CN110656053A - 一种鳞伞属新菌种及其人工栽培方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及珍稀食用菌新菌种及其人工栽培方法和用途,尤其涉及鳞伞属新菌种Pholiotasp.及其人工栽培方法和用途。本发明的鳞伞属新菌种采自广东车八岭国家级自然保护区,经鉴定为鳞伞属的新菌种,并且组织分离获得原始菌株,命名为鳞伞(Pholiota sp.)HMGIM‑W140054,于2019年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:中国武汉),保藏编号为CCTCC NO:M 2019414。本发明的新菌种,已经实现人工驯化栽培,对葡萄球菌表现出更加强烈和显著的抑制率,并且具有很高的组氨酸含量、粗多糖含量和钾含量,是一种营养成分丰富、栽培产量高的具有开发前景的新种。
Description
技术领域
本发明涉及珍稀食用菌新菌种及其人工栽培方法和用途,尤其涉及鳞伞属新菌种及其人工栽培方法和用途。
背景技术
目前,食药用菌的产业发展迅猛,据中国食用菌协会统计,2017年我国食药用菌的产量达到3712万吨,比2016年增长了3.21%,产值为2721.92亿元,我国占全球75%以上,从业人员超过2000万人,食用菌产业在种植业中排在除了粮、菜、果、油之后的第五位,超过了茶叶和蚕桑。
在食药用菌产业蓬勃发展的今天,越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野,许多原有的珍稀品种逐渐被驯化,如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识,没有得到研究。
据研究,目前世界上约有300多万种真菌物种,仅仅有1%的物种被认识,其中已知的大型真菌约14000种,国内已确认的食用菌有1789种,药用菌798种,而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化,规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。随着人们生活水平的逐步上升,对于生活品质的要求更高,而大型真菌由于其富含具有营养及功能作用的各种成分,包括真菌多糖、三萜类、甾醇等,对于人体健康具有非常良好的作用,日益受到人们的重视。
鳞伞属(Pholiota)属于担子菌门(Basidiomycota),蘑菇纲(Agaricomycotina),蘑菇目(Agaricus),球盖菇科(Strophariaceae)。鳞伞属是Kummer于1871年建立的,模式种为Pholiota squarrosa(Fr.)Kumm。球盖菇科是Overeem于1927年建立的,1946年Singer&Smith发表时球盖菇科含有包括鳞伞属在内的8个属,期间该科分类一度出现较大争议,但是鳞伞属在该科内一直都属于独立的属或亚科。
1871年Kummer将Fries1821年建立的鳞伞族Trib.Pholiota(含16种)和火菇族Trib.Flammula(含15种)两个族分别提升为属,即Pholiota(Fr.)P.Kumm.和Flammula(Fr.)P.Kumm.。Fries当时认为鳞伞族和火菇族的区别在于菌环的质地及是否易脱落等特征,但1874年他又改变了此说法,认为二者无明显的界限。1886年Quelet建议将这两个族归入Dryophila属中作为亚属,即鳞伞亚属Subgen.Pholiota和火菇亚属Subgen.Flammula。此后,虽然与他们同时期的分类学家们对于这两个族的分类地位问题争论不休,但大多数人还是支持Kummer的观点,因此该观点逐渐占据主导地位。Singer和Smith(1946)对产生这种分歧的原因进行了分析,认为分类学家们之所以争论不休,主要是因为鳞伞属和火菇属Flammula之间的差别太小,没有更充分的证据来支持某一种观点。Singer试图用系统树来区分这两个类群,他的这种理念对真菌分类的发展无疑是一种积极的推动作用,随后的许多作者都采用了他的系统分类观点。
鳞伞属属下分类系统也一直是真菌分类学家们争论不休的问题,不同的分类学家提出不同的方案,且各持己见。Singer(1963)用数据详细地分析了整个群体,并将鳞伞属分为3亚属12组。Smith和Hesler(l968)认为Singer的典型种的研究方法并不能全面合理地反映这一类群,而且这种方法也不能对更大的类群进行比较性研究,因此难以在细节上应付更大的属。鉴于此,他们提出了自己的观点,即将所有具有“孢子印锈褐色或黄褐色,孢子光滑,顶端有芽孔,以及内菌幕以丛毛状存在于菌柄上“特征的种都放入鳞伞属中,并下设7亚属16组48系。Bas(1971)不赞同Smith和Hesler的观点,认为他们将属的范围限定得过宽,范围越宽特征的变化就越大,从而使与鳞伞属相关的且相对不重要的属与其分离,这样不利于鳞伞属分类的发展。Singer(1975)驳斥了Smith和Hesler关于分类系统的观点,认为它并不是一个自然的属下分类等级,主张将球盖菇科分为许多个小属,从而使系统发育的关系更清楚。因此他对鳞伞属的分类系统作了进一步的修订,将其分为5亚属14组和25系。Hawksworth等(1983,1995)均采用了Singer(1975)的分类系统。Jacobsson(1990)也认为Smith和Hesler分类系统中属的范围过宽,易将其他属的种归入鳞伞属中,因此并不赞同他们的观点,并提出了6亚属13组的属下分类系统。Kirk等(2001,2008)采用的是Jacobsson(1990)的分类系统。Smith(1979)在其文章中仍坚持自己的观点,强调属的范围宽窄不影响系统发育的关系。
