CN101307298A - 一株广谱抗真菌地衣芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对植物病原真菌具有广谱拮抗能力、解磷能力和促进植物生长能力的植物内生地衣芽胞杆菌，具体地说是提供地衣芽胞杆菌R21(Bacillus licheniformis R21)菌株及其对植物病原菌的生长抑制作用、解磷能力、对植物的促生长能力。该菌株已于2007年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 207113。该菌株分离自珠海市农业科学研究中心种植的石斛兰叶片中，为革兰氏阳性菌，菌体杆状，产生芽孢，接触酶阳性。生长最适pH范围为5.1～8.2，最适生长温度为37℃，最高可以在55℃生长。在LB培养基上，菌落的老培养物呈现出干燥皱缩的菌落特征。

Description

一株广谱抗真菌地衣芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种对植物病原真菌具有广谱拮抗能力、解磷能力和促进植物生长能力的植物内生地衣芽胞杆菌，具体地说是提供地衣芽胞杆菌R21(Bacillus licheniformis R21)菌株(CCTCC M 207113)及其对植物病原菌的生长抑制作用、解磷能力、对植物的促生长能力。它属于生物农药、解磷微生物肥料和植物促生制剂的范畴。

背景技术

我国水果、蔬菜等园艺作物因病害引起的损失非常严重，根据1984-1986全国园林植物病虫害普查的结果，在1256种园林植物上发现植物病害5508种，平均每种植物上4.4种，蔬菜、花卉、果树等园艺作物的病害发生远比大宗禾谷类农作物严重。据我国农业部全国农业技术推广中心统计，我国农作物每年因病虫草鼠造成大量损失，其中水果、蔬菜损失达25％以上，远远大于粮食(10％)和棉花(15％-20％)。尤其是近年来，随着农村经济的发展和农业产业结构的调整，越来越多的农民从事园艺作物的生产和栽培，由于在有限的土地上长期轮作，土传病害、维管束病害严重影响了农业的健康发展。

随着农业可持续发展战略的实施，人们逐渐重视化学农药的危险和危害，因此，符合环保、健康、高效、安全、环境友好的生物农药成为当前生态农业研究的主题。目前国际上生物农药产品已超过100多种，但90％以上是微生物杀虫剂。有专家预测第二个重要的商业化生物农药将是微生物杀菌剂。

在各类防治植物病害的生物农药中，细菌制剂是较多的一类。国内外已经有数十个相关产品登记，已开发成功的细菌生防制剂主要为芽胞杆菌(Bacillus)、荧光假单孢杆菌(Pseudomonas radiobacter)和放射性土壤农杆菌(Agrobacterium radiobacaer)。如防治小麦纹枯病的麦丰宁B3，防治植物细菌性青枯病的青枯净，防治小麦全蚀病的蚀敌、消蚀灵，防治果树根癌病的K84、DigG(美国)和Nogall(澳大利亚)等等。

芽胞杆菌是土壤、植物体内、体表和根际的重要微生物种群，其突出特征是能产生耐热抗逆的芽胞，这有利于芽胞杆菌作为生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖，田间应用研究已证实芽胞杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面，明显优于非芽胞杆菌和真菌生防菌。因此，国内外学者对芽胞杆菌作为生防因子进行了大量的研究，也筛选出多株具有明显生防功能的菌株。纪兆林等从番茄根际土壤中分离到一株地衣芽胞杆菌W10，该菌对苹果轮纹病菌、柑橘炭疽病菌和柑橘青霉病菌具有明显的抑制作用。郭荣君等筛选出来的地衣芽胞杆菌BH1用于防治大豆根腐病，其田间小区防治效果平均达到56.1％。唐丽娟等从土壤中筛选出一株对多种植物病原菌有抑制作用的地衣芽胞杆菌W10，对番茄灰霉病的田间防效可达60％以上，具有在番茄植株体表定殖竞争能力、诱导植株产生系统抗性能力。

