CN110892847B - 一种漏斗大孔菌的人工栽培方法 - Google Patents

Abstract

一种漏斗大孔菌的人工栽培方法，采集野生漏斗大孔菌子实体，于无菌条件下将子实体自菌柄中央处撕开，用接种针挑取菌柄与菌盖交接处取野生漏斗大孔菌组织块，经过两次提纯复壮，制作母种，将母种于无菌条件下转接至二级菌种培养基，制作原种，最后制作生产种，进行接种栽培，出菇管理，接种栽培时栽培料为木屑、麸皮、石膏、石灰、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙。优点是：该菌株极易形成子实体，驯化转化率高，平均生物学转化率为43.7％，头潮子实体生物学转化率为26.4％，且该菌种为耐高温食用菌品种，可以作为常规香菇和黑木耳生产空闲期补充品种，具有较好的开发前景。

Description

一种漏斗大孔菌的人工栽培方法

技术领域

本发明涉及一种漏斗大孔菌人工栽培方法,特别涉及一种珍稀食药用菌漏斗大孔菌的人工栽培方法。

背景技术

迄今为止，全球范围内已记载的食药用真菌约有2500种，其中中国报道的食药用真菌近1000种，已探明的具有药效的真菌多达400多种，其中具有抗癌作用的达184种，真正作为药物使用的仅20～30种。已实现人工栽培的食药用菌已近80种，实现规模化栽培的仅有30余种，我国地大物博，丰富的食药用菌资源菌，可待开发利用的资源丰富，应用前景广阔。

漏斗大孔菌是一种木腐菌，主要生长在倒木及枯树上，野生漏斗大孔菌在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、河南、陕西、甘肃、青海、西藏、四川、云南、安徽、浙江、江苏、江西、贵州、湖南、广东、广西、海南、福建、香港等地均有分布，据报道，其幼嫩时柔软，可以食用，干时变硬，吸水泡发后可以恢复原状，该菌对小白鼠肉瘤180抑制率为90％，对艾氏癌抑制率为100％。

目前关于大孔菌属人工栽培研究，仅有CN 104396564 A和CN 101960959 A公开的汤阴县食用菌研究所和汤阴森奇生物技术有限公司开展过宽鳞大孔菌驯化与栽培，宽鳞大孔菌子实体形态无柄或短柄，菌种适宜生长温度为24℃-26℃，为常温品种，在夏秋高温期，栽培该品种的菇棚处于夏闲期，栽培设施利用率较低，宽鳞大孔菌与漏斗大孔菌虽为同属真菌，但生物学性状及生长特性明显不同，漏斗大孔菌菌柄较长，为耐高温品种，国内有关于漏斗大孔菌化学成分相关研究、漏斗大孔菌产漆酶特性研究及漏斗大孔菌免疫调节蛋白的制备与应用等，国外有研究者主要研究针对光线对漏斗大孔菌细胞内外形成酚氧化酶的影响，对于漏斗大孔菌的开发尚未进入实质阶段，未见其人工栽培的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种漏斗大孔菌人工栽培方法，品种对环境和营养需求适应性好，可以利用其他食用菌生产废料作为原料，能够作为高温期食用菌生产的补偿品种。

本发明的技术解决方案是：

一种漏斗大孔菌人工栽培方法，其具体步骤如下：

(1)制作母种：

a.采集野生漏斗大孔菌子实体，于无菌条件下将子实体自菌柄中央处撕开，用接种针挑取菌柄与菌盖交接处取(0.3～0.6)mm×(0.3～0.6)mm的野生漏斗大孔菌组织块，备用；

b.将含有综合PDA培养基的平皿中央用接种针抠一条宽为0.5cm-1cm的左右方向贯穿槽，槽深至平皿底面；将野生漏斗大孔菌组织块接种于槽一端的培养基上，菌丝生长活力旺盛的部分会优先穿越没有培养基的槽到达另一端培养基上，将率先生长至槽对面的尖端菌丝接种至另一块综合PDA平板上，35℃培养3天，完成一次提纯复壮；

c.重复步骤b，完成第二次提纯复壮；

d.将经历两次提纯复壮的菌丝，转接至含有综合PDA培养基的斜面试管，30℃～35℃培养4天，菌丝长满斜面，于无菌条件下接种至母种斜面培养基，母种培养基为综合PDA加富培养基，置于35℃恒温培养箱中培养，待斜面长满即得母种；

