CN106906298A - 棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法 - Google Patents

棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其步骤包括:1)分离病原菌：将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭，剥皮，除去剥皮后的头端后，截成小段，埋入第一培养基，得到孢子和菌丝；2)单孢分离纯化：用接种环刮取所述的孢子和菌丝，和无菌水混合，得到孢子和菌丝悬浮液；取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线，得到菌落；用接种针挑取单菌落点到第三培养基中，得到直径5‑8cm的菌落；3)真菌DNA提取：取所述第三培养基上的培养物于离心管，吹干，加入磁珠，在液氮中冷冻后，震荡研磨，提取DNA，并用凝胶电泳检测提取质量；4)建立ISSR体系。本发明大大缩短了棉花黄萎病病原菌分离纯化时间；ISSR体系减少，扩增的条带仍然多态性高、特异性强、背景清晰，并节约成本。

Description

棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法
技术领域
本发明涉及植物病理学及分子生物学领域，特别是涉及一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法。
背景技术
棉花黄萎病是危害棉花的重要病害之一，成为制约我国棉花生产仅次于棉铃虫的第二大杀手。其病原菌为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，由于其为土传性维管束真菌性病害，目前缺乏有效的防治措施。由于该菌易于变异，因而经常出现同一个品种在不同地区的表现抗病性不同的情况。收集不同地区菌株，快速提取其DNA，准确地鉴定棉花黄萎病菌种群多样性及菌系间的亲缘关系和变异程度，对于抗病育种工作及病害的防治具有重要的实践意义。棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究主要分为黄萎病病原菌的分离、真菌DNA提取和研究真菌多样性等步骤。
目前黄萎病病原菌的分离采用的是常规组织分离法。首先采集黄萎病病株，然后用升汞、双氧水或次氯酸钠消毒，无菌水冲洗3-4遍，然后培养、纯化，纯化后再根据需要再培养。升汞即氯化汞，剧毒，渗透性强，通常用于组织分离时消毒部分，操作要十分谨慎。升汞灭菌后要无菌水冲洗数遍，再用无菌滤纸把残余的水分吸干，以防残留的升汞影响病原菌生长。为防止交叉污染，一般每分离一个样品就要换一套冲洗器皿，所用器皿也非常多，在有限的超净台里面显得非常拥挤，容易混乱，平均每个样品耗时10min分钟左右。双氧水或次氯酸钠消毒，同样需要类似的步骤。
现阶段，真菌DNA提取方法都基于菌丝的获得。大丽轮枝菌一般是边生长边产生大量的孢子和菌核，生长缓慢，培养物质地比较坚硬，附在培养基表面，很少有蓬松的气生菌丝，不易直接从培养基上获得菌丝。需要从纯化后培养10-15d平板上打菌饼接种于Czapek’s液体培养基中，26℃，200r·min-1振荡培养4-7d，纱布过滤，无菌水冲洗2-3遍，晾干，待用。真菌细胞壁含有甲壳素，晾干之后十分坚硬，研磨仪器研磨不彻底。目前一般采用人工研磨方法，在研钵中加液氮研磨，反复数次，需要大量菌丝，十分费力耗时，平均每个样品至少需要10min。
研究真菌多样性时样品少则几十份，多则两三百份。再加之采样地点距离远，路途长，天气炎热时，样品极易腐烂。由于分离消毒十分耗时，一般不能做到及时分离，因而造成样品存放时间长，分离易污染甚至不能纯化出病原菌现象。样品量大时消毒、冲洗等步骤繁琐，也易于混淆。获得DNA时需要摇菌，此时需要大量的三角瓶、液体培养基及足够数量的摇床。这对研究真菌多样性的研究者来说，最具挑战性的莫过于样品的及时快速分离纯化及高通量DNA的获得。
ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)简单重复序列区间扩增，广泛存在于绝大部分的基因组DNA中，并且进化变异速度快。ISSR现已广泛用于植物的品种鉴定、遗传作图、基因定位、分类、进化及遗传多样性等方面的研究。目前，ISSR分子标记技术体系的研究，多选择25μL反应体系，扩增成本高。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种新型的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，所要解决的技术问题是使其缩短了棉花黄萎病病原菌分离纯化及遗传多样性的研究时间，从而更加适于实用。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其步骤包括:
1)分离病原菌：将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭，剥皮，除去剥皮后的头端后，截成小段，埋入第一培养基，得到孢子和菌丝；
2)单孢分离纯化：用接种环刮取所述的孢子和菌丝，和无菌水混合，得到孢子和菌丝悬浮液；取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线，得到菌落；用接种针挑取单菌落点到第三培养基中，得到直径5-8cm的菌落；
3)真菌DNA提取：取所述第三培养基上的培养物于离心管，吹干，加入磁珠，在液氮中冷冻后，震荡研磨，提取DNA，并用凝胶电泳检测提取质量；
