CN104403952B - 一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用 - Google Patents

一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用。所述菌核侧耳新菌种为菌核侧耳(Lentinus tuber‑regium)GIM‑L‑001，保藏编号为CCTCC NO.M2014392。菌核侧耳CCTCC M2014392的栽培方法包括将菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392的栽培种接入栽培袋中，栽培培养并管理采收。本发明的有益效果是：本发明提供一种菌核侧耳新菌种，该菌种来自于广州帽峰山阔叶林中腐木上，并且还提供了相应的人工栽培方法及相应的应用。该菌核侧耳新菌种具有抑菌活性，丰富了菌种品种，具有很好的社会效益。

Description

一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用
技术领域
本发明涉及一种菌核侧耳新菌种及其栽培方法和应用。
背景技术
菌核侧耳，又称虎奶菇，核耳菇，茯苓侧耳，日本人称南洋茯苓，为药食兼用菇，典型的高温型食药用菌，按照最新的分类系统，其拉丁学名为Lentinus tuber-regium(Fr.)Fr.，隶属于Basidiomycota(担子菌门)，Agaricomycotina(伞菌亚门)，Agaricomycetes(伞菌纲)，Polyporales(多孔菌目)，Polyporaceae(多孔菌科)，Lentinus(香菇属)，为具菌核真菌，与茯苓(子实体不可食)、猪苓(菌核不可食)不同，其子实体与菌核都可食用。菌核侧耳为热带真菌，主要分布在热带和亚热带地区，云南，海南，广东等地，生长于倒木或腐木桩或树根处。
据相关记载，民间多使用菌核侧耳的菌核治疗胃病、便秘、发烧、感冒、水肿、胸痛、痔疮、神经系统疾病、天花、哮喘、糖尿病、冠心病、高血压、肿瘤等疾病，及用于营养失调的婴孩。目前，关于菌核侧耳菌种方面的研究多为虎奶菇菌核，而关于菌核侧耳专利申请主要是关于以菌核侧耳为材料或添加剂制成的保健品及药品，或者已有菌核侧耳菌种(如虎奶菇)的栽培方法。本申请是在广州帽峰山阔叶林中腐木上发现并分离的新菌种，经研究，未见关于该菌种的研究报道。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种新的菌核侧耳菌种。
本发明的菌核侧耳新菌种分离自广州帽峰山阔叶林中腐木上，经形态学和分子生物学鉴定为菌核侧耳新菌种，并通过对子实体部分进行组织分离获得原始菌株，命名为菌核侧耳(Lentinus tuber-regium)GIM-L-001，已于2014年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市洪山区八一路武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO.M2014392。
本发明还提供了上述的菌核侧耳CCTCC M2014392的栽培方法，包括将菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392的栽培种接入栽培袋中，栽培培养并管理采收。
进一步的，上述菌核侧耳新菌种的栽培方法具体包括：
一种菌核侧耳新菌种的栽培方法，将栽培料装入聚乙烯折角袋中得到栽培袋，套上塑料颈圈和盖子，灭菌，待栽培料温度下降至30℃以时下接入栽培种，转移至28℃-30℃室内培养，培养至菌丝长满栽培袋时(此过程约50天左右)，去掉塑料颈圈和盖子，调节湿度至88％-85％，光照100-200lux，通气，至长出子实体(此过程约需要30天左右)，所述栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78-80％、麸皮18-20％、CaCO31-2％，含水量70-75％。
进一步的，上述菌核侧耳菌种CCTCC NO.M2014392的栽培种的制备步骤包括：组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作栽培种。
进一步的，上述菌核侧耳菌种CCTCC NO.M2014392的栽培种的制备步骤具体包括：
(1)制作母种：采集组织分离的菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392，将菌种无菌接至改良PDA斜面，置于28℃培养箱中恒温培养，直至菌丝长满斜面即得母种，其中所述改良PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、维生素B1微量、酸水解酪蛋白1％，其余为水；