(2)制作原种

将母种于无菌条件下转接至二级菌种培养基，所述二级菌种培养基为液体培养基或固体培养基，置于35℃恒温培养，固体培养时，菌丝长满栽培瓶，即得固体原种；液体培养时，80％以上液体菌种形成菌球，即得液体原种；

液体培养基以重量百分比计为，细木屑粉5％，葡萄糖10％，磷酸二氢钾2％、硫酸镁2％，其余为水；固体培养基以重量百分比计为细木屑65％、玉米粉10％、麸皮10％、葡萄糖5％、磷酸二氢钾2％、磷酸氢二钾1.5％、硫酸镁1.5％、谷氨酸钠2％、蛋白胨1％、石灰1％、石膏1％；

(3)制作生产种

将固体原种或液体原种于无菌条件下接种至装有生产种培养料的栽培袋中，栽培袋生产采用窝口插棒方式，该方式利于菌丝迅速萌发，缩短培养时间，无菌棉塞或无菌海绵封口，30-35℃培养，待菌丝吃料满袋后得到生产种；

生产种培养料以重量百分比计为细木屑65％、玉米粉10％、麸皮20％、谷氨酸钠2％、蛋白胨1％、石灰1％、石膏1％；

(4)接种栽培

将生产种无菌接种至装有栽培料的栽培袋中，30℃～35℃恒温、避光培养，空气湿度控制在40％～60％，养菌过程中监测二氧化碳浓度，不得高于3500ppm，待菌丝装满袋后，将温度控制在28℃～33℃，空气湿度40％～60％条件下，后熟15天～20天后，待菌袋转色，菌皮表层出现珊瑚状小凸起，进行出菇管理；

其中，以重量百分比计，所述栽培料配方为：70％～78％木屑，17％～20％麸皮，1％～2％石膏，1％～3％石灰，0.5％～1.5％磷酸氢二钾，0.5％～1.5％磷酸二氢钾，0.5％～1.5％硫酸镁，0.5％～1.5％氯化钙；所述栽培料的含水量为55％wt～65％wt；

(5)出菇管理

出菇管理包括控制出菇环境温度在24～33℃之间，加大出菇环境的空气流通，将菌袋窝口处的塑料袋抻出，使菌袋口边缘高于菌棒上部9厘米～10厘米，该方式便于保湿，空气相对湿度调整至85％～95％，在此条件下2天～4天，菌棒顶部开口处形成大量丛生或单生原基，注意通风和保湿，同时增强散射光照射，散射光照射时间满足8小时～14小时，原基生长迅速，分化形成菌柄，继续培养1天～2天，即可分化出菌盖；分化出菌盖后，子实体进入快速生长，在上述条件下，1天～2天子实体菌盖直径即可达35～60mm，可以采收。

进一步的，步骤(4)所以培养料配方为：76％木屑，20％麸皮，1％石膏，1％石灰，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述栽培料的含水量为63％wt。

进一步的，所述综合PDA培养基的原料组成按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％，其余为水。

进一步的，所述综合PDA加富的原料组成按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、蛋白胨0.5％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、0.05％维生素B1，其余为水。