关于鳞伞属属下及相近属间的分类依据,许多分类学家们都提出了各自的观点。Smith和Hesler(1968)认为菌盖的颜色及表面特征、菌肉及菌褶的颜色、菌柄的表面特征及菌幕的特征是鳞伞属重要的宏观特征;而孢子的大小及形状、孢壁的状态、侧生囊状体的有无及类型、菌盖表皮结构及柄生囊状体的有无等则是鳞伞属重要的微观特征。Singer(1975)认为梅氏试剂(Melzer's reagent)中孢子壁的变化,孢子顶端的结构、表面纹饰,孢子印的颜色、囊状体及子实层体和上表皮层菌丝的凝胶化等特征可作为鳞伞属属下重要的分类依据。Pegler(1971)强调只有在不同条件下观察的孢子壁状态、孢子印的确切颜色及孢子顶端的变化等特征才能更好地区分鳞伞属的种。Jacobsson(1990)则讨论了鳞伞属与球盖菇科其他属的区别,认为孢子印的颜色和孢壁的性质是它们的主要区别。
目前中国真菌志-球盖菇科(2014)记载我国的鳞伞属品种共56种,中国大型菌物资源图鉴(2015)收录了16种,许多品种在分子生物学不断发展后,发现同物异名的情况并进行了订正。
鳞伞属Pholiota中的许多品种,如小孢鳞伞(滑子蘑)P.microspora、多脂鳞伞P.adiposa等都是著名的食用菌,味道鲜美,已经规模化生产。惠丰立等(2003)指出,多脂鳞伞Padiposa子实体中矿物质的含量较高,为一般食用菌的2倍左右。此外,鳞伞属真菌对矿质元素的吸附积累能力较强。Nishimoto和Fujita(1977)指出,栽培小孢鳞伞的枕木中Cd含量与子实体中的含量呈正相关。Kitanovic等(2001)研究表明,翘鳞伞Pholiota squarrosa等木生真菌倾向于吸附K、Fe、Cu等矿质元素。小孢鳞伞子实体对培养料中矿物质K、Na、P、Mg、Cu、Zn、Cd、Ca等有很强的积累能力。
杨珊珊(1988)报道每100g小孢鳞伞干品中维生素的含量为维生素B2 0.05mg、维生素C8.83mg、维生素D0.223mg。惠丰立等(2003)鉴定出多脂鳞伞中含有维生素B1、维生素B2和烟酰胺(VPP)等维生素类物质,其中维生素B2含最为1.5mg/100g,比一般食药用菌的含量(1.229mg/100g)都高,此外还含有大量的麦角固醇(维生素D2的前体)。惠丰立等(2003)证明多脂鳞伞子实体中的氨基酸种类较多(18种),总含量相比其他食药用菌偏高;用必需氨基酸均衡模式衡量,其必需氨基酸组成合理。赵占国和杨秀兰(1985)及苏延友和高丽君(2003)分别测定了子实体的16种和17种氨基酸含量,都得到相似的结果。苏延友(2002)在此研究的基础上又得出结论:多脂鳞伞中氨基酸含量比香菇中的稍低,但比猴头菇中的高很多,其中必需氨基酸含量(6种)多数比后两者高。Mitsuaki(1967)研究了小孢鳞伞的黏液成分:碳水化合物74.2%,其中谷氨酸57.9%、木聚糖6.5%,还含有少量的木酫糖、半乳糖和阿拉伯糖;灰分为18.6%。杨珊珊(1988)对小孢鳞伞中粗蛋白、纯蛋白、脂肪和总糖的含量进行了测定,每100g干品中分别得到33.76g、15.13g、4.03g和38.99g。芮世华(2001)也报道每100g小孢鳞伞鲜品中含量为:蛋白质1.1g、脂肪0.2g、碳水化合物2.5g。
黄年来(1998)报道,小孢鳞伞子实体热水提取物(多糖)对小鼠肉瘤180的抑制率为86.5%,多脂鳞伞子实体多糖对小鼠肉瘤180和艾氏腹水癌的抑制率为80%-90%。此外二者还可预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌和结核杆菌的感染。杨珊珊(1988)指出,小孢鳞伞和多脂鳞伞子实体表面的黏液有助千人体力和脑力的恢复。苏延友等(2004)的实验证明,多脂鳞伞多糖具有免疫增强剂的作用,能有效激活巨噬细胞,通过增强细胞因子分泌、增强NO的产生、增强其吞噬功能及体外杀伤活性等多种途径来调节免疫系统。Sato和Yoshida(1979)从地鳞伞Pholiota terrestris中提取出了油质糖浆(HM-32),它能提高小鼠脾细胞和淋巴细胞的活力。Coulet和Guillot(1972)从翘鳞伞中提取出人类红细胞凝集素,并提出了其在血细胞上的黏合点。Kawagishi等(1991)从金毛鳞伞子实体中分离出凝集素PAA,测出其分子质量、N端氨基酸序列。Furukawa等(1995)从翘鳞伞中提取出了H型血凝素,有助于凝集人类O型血细胞,另外,Ikekawa等(2001)从小孢鳞伞中提取出具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降低血压和降低血糖作用的EEM-S物质。Badalyan(2003)证明,少鳞黄鳞伞Pholiota alnicola有抗氧化活性(AOA),能够抑制小鼠大脑内的过氧化物氧化作用,AOA>20%。
