的菌落数最多，平均为14.5(见表2)。
表1三七根腐病标样在NaFeEDTA平板上长出的菌落数
不同小写字母表示在5％的水平，差异达到显著。
表2三七根腐病标样在NaFeEDTA平板上长出的菌落数
不同小写字母表示在5％的水平，差异达到显著。
(2)NaFeEDTA和FeSO4对分离柱孢真菌能力的影响
在相同浓度的PDA培养基上，含有NaFeEDTA的培养基上长出的菌落数，比含有FeSO4的PDA上长出的菌落数多(见表3)。
表3不同化合价态铁离子对产生柱孢属真菌菌落数的影响
实施例2不同病原菌分离方法对柱孢属真菌分离频率的影响
(1)组织分离法
将三七根腐病块根洗净后，无菌条件下于根部病健交界处切取大小为5mm×5mm的组织块，用体积分数75％酒精消毒30s，体积分数2.5％次氯酸钠水溶液消毒1min，无菌水清洗3次。在超净工作台上，用无菌滤纸吸干水分后移至PSA平板中，每皿接种5块，重复3次，置于培养箱中25℃恒温培养，每24h观察1次。
(2)本发明实施例1的方法
将三七根腐病材料用自来水洗净，小心，不要碰到腐烂部位，凉干，在超净工作台上，取1g黑腐、褐腐或锈腐的三七病组织(5mm×5mm)，用75％酒精消毒2min，用无菌水清洗3次，将病组织放入10mL无菌离心管中，加入1mL无菌水，用灭菌摄子捣碎至浆状，用无菌水定容至10mL；用2层灭菌纱布过虑，取100μL，加至2mL无菌离心管中，再加入900μL无菌水，振荡混均后，即为10-2稀释液；以同样的方法，稀释到10-4备用；取上述已准备好的10-2，10-3，10-4稀释液100μL，加入到含有Fe3+(4mmol·L-1)的PSA平板上，用灭菌玻璃拖棒涂布均匀，每种稀释液涂布5皿。
结果：用组织分离法来分离三七黑腐、褐腐和锈腐样品的病原菌，其分离结果较为不稳定，而用本发明实施例1的方法可以有效地分离到目的病原微生物(见下表4)。分离频率为一次分离中所获得的病原微生物的菌株数占分离所用样品数的百分数，即分离频率(％)＝(所得病原微生物菌株数/分离所用样品数)×100％。
表4不同分离方法的分离频率
从上表可以看出，用组织分离法在某次重复时会获得一个目的菌落，其平均分离频率为6.67％。而用本发明方法，稀释到10-4倍时，仍能获得目的菌落，而且，基本上每一皿都会有目的菌落产生，其平均分离频率到153.3％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种三七根部病害柱孢属真菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将黑腐、褐腐或锈腐的三七病组织表面消毒后，用无菌水清洗，
(2)加入无菌水将三七病组织捣碎至浆状，过滤弃滤渣，
(3)过滤液中再加入无菌水，逐次梯度稀释，
(4)将多个梯度的稀释液分别加入含Fe3+的PDA或PSA培养基上，黑暗条件下恒温培养，待培养基上有锈色、栗色、咖啡色、褐色或是黑褐色的菌落即为三七根部病害柱孢属真菌。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中的三七病组织大小为(4-8)mm×(4-8)mm。
3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中采用75％酒精消毒2min。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)是将三七病组织放入10mL无菌离心管中，加入1mL无菌水，用灭菌摄子捣碎至浆状，用无菌水定容至10mL；用2层灭菌纱布过滤，取100μL滤液。
5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于，滤液加至2mL无菌离心管中，再加入900μL无菌水，振荡混均后，即为10-2稀释液；以同样的方法，稀释到10-4。
6.如权利要求1-5任一所述的分离方法，其特征在于，含有Fe3+的PDA或PSA培养基中，Fe3+的浓度为1-4mmol·L-1。
7.如权利要求6所述的分离方法，其特征在于，PDA或PSA培养基中含2-4mmol·L-1的Fe3 +。
8.如权利要求1-7任一所述的分离方法，其特征在于，步骤(4)中，黑暗条件下恒温23-28℃培养7-15天。
9.一种培养基，其特征在于，其为含有Fe3+的PDA或PSA培养基。
10.权利要求9所述的培养基在分离人参属植物根部柱孢属真菌中的应用。
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