本发明具有以下主要特点：

(1)本发明为拓展新食药用真菌资源利用提供了新的途径，解决了野生漏斗大孔菌人工栽培技术问题，为解决食用菌生产上缺乏高温食用菌品种提供新选择。

(2)本发明的漏斗大孔菌菌株耐高温能力强，菌丝生长定植快，经过两次断桥法复壮，菌株活力较强。

(3)本发明提供了漏斗大孔菌固体菌种生产和液体菌种生产配方，可以适应不同生产条件的技术需求，可以根据自身生产条件灵活缩短生产周期。

(4)本发明所获得的子实体形态特征明显与常规品种不同，子实体直观形态与伞菌相近，但无菌褶，为菌管结构，是多孔菌科真菌的主要特征，而多数多孔菌科真菌都无柄或短柄，漏斗大孔菌得菌柄较长且比较明显。人工栽培的漏斗大孔菌子实体丛生或单生，菌柄长度5-10cm，菌盖直径3.5-6.5cm，颜色为黄褐色，与野生状态下相比颜色变浅，生长初期菌盖平，生长后期边缘平展或翘起，似漏斗状，有深褐色鳞片，有绒毛，新鲜时韧肉质，柔软，干后变硬且边缘内卷。菌肉白色或污白色。菌管白色，干后呈淡黄色或淡褐色。柄中生或近中生，与菌盖同色。

(5)本发明所提供的出菇方式是在出菇管理时将菌袋窝口处的塑料袋抻出，使菌袋口边缘高于菌棒上部9厘米～10厘米，该方式便于保湿。

(6)本发明所提供栽培方法，驯化转化率为43.7％，平均袋产为154.5g，头潮生物转化率可以达到26.4％，可出菇2潮～3潮，该菌种具有耐高温、生产周期短、营养需求宽泛等特点，养菌及出菇温度范围广，24～33℃之间均可出菇，品种对环境和营养需求适应性好，可以利用其他食用菌生产废料作为原料，能够作为高温期食用菌生产的补偿品种，开发应用前景广阔。

附图说明

图1是野生漏斗大孔菌子实体形态照片；

图2是本发明实施例1获得的漏斗大孔菌担孢子形态照片；

图3是本发明实施例1断桥法提纯复壮菌种照片；

图4是本发明实施例1漏斗大孔菌液体菌种照片；

图5是本发明实施例1人工栽培出菇状态照片；

图6是本发明实施例1人工栽培出菇管理照片，图中塑料袋高出菌棒上部9厘米-10厘米；

图7是本发明实施例1人工栽培子实体(菌盖、菌柄、菌管)形态照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一、培养基

1.组织分离培养基

综合PDA培养基：每升含有200克土豆滤汁，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，琼脂20克，其余为水。

2.母种培养基

每升培养基含有200克土豆滤汁，葡萄糖20克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B₁ 0.5克，琼脂20克，其余为水。

3.二级菌种培养基

固体菌种配方(质量百分比)：细木屑65％、玉米粉10％、麸皮10％、葡萄糖5％、磷酸二氢钾2％、磷酸氢二钾1.5％、硫酸镁1.5％、谷氨酸钠2％、蛋白胨1％、石灰1％、石膏1％；所述固体菌种培养基含水量为63％wt。

液体菌种配方(质量百分比)：细木屑粉5％，葡萄糖10％，磷酸二氢钾2％、硫酸镁2％，其余为水。

4.生产种培养料配方

按照质量百分比含量，细木屑65％、玉米粉10％、麸皮20％、谷氨酸钠2％、蛋白胨1％、石灰1％、石膏1％；所述生产种培养料含水量为63％wt。

5.栽培料配方

按照质量百分比含量，76％木屑，20％麸皮，1％石膏，1％石灰，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述栽培料的含水量为63％wt。

二、方法

1.野生菌种分离

采用组织分离法进行野生菌种分离，将采集的标本用冰盒进行保存，并带回实验室快速进行组织分离，于无菌条件下将子实体自菌柄中央处撕开，用接种针挑取菌柄与菌盖交接处取(0.3～0.6)mm×(0.3～0.6)mm的组织块，备用；

将含有综合PDA培养基的平皿中央，用接种针抠一条宽0.5～1mm的左右方向贯穿槽，槽深至平皿地面，将组织块接种于槽一端的培养基上，菌丝生长活力旺盛的部分会优先穿越没有培养基的槽到达另一端培养基上，将率先生长至槽对面的尖端菌丝接种至另一块综合PDA平板上，35℃培养3天，完成一次提纯复壮，菌丝经历两次提纯复壮后，将菌种转接至综合PDA斜面试管，30℃～35℃培养，4天可长满试管，得到漏斗大孔菌菌种。如图3所示。