而且鳞伞属绝大多数品种都可以食用,其分解木质素、纤维素、半纤维素能力强,生产出味道鲜美,子实体肥嫩的优质高蛋白低脂肪食品,是富有潜力的食用菌栽培品种。
综合鳞伞属分类及其营养、功能等方面的特点,该属品种当中具有转化潜力的品种值得我们关注。
发明内容
针对以上不足,本发明提供一种针对野生的珍稀食用菌品种鳞伞属新菌种Pholiota sp.及其人工驯化和用途。
本发明通过以下方案达到上述目的:
第一方面,本发明的鳞伞属新菌种采自广东车八岭国家级自然保护区,经鉴定为鳞伞属的新菌种,并且组织分离获得原始菌株,命名为鳞伞(Pholiota sp.)HMGIM-W140054,于2019年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:中国武汉),保藏编号为CCTCC NO:M 2019414。
第二方面,本发明提供一种鳞伞(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的人工栽培方法,包括制作母种,制作生产母种,制作生产种,栽培培养及栽培管理,以重量百分比计,所述栽培料包括28-32%棉籽壳、56-58%木屑、8-12%麸皮、1-2%CaCO3。
在第三方面,本发明提供一种鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物的应用,用于抗细菌引起的相关疾病。
在第四方面,本发明提供一种鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物的应用,用于制备抗细菌引起的相关疾病的药物或用于制备保健品。
在第五方面,本发明提供一种抗细菌引起的相关疾病的药物,包括鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物和载体。
在第六方面,本发明提供一种保健品,包括鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物。
本发明的新菌种,已经实现人工驯化栽培,对葡萄球菌表现出更加强烈和显著的抑制率,并且具有很高的组氨酸含量、粗多糖含量和钾含量,是一种营养成分丰富、栽培产量高的具有开发前景的新种。
附图说明
图1是实施例1的鳞伞属某种(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的野生子实体。
图2是实施例1的鳞伞属某种(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的电子显微镜下的担孢子照片。
图3是实施例1的鳞伞属某种(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的普通光学显微镜下的担子和担孢子照片。
图4是实施例1的基于ITS采用BI法构建的系统发育树。
图5是实施例1的基于ITS采用ML法构建的系统发育树。
图6是实施例1的基于ITS采用NJ法构建的系统发育树。
图7是实施例1的基于LSU采用BI法构建的系统发育树。
图8是实施例1的基于rpb2采用BI法构建的系统发育树。
图9是实施例2的人工驯化的鳞伞属新品种子实体图。
图10是实施例2的人工驯化的鳞伞属新品种子实体的另一图。
图11是实施例3的本发明菌种W140054抑菌圈。
其中,左上为阴性对照;右上为阳性对照;右下为本发明菌种W140054。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
第一方面,本发明的鳞伞属新菌种采自广东车八岭国家级自然保护区,经鉴定为鳞伞属的新菌种,并且组织分离获得原始菌株,命名为鳞伞(Pholiota sp.)HMGIM-W140054,于2019年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:中国武汉),保藏编号为CCTCC NO:M 2019414。
其子实体的ITS序列与柠檬鳞伞(Pholiota limonella)(登记号:KM496470,来源韩国)的相似度最高,为99.2-99.7%,与多脂鳞伞(Pholiota adiposa)(登记号:FJ810180,来源中国)相似度为98.5-98.7%,结合形态学鉴定,该菌株的宏观形态上其与柠檬鳞伞,多脂鳞伞均不吻合,差别较大,多脂鳞伞的形态比该品种要大2倍以上,柠檬鳞伞的担孢子有明显的芽孔,但该品种没有,且这个品种的担孢子要小过柠檬鳞伞。因此,判定本发明的菌株是有别于目前鳞伞属记录的一个新种,命名为鳞伞属的某种(Pholiota sp.)。
