CN106010986A - 一种柑桔流胶病的分离鉴定方法 - Google Patents

一种柑桔流胶病的分离鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柑桔枝干流胶病的分离鉴定方法，包括：选取采集的柑桔枝干，将枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干横截面，选取部分显褐色横截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流胶病和无流胶病交界处；将茎段放入选择性培养基中，在10℃光照培养箱中培养4‑5天，挑取白色菌丝进行纯化、保存。本发明提供了一种柑桔流胶病的病原菌的分离、培养和鉴定方法，实现了柑桔流胶病的病原菌的体外分离和培养，并能实现柑桔流胶病的病原菌鉴定。

Description

一种柑桔流胶病的分离鉴定方法
技术领域
本发明属于植物病原菌分离技术领域，尤其涉及一种柑桔流胶病的分离鉴定方法。
背景技术
柑桔流胶病主要发生在主干上，其次为主枝，小枝上也可发生。病斑不定型，病部皮层变褐色，水渍状，并开裂和流胶。病树果实小，提前转黄，味酸。以高温多雨的季节发病较重，菌核引起的流胶以冬季为重。果园长期积水、土壤黏重、树冠郁闭有利其发生。
现有的柑桔流胶病病原菌分离困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柑桔流胶病的分离鉴定方法，旨在解决因柑橘流胶病病部湿度大，在病部极易附着大量的腐生菌，在进行一般组织分离时，由于其主要病原菌寄生疫霉的生长速度较慢，而杂菌生长速度较快，加上病原菌对营养成分的选择性，使其极难分离出来的问题。
本发明是这样实现的，一种柑桔流胶病的分离鉴定方法，所述柑桔流胶病的分离鉴定方法包括以下步骤：
步骤一，选取采集的柑桔枝干，将枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干横截面，选取部分显褐色横截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流胶病和无流胶病交界处；
步骤二，将茎段放入选择性培养基中(燕麦片28g，琼脂24g，水1000ml，混合煮沸，分装三角瓶中灭菌，冷却至45℃，加氨苄青霉素，利福平，多菌灵)培养基利用，在10℃光照培养箱中培养4-5天，挑取白色菌丝进行纯化、保存。
进一步，所述步骤二之后对病原菌的电子显微镜检测和病原菌的PCR鉴定。
进一步，所述选择性培养基的制备方法包括：燕麦片28g，琼脂24g，水1000ml，混合煮沸，分装三角瓶中灭菌，冷却至45℃，利用氨苄青霉素抑制细菌杂菌生长，加250mg，利用利福平防杂菌污染，加10mg，利用多菌灵防止霉菌污染，加100mg。
进一步，所述病原菌的PCR鉴定方法包括：
通过氯仿/异戊醇法抽提菌株的基因组DNA，用ITS1/ItTS4两个通用引物进行PCR扩增，得到rDNA片段，产物经回收并测序，将所得到的序列登录到网站进行BLAST比对，该菌株rDNA为寄生疫霉；另外一株菌为厚垣镰刀菌，可参与侵染。
本发明提供的柑桔流胶病的分离鉴定方法，可以最大程度上减小枝干流胶病部周边腐生菌造成的分离困难；提供了一种柑桔流胶病的病原菌的分离、培养和鉴定方法，实现了柑桔流胶病的病原菌的体外分离和培养，并能实现柑桔流胶病的病原菌鉴定。
附图说明
图1是本发明实施例提供的柑桔流胶病的分离鉴定方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的柑桔流胶病的分离鉴定方法包括以下步骤：
S101：选取采集到的柑桔枝干，将枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干横截面，选取部分显褐色横截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流胶病和无流胶病交界处；
S102：将茎段放入选择性培养基中，在10℃光照培养箱中培养4-5天，挑取白色菌丝进行纯化、保存；
S103：病原菌的电子显微镜检测和病原菌的PCR鉴定。
所述选择性培养基的制备方法包括：燕麦片28g，琼脂24g，水1000ml，混合煮沸，分装三角瓶中灭菌，冷却至45℃，利用氨苄青霉素抑制细菌杂菌生长，加250mg，利用利福平防杂菌污染，加10mg，利用多菌灵防止霉菌污染，加100mg。
病原菌的PCR鉴定方法包括：
通过氯仿/异戊醇法抽提菌株的基因组DNA，用ITS1/ItTS4两个通用引物进行PCR扩增，得到rDNA片段，产物经回收并测序，将所得到的序列登录到网站进行BLAST比对，该菌株rDNA ITS核苷酸序列比对结果为SEQ ID NO：1；