2.母种制备

按配方制作母种斜面培养基，将纯化后的漏斗大孔菌斜面用接种钩划成3mm×3mm的小块，分别用接种铲薄薄铲取小块接种块放置在母种斜面培养基中央，35℃培养4天，得到生长一致性较好的母种。

3.二级种制备

二级种可以选择固体菌种或液体菌种。

固体菌种制备方法：按配方制作培养料，分装至菌种瓶中，每瓶2/3装量，盖上配套透气盖，置于121℃，灭菌2小时，自然降温，待菌种瓶温度低于35℃后，可以接种。于无菌条件下，将斜面母种接种至菌种瓶中央，封口，30～35℃恒温培养，12～15天可长满瓶。

液体菌种制备方法：按配方制作培养基，分装于500mL或1000mL三角瓶中，每瓶装量1/3，透气棉塞封口，用牛皮纸或报纸将棉塞包裹后，置于121℃，灭菌半小时，自然降温，待菌种瓶温度低于35℃后，可以接种。于无菌条件下，将斜面母种用接种针将菌丝表层划成细碎快，尽量少带入培养基，将菌丝碎块接种至三角瓶液体培养基中，35℃，160转/分钟，培养5～7天菌球可达80％以上，与固体菌种比较，液体菌种具有萌发速度快、接种面积大优势。如图4所示。

4.生产种制备

按生产种配方制备菌袋，选择生产上常用的窝口棒，优点是菌棒中央接种，萌发快。将培养料装袋后，置于121℃，灭菌2小时，自然降温，待菌袋温度低于35℃后，可以接种。固体菌种用接种铲将固体菌种瓶中的菌块挖出，转接至菌棒中间空心部分，尽量将空心部分填满，操作过程应快速。接种后放置于30～35℃恒温培养，18～22天可长满袋。

如为液体菌种，则可以使用接种枪或大容量移液器，每袋接种20mL，将枪头绕菌棒中间的空心部分环走一周，以便菌种均匀分布。接种后放置于30～35℃恒温培养，12～15天可长满袋。

5.栽培出菇

按照栽培料的配方配料，装入17cm×35cm的聚丙烯食用菌袋中，每袋干料重为410～430g，制成窝口棒，(同时将配套海绵赛一同灭菌，备用)，将菌袋置于121℃，灭菌2小时(或常压105～110℃灭菌8～10小时)，自然降温，待菌袋温度低于35℃后，可以接种。固体菌种用接种铲将固体菌种瓶中的菌块挖出，转接至菌棒中间空心部分，尽量将空心部分填满，操作过程应快速。接种后放置于35℃恒温避光培养，空气湿度控制在40％～60％，养菌过程中需监测二氧化碳浓度，不得高于3500ppm，18天～22天可长满袋，将温度下调至25～30℃进行后熟培养，15～20天后，待菌袋转色，菌皮表层出现珊瑚状小凸起，进行出菇管理。

6.出菇管理

菌皮表层出现珊瑚状小凸起后，控制出菇环境温度在24～33℃之间，加大出菇环境的空气流通，将菌袋上方开口，菌袋口边缘高于菌棒上部9～10厘米，便于保湿，空气相对湿度调整至85％～95％，在此条件下2～4天，菌棒顶部开口处形成丛生或单生原基，注意通风和保湿，同时增强散射光照射，散射光照射时间满足8～14小时，原基生长迅速，分化形成菌柄，继续培养1～2天，即可分化出菌盖。分化出菌盖后，子实体进入快速生长，在上述条件下，1～2天子实体菌盖直径即可达35mm～60mm，可以采收。如图5、6、7所示。

三、出菇情况

出菇期：该品种为快速出菇品种，出菇期30～45天，头潮菇出菇3～7天。

产量：干料410～430克的菌袋，每袋产量102.4克～125.2克，平均产量109.6克，头潮菇生物学转化率26.4％，总驯化转化率为43.7％。

子实体性状：子实体丛生或单生，菌柄长度5～10cm，菌盖直径3.5～6.5cm，颜色为黄褐色，与野生状态下相比颜色变浅，生长初期菌盖平，生长后期边缘平展或翘起，似漏斗状，有深褐色鳞片，有绒毛，新鲜时韧肉质，柔软，干后变硬且边缘内卷。菌肉白色或污白色。菌管白色，干后呈淡黄色或淡褐色。柄中生或近中生，与菌盖同色。