本发明的鳞伞属的某种(Pholiota sp.)的宏观形态及微观形态为:菌盖直径1.5~3.5cm,初期扁半球形至半球形,后期平展,中部突起,湿润时胶黏,菌盖为明黄色,具黄色胶质化的软毛鳞片,边缘淡色。菌肉灰白色,中部厚,气味温和。菌褶弯生、直生至稍延生,密,褶幅中等宽,初期淡色,后期赭色。菌柄长5~8cm,直径4~6mm,圆柱形,上下等粗或向上稍细,后期下部黄褐色,干,表面具纤毛,基部具软毛,纤维质,实心。菌环上位,丝膜状,污白色,易脱落。担孢子5.6~7.1×3.5~4.3μm,椭圆形,光滑,芽孔微小,淡黄褐色。
第二方面,本发明提供一种鳞伞(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的人工栽培方法,包括制作母种,制作生产母种,制作生产种,栽培培养及栽培管理,以重量百分比计,所述栽培料包括28-32%棉籽壳、56-58%木屑、8-12%麸皮、1-2%CaCO3。
优选的,上述栽培料的水分含量为60%-65%。
优选的,以重量百分比计,所述栽培料包括31%棉籽壳、58%木屑、10%麸皮、1%CaCO3,水分含量为60%-65%。
优选的,所述栽培培养包括:将生产种转接至栽培料中,25-26℃恒温、遮光培养,湿度60%-70%,菌丝长满菌袋进入栽培管理。
优选的,所述栽培管理包括:
待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后,继续遮光后熟培养25天,进入出菇阶段,控制温度在18-20℃,并加大通风量,保持空间二氧化碳含量在1%以下,空气相对湿度调整至90%以上,经14天后,去除菌盖,菌丝开始扭结并形成淡黄色米柆状原基;原基生长至0.5cm后,继续控制温度在18-20℃,空气相对湿度80-90%之间,每天光照9小时,光照强度300-500lx,并保持空气中二氧化碳浓度350~1500ppm,保持空气湿润,经8天左右,在此期间,每天向幼菇喷施水雾1-2次,直至子实体大小基本不变,子实体菌盖不再长大开始变平展,采收。
优选的,所述制作母种包括:将分离的菌种转接至母种培养基,置于25℃恒温暗培养,待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取,得到母种。
优选的,所述母种培养基为孟加拉红培养基。
进一步优选的,以重量百分比计,所述孟加拉红培养基包括:蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05%、琼脂2%、1/3000孟加拉红溶液10%、氯霉素0.01%,其余为水。
优选的,所述制作生产母种包括:将母种转接至生产母种培养基,置于25℃恒温暗培养,待菌丝长满斜面得到生产母种。
优选的,所述生产母种培养基为加富综合PDA。
进一步优选的,以重量百分比计,所述加富综合PDA包括:马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量,其余为水。
优选的,所述制作生产种包括:向生产种培养基中无菌接入生产母种,接种时确保生产母种料块埋入原种料中,置于25℃恒温暗培养,待菌丝吃满料后得到生产种。
优选的,以重量百分比计,所述生产种培养基包括:98-99%高粱和1-2%碳酸钙。
进一步优选的,以重量百分比计,所述生产种培养基包括:98%高粱和2%碳酸钙。
优选的,所述人工栽培方法的制作母种前还包括组织分离菌种。
一种鳞伞(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的人工栽培方法,包括组织分离菌种后制作母种,制作生产母种,制作生产种,栽培培养及栽培管理,以重量百分比计,所述栽培料包括28-32%棉籽壳、56-58%木屑、8-12%麸皮、1-2%CaCO3。
优选的,所述组织分离菌种包括:采集回来的鳞伞子实体在无菌条件下酒精擦拭表面后,撕开,以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织,置于25℃中恒温暗培养,待菌丝长满斜面后得到分离的菌种。
优选的,所述组织分离培养基为综合PDA培养基。
进一步优选的,以重量百分比计,所述综合PDA培养基包括马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量。
在第三方面,本发明提供一种鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物的应用,用于抗细菌引起的相关疾病。
优选的,所述提取物为乙酸乙酯提取物。
优选的,所述细菌为葡萄球菌,进一步优选为金黄色葡萄球菌。
在第四方面,本发明提供一种鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物的应用,用于制备抗细菌引起的相关疾病的药物或用于制备保健品。
优选的,所述提取物为乙酸乙酯提取物。