近年来，我国有从棉花、水稻、马铃薯、番茄、辣椒等植物中分离到内生菌，并证明了某些内生菌对植物病害具有防治效果的报道。植物内生菌长期生活在植物体内微环境中，并与之协同进化，在演化过程中二者形成了互惠关系，一方面植物为内生菌提供光合作用产物和矿物质，另一方面内生菌的代谢物能刺激宿主植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。植物内生菌在微生物农药的开发中体现出很强的应用潜力。

吴蔼民2000年报道了内生菌73a和Ala对棉花黄萎病的田间防效及增产作用，其中73a的田间防效达51.28％，表现出18.15％的增产效果。袁军等2002年报道了防治马铃薯环腐病有益内生菌的分离和筛选及防病效果，筛选出5个比较好的菌株，其中118菌株定殖、促生、拮抗3种作用兼备。黎起秦等2003年报道了番茄青枯病内生拮抗细菌的筛选及防病效果。其中内生菌B47对番茄青枯病的大田防效达74.98％。何红等2004年报道了辣椒内生拮抗细菌的筛选及防病效果。其中BS-1和BS-2菌株对辣椒炭疽菌的防效10d以后为57.34％％～94.08％％，另外在田间对辣椒喷施两种菌液发现20d没有炭疽菌发病，而对照发病率为15％。张立新等2005年报道了番茄内生真菌对多种植物病原菌的抑制效果。其中Fq72菌株的培养滤液对灰霉和菌核病菌的抑制效果分别达到75.68％和66.11％。

内生菌的使用方式非常简单，可以通过人工接种方法将有防病活性的内生菌接种到植物体内，发挥内生菌的防病作用。目前常用的人工接种内生细菌的方法有3种：①灌根接种法，用内生菌悬浮液浇灌植株根际，这种方法可以使内生菌进人植物根茎内；②浸种接种法，在播种前将宿主植物的种子在含有内生菌悬浮液中浸泡一定时间，在生长出的植物体内可以检测到被标记的内生菌；③涂抹叶片接种法，何红等采用这种方法可以将枯草芽胞杆菌BS-2菌株接种到多种植物体内。

目前美欧等国的一些种子公司已经生产内生菌含量高的草坪用草品种。据不完全统计，1990年就有大约6000吨含有内生菌的不同品种黑麦草投入应用。虽然与化学农药相比目前应用内生菌进行病害的防治的比例还很少，但是相信随着深入的研究，它们必将代替化学农药成为主要的植物保护药剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物内生地衣芽胞杆菌。

本发明提供的地衣芽胞杆菌R 21(Bacillus licheniformis)，已于2007年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M207113。

该菌株分离自珠海市农业科学研究中心种植的石斛兰叶片中，为革兰氏阳性菌，菌体杆状，产生芽孢，接触酶阳性，具有淀粉水解、明胶液化能力，能够利用柠檬酸，V.P.试验呈正反应，具有糖酵解能力，硝酸盐还原能力，能够在厌氧条件下生长，可以在7％NaCl中生长，能够以果糖、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、精氨酸、苹果酸为唯一碳源生长，能够以牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、酪蛋白、氯化铵为唯一氮源生长，几乎不利用硝酸钾，生长最适pH范围为5.1～8.2，最适生长温度为37℃，最高可以在55℃生长。在LB培养基上，菌落的老培养物呈现出干燥皱缩的菌落特征。

本发明的另一目的在于提供该菌株在用于广谱抗真菌生物农药方面的用途。

本发明的另一目的在于提供该菌株在用于解磷微生物肥料方面的用途。

本发明的另一目的在于提供该菌株在用于促进植物生长方面的用途。

本发明提供的上述菌株被证明能够在无菌的石斛兰组织培养苗不同部位正常定殖，对分离自热带洋兰、棕榈科植物的多种植物病原真菌具有较好的平板拮抗活性，尤其对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌等土传维管束病害具有很好的拮抗能力，并在温室和田间表现出良好的防治效果。