漏斗大孔菌poluporus arcularius鉴定

2012年6月14日，辽宁省微生物科学研究院赵新海、沈青、张庆华、钟丽娟等人开展野生大型真菌资源调查时在辽宁省鞍山市岫岩县野外林地采集到野生漏斗大孔菌标本，所采标本子实体大小中等，担子果一年生，有柄，菌盖直径2.5-7.5cm，厚1-3cm，中部下凹呈脐状，初期菌盖平，生长后期边缘平展或翘起，似漏斗状，菌盖颜色为褐色、黄褐色至肉桂色，无环纹，有深褐色鳞片，边缘锐，有绒毛，新鲜时韧肉质，柔软，干后变硬且边缘内卷。菌肉白色或污白色。菌管白色，干后呈淡黄色或淡褐色，管口菱形，辐射状排列，直径1-3mm。柄中生或近中生，与菌盖同色，常有深色鳞片或光滑，长3-9cm，粗2-6mm，圆柱形，基部有污白色粗绒毛。经科研人员进行组织分离获得其原始菌株，菌落初期为白色，边缘整齐，平铺生长，生长速度快，在PDA培养基上，6天菌落直径可达90mm。菌丝直径为2.1-3.6μm，有锁装联合，孢子无色，肾形或椭圆形，平滑，5.9-9.2μm×2.3-3.4μm。通过形态学鉴定，该菌子实体形态及显微形态符合漏斗大孔菌形态学描述。将菌种送样至大连宝生物进行26rDNAITS序列分析。将测试结果在GenBank进行序列Blast比对，该菌与漏斗大孔菌(poluporus arcularius)相似性高达99％，确定其为漏斗大孔菌。如图1、图2所示。

实施例2

栽培料配方：按照质量百分比含量，70％木屑，19％麸皮，2％石膏，3％石灰，1.5％磷酸氢二钾，1.5％磷酸二氢钾，1.5％硫酸镁，1.5％氯化钙，所述栽培料的含水量为55％wt。

生产种为液体菌种，制备方法同实施例1中所述。

其他同实施例1。

实施例3

栽培料配方：按照质量百分比含量，78％木屑，17％麸皮，1％石膏，1％石灰，1％磷酸氢二钾，1％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述栽培料的含水量为65％wt。

生产种为液体菌种，制备方法同实施例1中所述。

其他同实施例1。

本发明实施例1-实施例3的菌袋生长情况和出菇产量

1.菌袋生长情况

漏斗大孔菌营养需求较为宽泛，可以利用常规的农业生产废弃物进行生产。

表1本发明实施1-实施例3漏斗大孔菌菌丝生长情况表

	实施例1	实施例2	实施例3
				满袋所需时间	15天	18天	18天

2.出菇产量

表2本发明实施1-实施例3漏斗大孔菌出菇情况表

配方编号	实施例1	实施例2	实施例3
				每袋平均干重	415克	430克	447克
头潮菇产量	109.6克	92.0克	100.6克
				生物学转化率	26.4％	21.4％	22.5％

对比试验不同栽培原料出菇效果对比

一、培养基

1.母种培养基配方

每升培养基含有200克土豆滤汁，葡萄糖20克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B₁0.5克，琼脂20克，其余为水。

2.二级菌种培养基配方

液体菌种配方包括(质量百分比)：细木屑粉5％，葡萄糖10％，磷酸二氢钾2％、硫酸镁2％，其余为水。

3.生产种配方

按照质量百分含量，细木屑65％、玉米粉10％、麸皮20％、谷氨酸钠2％、蛋白胨1％、石灰1％、石膏1％；所述生产种培养料含水量为63％wt。

4.栽培料配方

配方A(质量百分比)：76％木屑，20％麸皮，1％石膏，1％石灰，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述配方中含水量为63％。

配方B(质量百分比)：黑木耳菌糠(出耳5潮，粉碎)76％，20％麸皮，1％石膏，1％石灰，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述配方中含水量为63％。