(2)制作原种：将母种无菌接入原种瓶中，置于28℃培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱98％、CaCO32％、含水量60％，将所述原种料装入玻璃瓶中，制得原种瓶；
(3)制作栽培种：将原种无菌接入栽培种袋中，置于28℃培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料后即得栽培种，其中栽培种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳73％、麸皮25％、CaCO32％，含水量65％，将所述栽培种料装入折角袋中，盖上食用菌套环，制得栽培种袋。
该菌核侧耳CCTCC M2014392的子实体具有以下的形态特征：
子实体群生于腐木上，革质，干后易碎，菌盖漏斗状，直径7-13cm，表面黄褐色，被有密生短绒毛，中部颜色稍淡，老熟后盖缘成波浪状，部分裂开，菌肉白色，坚硬，极薄，1-2mm，菌褶茶褐色，延生，极密，褶幅窄，菌柄中生，长8-15cm，下粗上细，上部1-1.5cm，下部1-2cm，黄褐色，密生短绒毛。孢子印白色，孢子在光学显微镜下无色，透明，孢子椭圆形，3.1-5.83×6.57-8.93μm。
经分子生物学测定其ITS分子序列(Genbank登记号：KM405793)的分析结果为Lentinustuber-regium(Fr.)Fr.。结合ITS分子序列比对结果和形态学观察，与现有的菌核侧耳菌种相似度最高达到99％，但是仍存在差异，且该菌种野外分离子实体和人工驯化得到的子实体都与已有文献记载的子实体存在差异，此菌种的野外子实体老熟后盖缘波浪状，有裂纹，且担孢子稍大，出菇子实体菌柄和菌盖有部分颗粒状鳞片，与现有文献记载的所有菌核侧耳的子实体性状都不同，因而为菌核侧耳新菌种。
本发明还提供上述菌核侧耳新菌种(菌核侧耳CCTCC M2014392)在制备抑菌药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供一种菌核侧耳新菌种，该菌种来自于广州帽峰山阔叶林中腐木上，并且还提供了相应的人工栽培方法及相应的应用。该菌核侧耳新菌种具有抑菌活性，丰富了菌种品种，具有很好的社会效益。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
菌核侧耳新菌种，分离自广州帽峰山阔叶林中腐木上，经形态学和分子生物学鉴定为菌核侧耳新菌种，通过对子实体部分进行组织分离获得原始菌株，命名为菌核侧耳(Lentinus tuber-regium)GIM-L-001，已于2014年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市洪山区八一路武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO.M2014392。
该菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的特点是：生长速度快，12天左右菌丝即可覆满试管(18×180mm)，菌丝生长温度15-40℃，最适生长温度28-30℃，菌丝生长pH 5.5-7，最适pH 6.5。
实施例2
菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的栽培种的制备方法：
(1)制作母种：采集组织分离的菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392，将菌种无菌接至改良PDA斜面，置于28℃培养箱中恒温培养，直至菌丝长满斜面即得母种，这一过程大约12天左右，菌丝生长情况为：菌丝白色，浓密，不形成棒状结构及子实体；
其中所述改良PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、维生素B1微量、酸水解酪蛋白1％，其余为水；
(2)制作原种：将母种无菌接入原种瓶中，置于28℃培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料后即得原种，生长周期约为25-30天；
其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱98％、CaCO32％、含水量60％，将所述原种料装入玻璃瓶中，制得原种瓶；121℃高压灭菌25min，冷却后使用；
(3)制作栽培种：将原种无菌接入栽培种袋中，置于28℃培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料后即得栽培种，这一过程约需30-40天；
其中栽培种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳73％、麸皮25％、CaCO32％，含水量65％，将所述栽培种料装入折角袋(15*35cm)中，盖上食用菌套环，制得栽培种袋，，128℃条件下灭菌120min，冷却后使用。