附图说明

本发明所述的地衣芽胞杆菌R 21(Bacillus licheniformis)，已于2007年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国湖北省武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏号为CCTCC M207113。

图1pH值对R21生长的影响；

图2温度变化对R21生长的影响。

具体实施方式

实施例1：R 21的分离纯化和理化性质研究

(1)R21的分离、纯化

在珠海市农业科学研究中心的石斛兰种植温室中，采集健康的双色石斛石斛叶片，在自来水下冲洗干净，晾干后再进行表面消毒。先用75％酒精处理1min，再用5％的NaClO处理5min，无菌水漂洗4次，晾干后，用无菌剪刀和镊子将叶片剪成0.2cm×0.5cm左右的组织块，铺于加入放线菌酮50μg/ml的NA培养基(牛肉膏蛋白胨培养基，又称肉汤培养基)上，28℃恒温培养2个星期，每天观察结果，一旦发现有菌从切口长出即挑出，于新的平板纯化培养，以菌液形式用20％甘油保存于-20℃及-80℃。再取第4次漂洗的无菌水200μl涂于上述平板，做3个重复，同等条件培养，观察是否长菌。另设对照，将叶片剪成同样大小的组织块，再经过上述表面消毒程序处理，然后铺于上述3种培养基上同等条件培养，观察是否有菌长出。一旦发现无菌水涂的平板和(或)对照平板长菌，则相应的分离平板上分离到的菌放弃。

(2)R21的鉴定

鉴定用培养基：

①LB培养基(培养细菌)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2。

②淀粉培养基(用于鉴定细菌)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，可溶性淀粉2g，pH7.2～7.4。

③明胶液化培养基(用于细菌鉴定)：蛋白胨5g，明胶150g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4。

④柠檬酸盐培养基(用于细菌鉴定)：柠檬酸钠2g，K₂HPO₄ 0.5g，NH₄NO₃ 2g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，0.04％苯酚红1ml。配制时先将除指示剂外的药品加热溶解、过滤、调pH6.8～7.0，再加指示剂，分装试管。

⑤葡萄糖蛋白胨培养液(用于细菌鉴定)：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 5g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2。

⑥硝酸盐还原培养基(用于细菌鉴定)：蛋白胨10g，NaCl 5g，KNO₃(分析纯)2g，蒸馏水1000ml，pH7.4。

⑦阿拉伯糖培养基(用于细菌鉴定)：NH₄HPO₄ 1.0g，KCl 0.2g，MgSO₄0.2g，酵母膏0.2g，阿拉伯糖10g，蒸馏水1000ml，0.04％溴甲酚紫15ml，pH 7.2。

⑧pH5.7生长培养培养基(用于细菌鉴定)：蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 70g，水1000ml，pH5.7。

⑨7％NaCl生长培养基(用于细菌鉴定)：蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 70g，水1000ml，pH7.0。

表1 R21生理生化特征

+表示阳性反应

实施例2：R21的生物学特性研究

基本培养基(测试不同碳、氮源的利用情况)(g/L)：NaH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，CaCl₂ 0.5g，pH7.2，蒸馏水1L。碳源对R21生长的影响如表2所示。氮源对R21生长的影响如表3所示。

表2 唯一碳源对R21生长的影响

表3 唯一氮源对R21生长的影响

8个不同pH培养条件下，R21生长情况如图1。结果显示，R21生长的最适pH范围是5.1～8.2，当pH＜4.1或＞11.0时R21的生长受到抑制。

R21在不同的培养温度下生长有差异(如图2所示)。37℃培养时R21生长最好，随着温度的升高和降低，R21的生长受到抑制。

实施例3：R21对热带洋兰植物病原真菌的拮抗实验

(1)受试病原真菌

分离来源：从珠海市农业科学研究中心种植的石斛兰、文心兰、大花蕙兰和万带兰上分离植物病原真菌，用于测试R21对这些病原真菌的拮抗活性。

分离方法：将患病兰花叶片的病斑包括病健交界处完整剪下，获得大小为1～1.5×1～1.5cm的病组织块，将病组织块放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作将其移入0.1％升汞中进行表面消毒30s，无菌水漂洗3次，用无菌剪刀从病斑的病健交界处剪取小块(每边长0.3～0.4cm)，接种于PDA培养基(马铃薯培养基)平板，28℃培养。