优选的,所述细菌为葡萄球菌,进一步优选为金黄色葡萄球菌。
优选的,所述用于制备保健品包括用于制备富含组氨酸、和/或粗多糖、和/或钾含量的保健品。
在第五方面,本发明提供一种抗细菌引起的相关疾病的药物,包括鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物和载体。
优选的,所述提取物为乙酸乙酯提取物。
优选的,所述细菌为葡萄球菌,进一步优选为金黄色葡萄球菌。
在第六方面,本发明提供一种保健品,包括鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物。
优选的,所述保健品为富含组氨酸、和/或粗多糖、和/或钾含量的保健品。
实施例1:新菌种鉴定
2014年3月22日胡惠萍、刘远超等在广东车八岭国家级自然保护区进行大型真菌资源采集和调查,在枯木上采集到一份鳞伞属品种标本,如图1所示,图2和图3为其显微结构图,并且组织分离获得原始菌株,命名为鳞伞属某种(Pholiota sp.)HMGIM-W140054,于2019年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:中国武汉),保藏编号为CCTCC NO:M 2019414。
由于宏观及微观形态上没有找到与其描述一致的鳞伞属品种,为进一步确认其分类,对其进行DNA提取,对多片段的基因进行测序,包括真菌核糖体基因间隔区ITS,核糖体大亚基LSU,编码RNA聚合酶II的第2大亚基rpb2等用于真菌分类的多基因片段。
经广东省微生物研究所食用菌研究发展中心科研人员对低温(35℃)烘干的野生子实体,使用液氮研磨,利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒,进行DNA基因组的提取,得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G,ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC,核糖体大亚基(LSU)引物LR0R/LR7(LR0R:ACC CGC TGA ACT TAA GC,LR7:TAC TAC CAC CAA GAT CT),编码RNA聚合酶II的第2大亚基(rpb2)引物RPB2-B-F1/RBP2-B-R(RPB2-B-F1:AAG ATY GCYAAG CCT CGT CA,RBP2-B-R:AAG ATR TTG GCC ATS GTG TCC)(由上海美吉生物医药科技有限公司合成)进行材料的PCR实验,扩增在Biometra PCR仪上进行,PCR反应液组成(共50μl)为:
ITS-PCR反应条件为:94℃反应5min;94℃反应1min,55℃反应1min,72℃反应1min,30个循环;72℃反应10min。PCR产物直接送检进行双向测序,由华大基因完成。
由于其ITS-PCR出现碱基缺失的情况,继续委托上海美吉生物医药科技有限公司开展克隆测序,得到6个克隆子及其测序结果。其中3个序列上传至Genebank,登记序列号为MN582988、MN582989、MN582990。
ITS克隆测序结果在GenBank进行序列Blast,6个克隆子均与柠檬鳞伞(Pholiotalimonella)(登记号:KM496470,来源韩国)的相似度最高,为99.2-99.7%,与多脂鳞伞(Pholiota adiposa)(登记号:FJ810180,来源中国)相似度为98.5-98.7%。宏观形态上其与柠檬鳞伞,多脂鳞伞均不吻合,差别较大。多脂鳞伞的形态比该品种要大2倍以上,柠檬鳞伞的担孢子有明显的芽孔,但该品种没有,且这个品种的担孢子要小过柠檬鳞伞。所以可以判定这是有别于目前鳞伞属记录的一个新种。
LSU-PCR的反应条件为:95℃反应3min;94℃反应30s,50℃反应45s,72℃反应2min,36个循环;72℃反应10min。得到的1条LSU序列上传至Genebank,登记序列号为MN582991。
LSU比对结果显示最高相似度的是98.89%翘鳞伞(Pholiota squarrosa)(登记号:DQ470818,来源美国),明显不是一个品种。
Rpb2-PCR的反应条件为:95℃反应3min;95℃反应30s,55℃反应45s,72℃反应1.5min,36个循环;72℃反应10min。得到的3条Rpb2序列上传至Genebank,登记序列号为MN628554、MN628555、MN628556。
Rpb2比对结果基本上最高相似度在86-88%之间,均是一些鳞伞属品种,均与本发明中品种不同。
观察其宏观形态及微观形态为:菌盖直径1.5~3.5cm,初期扁半球形至半球形,后期平展,中部突起,湿润时胶黏,菌盖为明黄色,具黄色胶质化的软毛鳞片,边缘淡色。菌肉灰白色,中部厚,气味温和。菌褶弯生、直生至稍延生,密,褶幅中等宽,初期淡色,后期赭色。菌柄长5~8cm,直径4~6mm,圆柱形,上下等粗或向上稍细,后期下部黄褐色,干,表面具纤毛,基部具软毛,纤维质,实心。菌环上位,丝膜状,污白色,易脱落。担孢子5.6~7.1×3.5~4.3μm,椭圆形,光滑,芽孔微小,淡黄褐色。