配方C(质量百分比)：玉米芯粉76％，20％麸皮，1％石膏，1％石灰，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述配方中含水量为63％。

配方D(质量百分比):玉米秸秆粉76％，20％麸皮，1％石膏，1％石灰，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，所述配方中含水量为63％。

二、方法

1.斜面菌种制备

按配方制作母种斜面培养基，将冰箱保存的漏斗大孔菌斜面用接种钩划成3mm×3mm的小块，分别用接种铲薄薄铲取小块接种块放置在母种斜面培养基中央，35℃培养4天，得到生长一致性较好的母种。

2.液体菌种制备：按配方制作培养基，分装于500mL或1000mL三角瓶中，每瓶装量1/3，透气棉塞封口，用牛皮纸或报纸将棉塞包裹后，置于121℃，灭菌半小时，自然降温，待菌种瓶温度低于35℃后，可以接种。于无菌条件下，将斜面母种用接种针将菌丝表层划成细碎快，尽量少带入培养基，将菌丝碎块接种至三角瓶液体培养基中，35℃，160转/分钟，培养5～7天菌球可达80％，获得液体菌种。

3.栽培出菇

按照栽培料各配方配料，分别装入17cm×35cm的聚丙烯食用菌袋中，制成窝口棒，标记清楚，称重记录，(同时将配套海绵塞一同灭菌，备用)，将菌袋置于121℃，灭菌2小时(或常压105～110℃灭菌8小时)，自然降温，待菌袋温度低于35℃后，可以接种。使用大容量移液器，每袋接种20mL，将枪头绕菌棒中间的空心部分环走一周，以便菌种均匀分布。接种后放置于32℃恒温培养，空气湿度控制在40％～60％，养菌过程中监测二氧化碳浓度，不得高于3500ppm，15～25天可长满袋，将温度下调至25～30℃进行后熟培养，15～20天后，待菌袋转色，菌皮表层出现珊瑚状小凸起，进行出菇管理。

4.出菇管理

菌皮表层出现珊瑚状小凸起后，控制出菇环境温度在24～33℃之间，加大出菇环境的空气流通，将菌袋上方开口，菌袋口边缘高于菌棒上部10厘米，便于保湿，空气相对湿度调整至85％～95％，在此条件下2～4天，菌棒顶部开口处形成大量丛生或单生原基，注意通风和保湿，同时增强散射光照射，散射光照射时间满足8～14小时，原基生长迅速，分化形成菌柄，继续培养1～2天，即可分化出菌盖。分化出菌盖后，子实体进入快速生长，在上述条件下，12天子实体菌盖直径即可达35～60mm，可以采收。

三、出菇情况

1.菌袋生长情况

漏斗大孔菌营养需求较为宽泛，可以利用常规的农业生产废弃物进行生产。

表3不同配方对漏斗大孔菌菌丝生长的影响

配方编号	A	B	C	D
					满袋所需时间	15天	19天	25天	16天

2.出菇产量

表4不同配方对漏斗大孔菌出菇的影响

配方编号	A	B	C	D
					每袋平均干重	415克	407克	400克	379克
头潮菇产量	109.6克	96.1克	79.2克	88.3克
					生物学转化率	26.4％	23.6％	19.8％	23.3％

本对比试验提供4种生产配方，生产原料包括常规木屑、麸皮等主要原料，还提供了秸秆和黑木耳菌糠为主要原料的配方，由菌丝生长结果和出菇情况可知，配方A即本发明使用的栽培料配方，满袋所需时间最短，头潮菇产量和生物学转化率高，适合漏斗大孔菌的栽培。