实施例3
菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的栽培方法：
将栽培料按照比例混匀后装入17*35cm聚乙烯折角袋中，得到栽培袋，使用打孔器打孔10cm，套上塑料颈圈和盖子，使用高压蒸汽灭菌锅，1.5kg/cm2灭菌2小时，灭菌结束后待栽培料冷却到30℃以下接入栽培种，转移至28℃-30℃室内培养，大约培养50天左右，菌丝长满栽培袋，去掉塑料颈圈和盖子，调节湿度至88％-85％，光照100-200lux，及时通气，约30天左右即可形成子实体，采摘。
栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78-80％、麸皮18-20％、CaCO31-2％，含水量70-75％。
实施例4
1、菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的保藏
试验证实，菌核侧耳菌种CCTCC M2014392适合于在改良PDA培养基(添加了酸水解酪蛋白的PDA培养基)中保存，8-10℃冰箱中避光保存，改良PDA培养基的配方为按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、维生素B1微量、酸水解酪蛋白1％，其余为水。
2、菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的保藏的培养基的比较：
通过采用四种培养基进行试验，发现改良PDA培养基最适合于菌核侧耳菌种CCTCCM2014392的保藏，按质量百分比计为，四种培养基配方分别为：
改良PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、维生素B1微量、酸水解酪蛋白1％，其余为水；
普通PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、维生素B1微量，其余为水；
加富PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.2％、维生素B1微量，其余为水；
MMN培养基：氯化钠0.0025％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.05％，麦芽浸粉0.3％，维生素B10.00001％，氯化钙0.005％，磷酸氢二铵0.025％，氯化铁0.0012％，七水硫酸镁0.015％，其余为水，pH5.8。
试验结果：改良PDA培养基不利于菌核及子实体的形成，但菌丝生长浓密，而且能较深地生长到培养基内部，因此，最适合试管种的保藏；而普通PDA和加富PDA都形成了菌核或子实体，而且菌丝生长较稀疏，MMN培养基生长速度慢且形成菌核，均不利于试管种的保藏。
实施例5
菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的抑菌活性
本实施例的所有实验器具均在121℃条件下灭菌30min或紫外灭菌30min。
1、制备发酵液培养基：发酵液培养基的配方按质量百分比计为黄豆粉2.0％、甘露醇2.5％、酵母粉0.1％、磷酸二氢钾0.1％、其余为水，按上述配方配制发酵液培养基，并调节pH到7.0，分装倒入三角瓶，于121℃高压灭菌30min后冷却备用；
2、接种及培养：取菌核侧耳菌种CCTCC M2014392(试管斜面菌种)0.5*0.5cm大小的菌丝块4-5块，无菌接入步骤1准备好的发酵液培养基中，于30℃，160rpm条件下避光振荡培养6d，培养完成。
3、发酵液浓缩：
将培养完成的发酵液经过抽滤，将菌丝体等固体物质过滤除去，得到滤液，然后使用旋转蒸发仪在60℃，75rpm条件下浓缩至无液体凝出，浓缩液按照1：4的比例加入无水乙醇，于4℃条件下静置24h后取出，再次抽滤，得到的滤液再次使用旋转蒸发仪在60℃，75rpm条件下浓缩至无液体凝出，按照1：4的比例加入无水乙醇，于4℃条件下静置24h后取出，再次抽滤，得到的滤液使用旋转蒸发仪在60℃，75rpm条件下浓缩至无液体凝出，得到浓缩后的发酵液，冷却后放4℃冰箱暂存备用，该浓缩后的发酵液作为样品1，然后取部分该浓缩后的发酵液，经0.22微米滤膜过滤，得到过滤后的浓缩后的发酵液，作为样品2。
4、指示菌的制备：
购买金黄色葡萄球菌(菌种编号ATCC6538，广东环凯微生物科技有限公司)，按照使用说明进行培养，得到斜面菌种后再划线转接平板营养培养基(配方：蛋白胨1％，牛肉膏粉0.3％，氯化钠0.5％，琼脂粉1.5％，pH7.3)上，于37℃避光条件下培养24小时，加入无菌水制成菌悬液，调节菌悬液浓度至106cfu/ml即得，储存至4℃冰箱备用。
5、抑菌检测：