根据其形态,没有找到目前与其一致的品种,最接近的是黏皮鳞伞(Pholiotalubrica),但是二者明显色泽不一致,黏皮鳞伞是红褐色,且中部和边缘颜色不一,该品种颜色为亮黄色且颜色均一。而且黏皮鳞伞的个体稍大,通常也分布在东北和华中等地,从二者的ITS序列来比较相距很远。基本可以认定该种并非黏皮鳞伞。
为进一步确认其品种,我们从文献中寻找可信的鳞伞属ITS序列、LSU序列及rpb2序列,应用贝叶斯方法(BI)、邻接法(NJ)和最大似然法(ML)以毛柄库恩菇Kuehneromycesmutabilis及簇生沿丝伞Hypholoma fasciculare作为外群,分别进行了系统发育树的构建,如图4-图8所示。
从图4至图8的三种系统发育树的结果来看,结果是一致的,该鳞伞属品种的测序结果聚类到一起,说明测序结果是可信的,虽然针对ITS其比对相似度最高的是柠檬鳞伞(Pholiota limonella)和多脂鳞伞(Pholiota adiposa),针对LSU其比对相似度最高的是翘鳞伞(Pholiota squarrosa),宏观形态及微观形态相似度最高的为黏皮鳞伞(Pholiotalubrica),但是在系统发育树上,它跟这几个品种都不能聚类到一起,而且遗传距离非常远。同时它的宏观及微观形态表明它是鳞伞属品种无疑,所以我们可以判定它是一个新种,命名为鳞伞属品种(Pholiota sp.)。
实施例2人工栽培
一、培养基(以重量百分比计):
1、组织分离培养基(综合PDA):
马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量,其余为水。
2、纯化母种培养基(孟加拉红培养基):
蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05%、琼脂2%、1/3000孟加拉红溶液10%、氯霉素0.01%,其余为水。
3、生产母种培养基(加富综合PDA):
马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量,其余为水。
4、生产种培养基:
98-99%高粱、1-2%碳酸钙。
5、栽培料:
31%棉籽壳、58%木屑、10%麸皮、1%CaCO3;水分含量为60%-65%。
二、方法:
1、组织分离菌种:
制作组织分离培养基,分装试管,在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min,取出冷却摆成斜面。采集回来的野生鳞伞子实体在无菌条件下用75%酒精擦拭表面后,撕开,以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养,待菌丝长满斜面后后则可进行转接,其长满的时间大概在10天-15天之间。
2、制作纯化母种:
按配方制作纯化培养基,分装试管,在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min,对于分离后感染细菌的菌种进行转接。置于25℃培养箱中恒温暗培养,待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接,得到纯化母种。
3、制作生产母种:
制作生产母种培养基,分装试管,在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min,取出冷却无菌操作接入分离成功的纯化母种。置于25℃培养箱中恒温暗培养,待菌丝长满斜面后后得到生产母种则可进行转接。生产母种长满的时间大概在15天-20天之间。
4、制作生产种
称取所需比例的高粱,经水泡湿过夜,按比例混入碳酸钙,装入250ml锥形瓶中,折合每瓶装干料100-150g,得到生产种培养基,以硅胶塞封口,在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min,取出冷却后将培养基抖散后无菌操作接入生产母种。接种时确保生产母种料块埋入生产种料中。置于25℃培养箱中恒温暗培养,待菌丝吃满料后(20天左右)则可作为生产种使用接入栽培袋中。
5、栽培培养
称人工驯化培养基取所需比例的培养料,充分混合并加水(含水量为55-65%),装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料400-420g。装好料后用小木棒在袋料中打洞,洞深至袋底,然后在袋口套上塑料环,扣上配套的盖子,即得一个制好的栽培料袋。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min,取出冷却后无菌操作接入生产种。接种时确保料块埋入栽培料中。接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70%的培养室中避光培养。待菌丝吃满料后(25天左右)则可进入栽培管理。