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种漏斗大孔菌的人工栽培方法，其特征是：

包括以下步骤：

（1）制作母种：

a.采集野生漏斗大孔菌子实体，于无菌条件下将子实体自菌柄中央处撕开，用接种针挑取菌柄与菌盖交接处，取（0.3～0.6）mm×（0.3～0.6）mm的野生漏斗大孔菌组织块，备用；

b.将含有综合PDA培养基的平皿中央用接种针抠一条宽为0.5cm～1cm的左右方向贯穿槽，槽深至平皿底面；将野生漏斗大孔菌组织块接种于槽一边的培养基上，菌丝生长活力旺盛的部分会优先穿越没有培养基的槽到达另一边培养基上，将率先生长至槽对面的尖端菌丝接种至另一块综合PDA平板上，35℃培养3天，完成一次提纯复壮；

c.重复步骤b，完成第二次提纯复壮；

d. 将经历两次提纯复壮的菌丝，转接至含有综合PDA培养基的斜面试管，30℃～35℃培养4天，菌丝长满斜面于无菌条件下接种至母种斜面培养基，母种培养基为综合PDA加富培养基，置于35℃恒温培养箱中培养，待斜面长满即得母种；

（2）制作原种

将母种于无菌条件下转接至二级菌种培养基，所述二级菌种培养基为液体培养基或固体培养基，置于35℃恒温培养，固体培养时，菌丝长满栽培瓶，即得固体原种；液体培养时，80%以上液体菌种形成菌球，即得液体原种；

液体培养基以重量百分比计为，细木屑粉5%，葡萄糖10%，磷酸二氢钾2%、硫酸镁2%，其余为水；

固体培养基以重量百分比计为细木屑65%、玉米粉10%、麸皮10%、葡萄糖5%、磷酸二氢钾2%、磷酸氢二钾1.5%、硫酸镁1.5%、谷氨酸钠2%、蛋白胨1%、石灰1%、石膏1%；

（3）制作生产种

将固体原种或液体原种于无菌条件下接种至装有生产种培养料的栽培袋中，栽培袋生产采用窝口插棒方式，无菌棉塞或无菌海绵封口，30-35℃培养，待菌丝吃料满袋后得到生产种；

生产种培养料以重量百分比计为细木屑65%、玉米粉10%、麸皮20%、谷氨酸钠2%、蛋白胨1%、石灰1%、石膏1%；

（4）接种栽培

将生产种无菌接种至装有栽培料的栽培袋中，30℃～35℃恒温、避光培养，空气湿度控制在40%～60%，养菌过程中监测二氧化碳浓度，不得高于3500ppm，待菌丝装满袋后，将温度控制在28℃～33℃，空气湿度40%～60%条件下，后熟15天～20天后，待菌袋转色，菌皮表层出现珊瑚状小凸起，进行出菇管理；

其中，所述栽培料配方以重量百分比计为：70%～78%木屑，17%～20%麸皮，1%～2%石膏，1%～3%石灰，0.5%～1.5%磷酸氢二钾，0.5%～1.5%磷酸二氢钾，0.5%～1.5%硫酸镁，0.5%～1.5%氯化钙；所述栽培料的含水量为55%wt～65%wt；

（5）出菇管理

整个出菇管理阶段控制出菇环境温度在24～33℃之间，空气相对湿度调整至85%～95%，保证出菇环境的空气流通；

将菌袋窝口处的塑料袋抻出，使菌袋口边缘高于菌棒顶部9厘米～10厘米，2天～4天，菌棒顶部开口处形成丛生或单生原基，继续保持通风和保湿，同时散射光照射时间满足8小时～14小时，原基分化形成菌柄，继续培养1天～2天，即可分化出菌盖；分化出菌盖后，子实体进入快速生长，1天～2天子实体菌盖直径即可达35 mm～60mm，采收。

2.根据权利要求1所述的漏斗大孔菌的人工栽培方法，其特征是：步骤（4）所述培养料配方按重量百分比计为：76%木屑，20%麸皮，1%石膏，1%石灰，0.5%磷酸氢二钾，0.5%磷酸二氢钾，0.5%硫酸镁，0.5%氯化钙，所述栽培料的含水量为63%wt。

3.根据权利要求1所述的漏斗大孔菌的人工栽培方法，其特征是：所述综合PDA培养基的原料组成按质量百分比计为：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％，其余为水。

4.根据权利要求1所述的漏斗大孔菌的人工栽培方法，其特征是：所述综合PDA加富培养基的原料组成按质量百分比计为：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、0.05%维生素B1，其余为水。

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