CN102523916A - 具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物工程技术应用领域，具体涉及具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法。该茶树菇发酵液为黄色液体，是茶树菇深层发酵后的液体经过浓缩，脱蛋白，透析得到的。该发酵液所含氨基酸中谷氨酸占18％以上，天冬氨酸占12％以上，甘氨酸占8％以上，赖氨酸占7％以上，丙氨酸占6％以上，具有一定的抑菌作用，可应用于化妆品的抑菌防腐。

Description

具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法

技术领域

本发明涉及具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法。属生物工程技术应用领域。

背景技术

茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。通过深层发酵获得一种天然的具有抑菌作用的发酵液，可应用于化妆品的抑菌防腐。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法。

本发明的技术方案为：将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，将发酵液浓缩，脱蛋白，透析后得到澄清的黄色液体，滤过除菌后进行抑菌实验。

上述过程中，斜面培养基为PDA培养基，摇瓶种子培养基为PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0，发酵培养基为玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL，培养条件为起始pH6.0，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d，离心后上清液用Sevage法去除游离蛋白质，蒸馏水透析去除无机盐，得到茶树菇发酵液。滤过除菌后用滤纸片法进行抑菌实验。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例一

1.发酵液制备

出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；

(1)组织分离法

斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；

组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；

(2)摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；

培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；

(3)摇瓶发酵培养

发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL；

培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；

(4)发酵液浓缩，脱蛋白，透析

培养后离心，取上清液旋转蒸发仪浓缩后用Sevage法去除游离蛋白，即按发酵液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。然后取上清液中装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次，得发酵液。

2.滤过除菌

上述液体通过0.22μm的滤膜除菌。

实例二

对茶树菇发酵液样品进行了氨基酸组成，单糖组成的测定，测定结果表明，所含氨基酸中谷氨酸占18％以上，天冬氨酸占12％以上，甘氨酸占8％以上，赖氨酸占7％以上，丙氨酸占6％以上，所含单糖以葡萄糖为主，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为76.3％。茶树菇发酵液的氨基酸组成及含量见表1。

表1茶树菇发酵液的氨基酸组成及含量

实例三

将制备得到的茶树菇发酵液进行抑菌实验。

1.供试菌株的准备：在无菌室中将供试菌种接入相对应的试管斜面培养基置于恒温培养箱内培养，培养温度和时间分别为细菌35～37℃，18～24h、霉菌25～28℃，44～48h、酵母菌30℃，44～48h。

2.培养基平板制备：配制好的各种菌株的培养基，121℃湿热灭菌30min后，冷却至50～60℃，无菌操作倾注于干热灭菌的培养皿内，每皿15～20mL。

3.供试菌株悬浮液的制备及平板接种：用接种环挑取少许菌体于装有9mL无菌水的试管内，制成菌悬液。霉菌、酵母菌用血球计数板计数，细菌用比浊法计数。调整菌悬液的浓度至含孢子或菌体为106～107/mL，向平板上加100μL菌悬液，用涂布棒涂布均匀。

4.滤纸法抑菌实验：用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的小圆片，于培养皿中121℃湿热灭菌30min。将灭菌滤纸片浸入茶树菇发酵液中，浸泡24h。将浸好的滤纸片贴在制备好的接种平板上，用空白滤纸片加无菌水作为对照，平板置于恒温培养箱中培养，到达培养时间后用游标卡尺测量抑菌圈直径(见表2)。表明发酵液对致病菌，尤其是肠道致病菌具有一定的抑制作用。

表2发酵液抑菌效果比较

Claims (6)

1.一种具有抑菌作用的茶树菇发酵液，其特征在于外观为淡黄色液体，是茶树菇通过深层发酵获得的发酵液经过浓缩，脱蛋白，透析，滤过除菌后制得。其中发酵液所含氨基酸中谷氨酸占18％以上，天冬氨酸占12％以上，甘氨酸占8％以上，赖氨酸占7％以上，丙氨酸占6％以上，然后通过滤纸片法进行抑菌活性实验，结果表明其对常见致病菌，尤其是肠道致病菌有一定抑制作用。

2.权利要求1所述的发酵液的制备方法。该方法由下列步骤组成：

(1)菌种培养

出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；

①组织分离法

斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；

组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；

②摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；

培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；

③摇瓶发酵培养

发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL；

培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；

(2)发酵液浓缩，脱蛋白，透析

培养后离心，取上清液旋转蒸发仪浓缩后用Sevage法去除游离蛋白，然后取上清液透析。

(3)滤过除菌

上述液体通过0.22μm的滤膜除菌。

3.如权利要求1所述的抑菌实验所用滤纸片的制备方法，其特征在于用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的小圆片，于培养皿中121℃湿热灭菌30min，将灭菌滤纸片浸入茶树菇发酵液中，浸泡24h后取出。

4.如权利要求1所述的抑菌实验菌种包括金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、枯草芽胞杆菌、伤寒杆菌、面包酵母、黑根霉、曲霉。

5.如权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于所述用Sevage法去除游离蛋白，是按发酵液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。

6.如权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于所述的透析是指将去除游离蛋白质的发酵液装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次。