纯化方法：在PDA培养基上，一旦发现有菌丝从组织小块长出，马上将其转接到另一新的平板上，经纯化后保存于PDA斜面，4℃条件下保藏待用。

回接测定致病性：根据柯赫氏法则(Koch’s Postulate)，采用无伤接种和致伤接种两种方式将分离菌回接石斛兰、文心兰、大花惠兰和万带兰小苗的叶片(苗龄为1～2个月)，验证其致病性。接种前，叶子均用75％酒精做表面消毒，待酒精挥发完全后再接种。无伤接种是将分离菌通过液体摇瓶培养7天后用4层无菌纱布过滤菌丝获得的孢子悬浮液(调整其浓度为5.04×10⁷cfu/ml左右)，喷雾接种小苗的叶片，套袋保湿24h。致伤接种是先用无菌软毛刷在叶片表面造成轻微的伤口，再用接种针挑取一小块已在PDA上培养7天的分离菌菌块，反扣于伤口上，套袋保湿24h。以上处理做3个重复，一个重复一株苗，每株苗接种3个叶片，另设两组不接菌小苗为对照，其中一组致伤，另一组喷PDA培养液。供试苗置于温室中培养，白天26～29℃，相对湿度80～90％左右。每天观察记录其发病情况。

通过上述步骤，从石斛兰、大花蕙兰和万带兰中分离了10株病原真菌，分别编号，其中编号B10b、SHL-12、SHL-3、SHL-8的病原真菌，分离自石斛兰；编号DHL-5、Baj、DHL-15E、DHL-33A、DHL-33B的病原真菌，分离自大花惠兰；编号为SL-1的病原真菌，分离自万带兰。通过镜检和平板培养特性判断，上述病原真菌属于不同的种类，其中只有B10b被鉴定为串珠镰刀菌，其他菌株未鉴定到种。

(2)对上述真菌的拮抗活性

在PDA平板中央接种直径为5mm的病原菌菌块，相距3cm处点接R21，28℃恒温培养6天，观察抑菌带有无，并测定大小，每个处理重复3次，设不接内生菌的处理为对照。

表4、R21对热带洋兰病原真菌的拮抗活性

注：抑菌效果通过抑菌带大小表示：+，≤5mm；5mm＜++＜10mm；+++≥10mm

实施例4：R21对由串珠镰刀菌引起石斛兰叶斑病的温室防治研究

(1)R21对串珠镰刀菌B10b菌丝生长的影响

R21对石斛兰叶片分离串珠镰刀菌B10b的菌丝生长和孢子萌发均具有较好的抑制效果。显微镜观察显示拮抗菌处理后，引起B10b菌丝和分生孢子产生明显变化：与对照相比，处理后的菌丝表现为菌丝粗糙、畸形肿胀、破裂、内含物外流等症状；孢子畸形，出现中间膨胀、两端缢缩的非正常表现。

(2)R21发酵液对串珠镰刀菌B10b孢子萌发的影响

R21发酵液对串珠镰刀菌分生孢子的萌发具有明显的抑制作用，培养12h后对照分生孢子萌发率为74.35％，处理孢子的萌发率随发酵液量的增加而下降(见表5)。经计算，R21的发酵液对串珠镰刀菌分生孢子萌发率的EC₅₀为498.884μl/ml。

R21经LB液体培养基摇瓶培养后无菌处理，得发酵液。采用凹玻片法测定不同量的发酵液(10μl、20μl、40μl、50μl、60μl)对孢子萌发的影响，以加60μl LB培养液为对照。28℃保湿培养12h后计算孢子萌发率，并换算出EC₅₀。