配制营养培养基，其配方为按照质量百分比计：牛肉膏粉0.3％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、琼脂粉1.5％，其余为水，然后在121℃下高压灭菌30min，待温度降至50℃时取出倒平板(直径90mm)，待营养培养基凝固后使用加入步骤4准备好的菌悬液(浓度106cfu/ml)10微升，将菌悬液涂布均匀，然后将牛津杯(直径5mm)放置在培养基中间，最后分别加入步骤2准备好的样品1和样品2，以及加入阴性对照样品无菌水、加入阳性对照样品青链霉素(浓度：青霉素含量100U/ml，链霉素含量0.1mg/ml)，每个待检样品6次重复，于36℃恒温培养24小时后测量其抑菌圈。
6、抑菌效果：测量抑菌圈直径，得到结果如表1所示。
表1：各样品的抑菌圈直径
样品1 抑菌圈直径 样本2 抑菌圈直径 无菌水 抑菌圈直径
重复1 4.00 重复1 3.15 重复1 0
重复2 2.95 重复2 2.85 重复2 0
重复3 3.20 重复3 2.75 重复3 0
重复4 3.30 重复4 2.80 青链霉素 抑菌圈直径
重复5 3.25 重复5 2.55 重复1 8.5
重复6 3.10 重复6 2.85 重复2 8.5
平均值 3.30 平均值 2.825 重复3 8.5
从表1的结果可知，菌核侧耳菌种CCTCC M2014392的发酵液以及过滤的发酵液液均具备抑菌效果，对照组无菌水无抑菌效果，而青链霉素具备较强的抑菌效果。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种菌核侧耳新菌种，所述菌核侧耳新菌种为菌核侧耳GIM-L-001，保藏编号为CCTCC NO.M2014392。
2.一种如权利要求1所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，包括将菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392的栽培种接入栽培袋中，栽培培养并管理采收。
3.一种如权利要求2所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，将栽培料装入聚乙烯折角袋中得到栽培袋，套上塑料颈圈和盖子，灭菌，待栽培料温度下降至30℃以下时接入栽培种，转移至28℃-30℃室内培养，培养至菌丝长满栽培袋时，去掉塑料颈圈和盖子，调节湿度至88％-85％，光照100-200lux，通气，至长出子实体，所述栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78-80％、麸皮18-20％、CaCO3 1-2％，含水量70-75％。
4.一种如权利要求2所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，所述菌核侧耳菌种CCTCC NO.M2014392的栽培种的制备步骤包括：组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作栽培种。
5.一种如权利要求4所述的菌核侧耳新菌种的栽培方法，其特征在于，所述菌核侧耳菌种CCTCC NO.M2014392的栽培种的制备步骤包括：
(1)制作母种：采集组织分离的菌种菌核侧耳CCTCC NO.M2014392，将菌种无菌接至改良PDA斜面，置于28℃培养箱中恒温培养，直至菌丝长满斜面即得母种，其中所述改良PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、维生素B1微量、酸水解酪蛋白1％，其余为水；
(2)制作原种：将母种无菌接入原种瓶中，置于28℃培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱98％、CaCO3 2％、含水量60％，将所述原种料装入玻璃瓶中，制得原种瓶；
(3)制作栽培种：将原种无菌接入栽培种袋中，置于28℃培养箱中恒温培养，至菌丝吃满料后即得栽培种，其中栽培种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳73％、麸皮25％、CaCO3 2％，含水量65％，将所述栽培种料装入折角袋中，盖上食用菌套环，制得栽培种袋。
6.如权利要求1所述的一种菌核侧耳新菌种在制备抑菌药物中的应用。
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东华虎奶-1号的生物特性及其;陈传红等;《食用菌》;20051231(第1期);14-15 *
菌核侧耳栽培技术;余志坚等;《江西园艺》;20051231(第3期);24-25 *
虎奶菇的特性及野外袋料覆土栽培;丁湖广;《特种经济动植物》;20081231(第11期);42-43 *

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