6、栽培管理(包括后熟管理、原基形成、子实体生长)
(1)后熟管理
待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后,继续遮光后熟培养25天,进入出菇阶段。
(2)原基形成
控制温度在18-20℃,并加大通风量,保持空间二氧化碳含量在1%以下,空气相对湿度调整至90%以上,经约14天后,去除菌盖,把栽培袋竖排放置(袋与袋之间应留有空隙),约经过14天,菌丝开始扭结并形成淡黄色米柆状原基。
(3)子实体生长期
原基生长至0.5cm后,继续控制温度在18-20℃,空气相对湿度80-90%之间,每天光照9小时,光照强度300-500lx,并保持空气中二氧化碳浓度350~1500ppm,保持空气湿润。经8天左右可以采收。在此期间,每天向幼菇喷施水雾1-2次,直至子实体大小基本不变,子实体菌盖不再长大开始变平展,说明子实体已趋成熟,此时应采收。
从长出原基到子实体成熟约经过8天。采收第一潮菇后,进行相同的出菇处理,约在25天后采收第二潮菇。结果如图9和图10所示。
三、出菇情况
1、出菇期:头两潮菇出菇周期为90天,头潮菇出菇期65天。
2、产量:平均袋产量为139.71克。
3、子实体性状:菌盖直径2.5~4.5cm,簇生,初期扁半球形至半球形,后期平展,中部突起,湿润时胶黏,菌盖为明黄色,具黄色胶质化的软毛鳞片,边缘淡色,鳞片后期变为炭黑色。菌肉灰白色,中部厚,气味温和。菌褶弯生、直生至稍延生,密,褶幅中等宽,初期淡色,后期赭色。菌柄长5~8cm,直径4~6mm,圆柱形,上下等粗或向上稍细,后期下部黄褐色,干,表面具纤毛,基部具软毛,纤维质,实心。菌环上位,丝膜状,污白色,易脱落。
与野生状态相比,该品种在人工驯化后子实体个体明显增加,出菇较整齐,产量较高。
人工驯化后,可见其成熟子实体的菌盖上附着有炭烧的痕迹,显著地与已有记载的鳞伞品种不同,也从侧面证实了其为一新种。
实施例3发酵液抑菌活性测定
一、方法
1、准备工作:
细菌用培养基:营养琼脂/肉汤培养基;
营养琼脂/肉汤培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂15g,加水定容至1000ml调PH为7.4(营养肉汤不加琼脂)。
供试品乙酸乙酯提取物的制备:用大米培养基(配方为大米+水),接入本发明的菌株培养45天,加入乙酸乙酯,超声提取2次,40min/次,合并提取液,旋转蒸发仪中回收溶剂,旋蒸至提取液约1-2mL时转移到收集瓶中,得到乙酸乙酯提取物置于真空干燥器中,待溶剂挥发完全后转移至4℃冰箱保存,使用无菌注射器和滤膜过滤除菌,待用。
阳性对照制备:氨苄霉素冻存液,用无菌水稀释成浓度为5μg/mL的对照品溶液,紫外杀菌30min。
2、菌悬液的制备
(1)将金黄色葡萄球菌冻存液从-80℃冰箱中取出,平板划线接种取得单菌落;
(2)用无菌接种环挑取单菌落接种在营养肉汤培养基中,37℃、220r/min振荡培养24h,得到供试菌的菌悬液。
(3)吸取供试菌的菌悬液,用无菌蒸馏水梯度稀释,得到10-1~10-8倍原浓度的菌液;
(4)分别吸取各浓度的菌液200μL均匀涂到营养琼脂平板上,37℃培养24h,每个浓度重复3次;
(5)通过平板计数法,确定菌液的浓度,待用。
3、抑菌圈的测定
(1)涂板法
将经过计数的菌液通过稀释使终浓度为105~106cfu/mL,吸取200μL配好的菌悬液于平板上,用涂布器均匀涂布。用已灭菌的打孔器在含菌平板上均匀打孔,仔细挑去孔中培养基,在无菌条件下吸取对照品和供试品200μL分别打入孔中,放置于37℃条件下静置培养1天,测量抑菌圈大小。
(2)预加菌液倾注平板法
向已冷却至50℃左右的平板培养基中注入一定量的菌液,使培养基中菌浓度为105~106cfu/mL,摇匀,倾注平板(约30mL/平板),水平静置待凝固后待用,打孔加样方法同上。
4、数据处理
测量并比较抑菌圈大小。
二、实验结果:
结果如图11和表1所示。
样品 | 抑菌圈直径(mm) |
阳性对照 | 19.79±1.7 |
本发明菌株W140054 | 14.17±0.79 |
如图11所示,该菌种发酵液呈现抑菌圈,表明本发明菌种的发酵液对金黄色葡萄球菌有抑菌活性,在同批筛选的600个左右的野生食药用菌的乙酸乙酯提取物中,该品种是效果较好的前20株菌株之一,这说明,本发明菌种在对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。
实施例4营养成分测定
对于人工栽培的鳞伞属新种进行了营养成分的测定,包括水解氨基酸,多糖,蛋白质及重要的微量元素等。以黄伞(多脂鳞伞)和滑子蘑(小孢鳞伞)作为对照,测定结果表2所示。
表2:营养成分测定表
注1:黄伞及滑子蘑数据来源于2015年吉林农业大学硕士论文:黄伞化学成分及药理活性研究-王晓岩。其中氨基酸检测方法为:GB/T 5009.124-2003。其余与表同。个别缺失的数据参考了2017年昆明理工大学硕士论文:滑菇营养成分及化学成分研究-姚星宇并已标在表格内。