表5、R21发酵液对石斛兰叶斑病串珠镰刀菌的孢子萌发率的EC₅₀测定

(3)R21对串珠镰刀菌B10b引起叶斑病的温室防治研究

以珠海市农业科学研究中心培育的双色石斛(Dendrobiumchrysopterum)作为供试品种，试验选择1年苗龄、长有3～4片叶的健康石斛兰苗。试验开始前两周移至温室，每星期浇水一次，温室温度20～29℃，相对湿度保持在90％左右。制备串珠镰刀菌孢子悬浮液(约1.25×10⁷cfu/ml)、R21菌液(约1.93×10⁸cfu/ml)。设4组试验，见表6。

表6、温室防治试验设置

以上每个重复10株苗，每株苗处理顶端3个叶片，每组处理3个重复。苗置于温室中培养，白天26～30℃，夜晚20℃左右，相对湿度80～90％。每天观察结果，记录发病情况，两个星期后按7级分类标准计算病情指数，并计算苗株的发病率和内生菌对石斛兰叶斑病的防治效果。采用SPSS12.0软件中的LSD法进行统计分析。

病情分类标准如下：

0级——无病症

1级——接种叶出现可见的褪绿小点或黄色小点

2级——接种叶出现1～5个黑色斑点

3级——接种叶上出现6～10个黑色斑点或叶尖出现黑斑

4级——接种叶上出现11～15个黑色斑点

5级——接种叶上出现16～20个黑色斑点

6级——接种叶上出现20个以上黑色斑点

计算公式：

注：对照区是指C组处理。

表7、R14菌液对串珠镰刀菌引起石斛兰叶斑病的温室防治效果

实施例5：R21对棕榈科植物病原菌的拮抗活性研究，如表8所示。

从珠海市范围内的棕榈科植物15种植物上，共分离得到50株病原真菌。

具体分离方法如下：

分离来源：从珠海市农业科学研究中心种植的16种棕榈科植物上分离病原真菌，用于测试R21对这些病原真菌的拮抗活性。

分离方法：将患病棕榈科植物的病斑包括病健交界处完整剪下，获得大小为1～1.5×1～1.5cm的病组织块，将病组织块放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作将其移入0.1％升汞中进行表面消毒30s，无菌水漂洗3次，用无菌剪刀从病斑的病健交界处剪取小块(每边长0.3～0.4cm)，接种于PDA培养基平板，28℃培养。

纯化方法：在PDA培养基上，一旦发现有菌丝从组织小块长出，马上将其转接到另一新的平板上，经纯化后保存于PDA斜面，4℃条件下保藏待用。

回接测定致病性：根据柯赫氏法则(Koch’s Postulate)，采用无伤接种和致伤接种两种方式将分离菌回接棕榈科植物的叶片，验证其致病性。接种前，叶片均用75％酒精做表面消毒，待酒精挥发完全后再接种。无伤接种是将分离菌通过液体摇瓶培养7天后用4层无菌纱布过滤菌丝获得的孢子悬浮液(调整其浓度为5.04×10⁷cfu/ml左右)，喷雾接种棕榈科植物的叶片，套袋保湿24h。致伤接种是先用无菌软毛刷在叶片表面造成轻微的伤口，再用接种针挑取一小块已在PDA上培养7天的分离菌菌块，反扣于伤口上，套袋保湿24h。每天观察记录其发病情况。大王椰子等树型高大的棕榈科植物，则采用离体回接检测致病性。将大王椰的羽状复叶剪下，置于蔗糖水溶液中保持枝条的活性，然后按上述方法接种验证致病性。

通过上述方法，共分离获得50株病原真菌，根据孢子形态和平板培养性状判断，50株病原真菌各不相同，应属于不同的种，但未对病原真菌鉴定到种。

通过平板对峙研究发现，R21对其中的45株病原真菌都有明显的拮抗活性，表明R21对棕榈科植物的病原真菌具有广谱拮抗活性。

表8、R21对分离自不同棕榈科植物病原真菌的拮抗作用测定

注：抑菌效果通过抑菌带大小表示：+，≤5mm；5mm＜++＜10mm

实施例6：R21对其他植物病原真菌的拮抗活性，结果如表9所示。

表9、R21对几种植物病原真菌的平板拮抗活性测定

注：抑菌效果通过抑菌圈大小表示：-，无活性；+，＜5mm；++，≥5mm，＜10mm；+++，≥10mm.