TACACCATAAAACTTTCACGTGAACCGTTTCACCCAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGCGGCGGCTGCTGGCTTAATTGTTGGCGGCTGCTGCTGAGTGAGCCCTATCAAAAAAAAGGCGAACGTTTGGGCTTCGGCCTGATTTAGTAGTCTTTTTTTCTTTTAAACCCATTCCTTAATACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATTAAACTTGACTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGATGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGATTGGTCTTCGGACCGGCTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTAAACTGAACTTCTCTTTGCTCGAAAAGTGGTGGCGTTGCTGGTTGTGAAGGCTGCTATTGTGGCAAATTGGCGACTGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTAATGGAAGAGTGTTCGATTCGTGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAATGCACTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGACTGGTGAACCATAGCTCGGTGGCTTGGCTTTTGAATTGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGGGTGGCAGCTTCGGTTGTCGAGGGTCGATCCATTTGGGAACTTAATGTGTACTTCGGTATGCATCTCAATTGGACCTGATATCACGCAAGATTACCCGCTGAACTTAAGCTAA
经blast比对，为寄生疫霉
另外一株菌的序列为SEQ ID NO：2
GGGACGGGTCACTCCAACCCCTGTGACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAAAGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAAAACGCACCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCATTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCAAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCACCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCAAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA
为厚垣镰刀菌，可参与侵染，引起流胶病。
菌丝块接种离体冰糖橙叶片
用1mL移液器吸头将寄生疫霉菌固体培养基打孔，形成大小一致的菌丝块，用牙签将菌丝块接种在展开的冰糖橙叶片或茎杆上，滴加适量的灭菌蒸馏水，以使菌丝块紧密贴附在叶子过茎杆表明，叶柄或茎杆基部用湿润的脱脂棉包裹，将叶片或茎杆放于底部铺有滤纸的托盘中，用保鲜膜封好保湿，25℃度培养，4天左右可有明显症状。同时分离出来的厚垣镰刀菌，可参与复合侵染，引起离体叶片及茎杆发病。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种柑桔流胶病的分离鉴定方法，其特征在于，所述柑桔流胶病的分离鉴定方法包括以下步骤：
步骤一，选取采集的柑桔枝干，将枝干表面用75％酒精擦拭消毒、晾干，用消毒剪刀剪出枝干横截面，选取部分显褐色横截面，表面消毒后，取柑桔枝干有流胶病和无流胶病交界处；
步骤二，将茎段放入选择性培养基中，在10℃光照培养箱中培养4-5天，挑取白色菌丝进行纯化、保存。
2.如权利要求1所述的柑桔流胶病的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤二之后对病原菌的电子显微镜检测和病原菌的PCR鉴定。
3.如权利要求1所述的柑桔流胶病的分离鉴定方法，其特征在于，所述选择性培养基的制备方法包括：燕麦片28g，琼脂24g，水1000ml，混合煮沸，分装三角瓶中灭菌，冷却至45℃，利用氨苄青霉素抑制细菌杂菌生长，加250mg，利用利福平防杂菌污染，加10mg，利用多菌灵防止霉菌污染，加100mg。
4.如权利要求1所述的柑桔流胶病的分离鉴定方法，其特征在于，所述病原菌的PCR鉴定方法包括：
通过氯仿/异戊醇法抽提菌株的基因组DNA，用ITS1/ItTS4两个通用引物进行PCR扩增，得到rDNA片段，产物经回收并测序，将所得到的序列登录到网站进行BLAST比对，该菌株rDNA为寄生疫霉；另外一株菌为厚垣镰刀菌，可参与侵染。
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CN102690759A (zh) * 2012-06-05 2012-09-26 安徽农业大学 加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法
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Title
刘娟 等: "金柑流胶病致病菌的分离与鉴定", 《中国南方果树》 *

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