注2:带*为必需氨基酸
注3:碳水化合物(g/1OOg)=100-(蛋白质+脂肪+水分+灰分+膳食纤维)
从表2的鳞伞属新种的营养成分来看,其具有全部的必需氨基酸,组氨酸含量较高。组氨酸在营养学的范畴里被认为是一种儿童的必需氨基酸,成年后人类开始可以自己合成,是尿毒症患者的必需氨酸,且与多种变态反应及发炎有关。所以组胺酸也是重要的一类氨基酸。经过与《中国食药用菌学》中的食药用的营养成分比较,其组胺氨酸的含量高于99%以上的食药用菌,含量很高。
另外,从表2还可以看出,其粗多糖含量也比同属的小孢鳞伞(滑子蘑)高出许多。与同属的黄伞及滑子蘑等著名品种相比,含有丰富的钾,钾含量高出滑子蘑2倍以上。
综上所述,本发明所述的鳞伞属新种是一个尚未报道,还没有人研究的的新品种,其具有较明显的抑制金黄色葡萄球菌的作用,营养成分较丰富,栽培产量高,性状好等特性,是一个具有开发前景的菌种。
以上所述,仅为本发明的较佳的具体实施例,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种鳞伞属新菌种,其特征在于,所述鳞伞属新菌种为鳞伞(Pholiota sp.)HMGIM-W140054,保藏编号为CCTCC NO:M 2019414。
2.一种鳞伞(Pholiota sp.)CCTCC NO:M 2019414的人工栽培方法,其特征在于,包括制作母种,制作生产母种,制作生产种,栽培培养及栽培管理,以重量百分比计,所述栽培料包括28-32%棉籽壳、56-58%木屑、8-12%麸皮、1-2%CaCO3。
3.根据权利要求2所述的人工栽培方法,其特征在于,以重量百分比计,所述栽培料包括31%棉籽壳、58%木屑、10%麸皮、1%CaCO3,水分含量为60%-65%。
4.根据权利要求3所述的人工栽培方法,其特征在于,所述栽培培养包括:将生产种转接至栽培料中,25-26℃恒温、遮光培养,湿度60%-70%,菌丝长满菌袋进入栽培管理。
5.根据权利要求3所述的人工栽培方法,其特征在于,所述栽培管理包括:
待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后,继续遮光后熟培养25天,进入出菇阶段,控制温度在18-20℃,并加大通风量,保持空间二氧化碳含量在1%以下,空气相对湿度调整至90%以上,经14天后,去除菌盖,菌丝开始扭结并形成淡黄色米柆状原基;原基生长至0.5cm后,继续控制温度在18-20℃,空气相对湿度80-90%之间,每天光照9小时,光照强度300-500lx,并保持空气中二氧化碳浓度350~1500ppm,保持空气湿润,经8天左右,在此期间,每天向幼菇喷施水雾1-2次,直至子实体大小基本不变,子实体菌盖不再长大开始变平展,采收。
6.根据权利要求2至5中任一所述的人工栽培方法,其特征在于,所述制作母种包括:将分离的菌种转接至母种培养基,置于25℃恒温暗培养,待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取,得到母种;和/或,
所述制作生产母种包括:将母种转接至生产母种培养基,置于25℃恒温暗培养,待菌丝长满斜面得到生产母种;和/或,
所述制作生产种包括:向生产种培养基中无菌接入生产母种,接种时确保生产母种料块埋入原种料中,置于25℃恒温暗培养,待菌丝吃满料后得到生产种。
7.根据权利要求6所述的人工栽培方法,其特征在于,所述母种培养基为孟加拉红培养基,以重量百分比计,所述孟加拉红培养基包括:蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05%、琼脂2%、1/3000孟加拉红溶液10%、氯霉素0.01%,其余为水;和/或,
所述生产母种培养基为加富综合PDA,以重量百分比计,所述加富综合PDA包括:马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量,其余为水;
以重量百分比计,所述生产种培养基包括:98-99%高粱和1-2%碳酸钙。
8.一种鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物的应用,其特征在于,用于制备抗细菌引起的相关疾病的药物或用于制备保健品;所述提取物优选为乙酸乙酯提取物;所述细菌优选为葡萄球菌,进一步优选为金黄色葡萄球菌;所述用于制备保健品优选为包括用于制备富含组氨酸、和/或粗多糖、和/或钾含量的保健品。
9.一种抗细菌引起的相关疾病的药物,其特征在于,包括鳞伞新菌种CCTCC NO:M2019414或其提取物和载体;所述提取物优选为乙酸乙酯提取物;所述细菌优选为葡萄球菌,进一步优选为金黄色葡萄球菌。
10.一种保健品,其特征在于,包括鳞伞新菌种CCTCC NO:M 2019414或其提取物;所述保健品优选为富含组氨酸、和/或粗多糖、和/或钾含量的保健品。
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