4)建立ISSR体系。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的棉秆小段为0.5-1.0cm。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的第一培养基、第二培养基和第三培养基均为PDA培养基。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的第一培养基的培养条件为26℃黑暗培养3-4d；所述的第二培养基的培养条件为26℃黑暗培养2-3d；所述的第三培养基的培养条件为26℃黑暗培养10-20d。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的步骤3)中的培养物的含量为0.2-0.5g。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的磁珠的直径为5-10mm。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的震荡研磨为间歇式，每次震荡研磨时间为1-3min，频率为20-30frequency1/s。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的提取DNA的方式为CTAB或真菌DNA提取试剂盒提取DNA。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳。
优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的ISSR体系的分子标记优化反应体积为10μL，其包括：
5μL 2×Taq PCR MasterMix，引物0.5-1μmol·L-1，模板DNA 20-50ng，ddH2O补齐10μL；
ISSR扩增条件为94℃退火5min，94℃退火45s，72℃延伸1min、40个循环，最后延伸7min。
借由上述技术方案，本发明棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法至少具有下列优点：
(1)本发明的在分离病原菌部分无需升汞、双氧水或次氯酸钠消毒，无菌水冲洗，只需75％的酒精表面消毒，易于操作，污染少，极大地提高了工作效率，平均每个样品只需1-2min，并可做到及时分离样品，避免污染。
(2)本发明的分离出的病原菌98％以上没有杂菌，几乎没有污染，保证了菌种的纯度；可提前做好PDA培养基平板，用保鲜膜包好运输途中使用，然后在75％的酒精擦拭过的桌面上点一只酒精灯，临时做个无菌小环境进行分离，然后用封口膜将培养皿封住，可坚持10-15d，极大的保持了病原菌的纯度。
(3)本发明的分离纯化时用接种环在长有菌丝的地方轻轻刮取两下，在无菌水中震荡混匀，再划线，培养皿上一般出现10-30个单菌落，容易挑取纯化，无需显微镜观察，简化了步骤。
(4)本发明DNA的提取无需摇菌、过滤菌丝等繁琐步骤，从纯化过的培养皿上直接获得培养物，放入离心管中晾干，于液氮中冷冻，然后用细胞破碎仪研磨，每次可研磨64个样品，每天至少可提取100个样品，大大提高了工作效率，解放了人力；本发明从纯化过的培养皿上直接获得的培养物，若不直接提取DNA可放-20℃保存，不影响DNA的提取效果；本发明也适用于其他维管束病害的分离纯化、菌核型高通量DNA的快速获得。
(5)本发明ISSR分子标记优化反应体积为10μL，比前人用的反应体系25μL减少了一半以上，直接降低了扩增成本。引物优化为0.5-1μmol·L-1，此浓度扩增出的条带更亮，背景清晰，多态性更好
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是引物36在10μL体系，浓度0.5μmol·L-1的扩增结果。
图2是引物36在10μL体系，浓度1μmol·L-1的扩增结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
本发明的一个实施例提出的一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其步骤包括:
1)分离病原菌：将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭，剥皮，除去剥皮后的头端后，截成0.5-1.0cm小段，埋入第一培养基，得到孢子和菌丝；
2)单孢分离纯化：用接种环刮取所述的孢子和菌丝，和无菌水混合，得到孢子和菌丝悬浮液；取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线，26℃黑暗培养2-3d，得到菌落；用接种针挑取单菌落点到第三培养基中，26℃黑暗培养10-20d，得到直径5-8cm的菌落；
3)真菌DNA提取：取所述第三培养基上的培养物于离心管，吹干，加入磁珠，在液氮中冷冻后，震荡研磨，采用CTAB或真菌DNA提取试剂盒提取DNA提取DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取质量；
4)建立ISSR体系，优化反应的体系为10μL，引物为1μmol·L-1。
其中震荡研磨为间歇式，每次震荡研磨时间为1-3min，频率为20-30frequency 1/s，以防止离心管打穿。
实施例
本发明的一个实施例提出的一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其步骤包括:
1)采集棉花黄萎病病株，病株可在4℃保存4-6d，越新鲜越易分离纯化，否则容易污染；用灭菌的枝剪将棉秆截成10cm的小段，两节果枝之间的部分最佳；以下操作在无菌操作台中进行，用75％的酒精棉擦棉秆2次，一只手捏住棉秆一段，将棉秆剥皮，撕到手指捏住部分，剥皮时注意不要污染已经剥皮部分，用灭菌的枝剪减去剥皮的头端，然后将剩余剥皮部分截成0.5-1cm的小段，放到PDA培养基(第一培养基)上，用灭菌镊子将小段棉秆部分埋进培养基，每皿放5个小段，26℃黑暗培养3-4d；
2)待培养基上的小段棉秆长出孢子和菌丝，用接种环刮取孢子和菌丝于放有200μL无菌水的离心管中，然后震荡摇匀，制成孢子和菌丝悬浮液，用灭菌的接种环蘸取孢子悬浮液在新的PDA平板上划线(第二培养基)，于26℃黑暗培养2-3d，待孢子萌发长成菌落；用接种针挑取单菌落点到新的PDA培养基(第三培养基)中央，26℃黑暗培养15d，病原菌长至直径为6cm的菌落，为纯化菌株；用灭菌的接种环挑取少量纯化菌株接种于试管保存或打菌饼接种于新的PDA平板上用于生物学特性分析及其他研究；
3)用灭菌的镊子刮取纯化菌株的培养基上培养物的黑色部分(包括孢子和菌丝)，坚硬的部分则用镊子轻轻挑起(可能会带有少量培养基，不影响后期DNA质量及扩增效果)，将收集的0.2-0.5g的培养物放入2mL的离心管中，在超净工作台里吹干；在离心管中放入直径为8mm左右的磁珠，将离心管放入液氮中冷冻；从液氮中取出离心管，放到球磨仪上震荡研磨2min，30frequency 1/s，稍停，再震荡研磨2min，30frequency 1/s，以防止离心管打穿；研磨后采用CTAB法或真菌提取试剂盒提取DNA；将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取质量；保存于-20℃的冰箱待用；
4)建立ISSR体系，优化反应的体系为10μL，引物为1μmol·L-1。PCR反应体系为10μL：5μL 2×Taq PCR MasterMix，引物1μmol·L-1，模板DNA20-50ng，ddH2O补齐10μL。ISSR扩增条件：94℃5min；94℃45s，退火温度见附表1，72℃延伸1min，40个循环；最后延伸7min。
利用上述体系从哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物中筛选出27条背景清晰、多态性好的引物，并确定了每条引物的最佳退火温度如表1所示。
表1引物名称及退火温度
图1为引物36在10μL体系，浓度0.5-0.1μmol·L-1的扩增结果，图2为引物36在10μL体系，浓度1μmol·L-1的扩增结果。其中，M为MarkerDL2000，阴：模板为水，阳：模板为vd598。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，其步骤包括:
1)分离病原菌：将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭，剥皮，除去剥皮后的头端后，截成小段，埋入第一培养基，得到孢子和菌丝；
2)单孢分离纯化：用接种环刮取所述的孢子和菌丝，和无菌水混合，得到孢子和菌丝悬浮液；取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线，得到菌落；用接种针挑取单菌落点到第三培养基中，得到直径5-8cm的菌落；
3)真菌DNA提取：取所述第三培养基上的培养物于离心管，吹干，加入磁珠，在液氮中冷冻后，震荡研磨，提取DNA，并用凝胶电泳检测提取质量；
4)建立ISSR体系。
2.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的棉秆小段为0.5-1.0cm。
3.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的第一培养基、第二培养基和第三培养基均为PDA培养基。
4.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的第一培养基的培养条件为26℃黑暗培养3-4d；所述的第二培养基的培养条件为26℃黑暗培养2-3d；所述的第三培养基的培养条件为26℃黑暗培养10-20d。
5.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的步骤3)中的培养物的含量为0.2-0.5g。
6.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的磁珠的直径为5-10mm。
7.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的震荡研磨为间歇式，每次震荡研磨时间为1-3min，频率为20-30frequency 1/s。
8.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的提取DNA的方式为CTAB或真菌DNA提取试剂盒提取DNA。
9.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳。
10.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的ISSR体系的分子标记优化反应体积为10μL，其包括：
5μL 2×Taq PCR MasterMix，引物0.5-1μmol·L-1，模板DNA 20-50ng，ddH2O补齐10μL；
ISSR扩增条件为94℃退火5min，94℃退火45s，72℃延伸1min、40个循环，最后延伸7min。
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