Cand，白色念珠菌；Sacc，酿酒酵母；Aspe，黑曲霉；Curv，新月弯孢霉；Alte，梨黑斑交链孢霉；Dipl，芒果蒂腐菌；Fusa，西瓜枯萎菌。

实施例7：R21对由尖孢镰刀菌引起西芹黄萎病Fusarium oxysporumSchlecht.f.sp.apii Snyd.et Hans的温室防治研究

(1)R21发酵液的制备及喷施方法

LB培养基37℃，180rpm培养48h，稀释成100倍、200倍和300倍，在西芹苗期喷叶，以叶片喷湿为宜，每隔10天喷施一次，连续喷施5次，在收获前20天喷施第6次。

(2)黄萎病病原孢子的制备及接种方法

用PD培养基(马铃薯培养基(不加琼脂))接种西芹病原菌在30℃，130rpm培养6d，滤去菌体后离心收集孢子；西芹从移栽到收获共接种两次病原菌，移栽时用无菌土与孢子混合配成5.95×10⁵个孢子每克土，西芹伤根后栽入带菌土中，收获前15d伤根接种4.3×10⁵个孢子每株西芹。

(3)实验方法

2007年9月25日将伤根后的西芹移栽到装有带菌土的小盆子后把西芹分为4组，每组50株苗，分别将4个组设为CK、R21菌液稀释100倍喷施6次、R21菌液稀释200倍喷施6次、R21菌液稀释300倍喷施6次4个处理。经过6次的R21喷叶处理和两次的病原菌接种，共103天盆栽，于2008年1月7日收获西芹并完成R21防治西芹黄萎病原数据统计分析。

收获时对黄萎病原在西芹茎基部的侵染点进行了病情分类统计：1级——5个侵染点以下；2级——5个侵染点以上但未形成侵染圈；3级——形成侵染圈。具体的数据分析见表10、11、12，计算公式：

表10、R21不同处理的西芹病情指数

从表10可以看出，使用R21发酵液处理，能够减少西芹黄萎病发病的严重程度，以300倍稀释后喷施6次的效果最为明显。

表11、R21发酵液稀释不同倍数处理的西芹黄萎病发病率

从表11可以看出，R21发酵液处理，可以减少西芹黄萎病的发病率，以R21发酵液稀释300倍处理6次的发病率最低。

表12、R21发酵液稀释不同倍数处理对西芹黄萎病的防治效果

从表12可以看出，R21发酵液的不同处理都能够防治西芹黄萎病的发生，但以R21发酵液稀释300倍的效果最好。

(4)结果分析

从表中可看出喷施过R21菌液的各处理与对照比较，对西芹黄萎病的防治有明显效果，R21菌株的防治效果以300倍液喷施6次的结果最佳，200倍液喷施6次和100倍液喷施6次处理的结果无显著差异，说明R21菌液的防治效果不与R21液菌的喷施浓度成正比。

实施例8、R21对由尖孢镰刀菌引起西芹黄萎病Fusarium oxysporumSchlecht.f.sp.apii Snyd.et Hans的田间防治研究

2006年12月，在珠海白藤湖无公害蔬菜生产基地开展了R21发酵液对西芹黄萎病田间发病防治效果的初步实验。发酵液稀释200倍和100倍后灌根处理西芹，灌根量按60棵苗灌10斤水的量，平均每棵西芹用量100ml。每种浓度的R21处理90行，共900株苗，以同一畦未喷洒R21的西芹做对照。开始实验时西芹已经种植40天，并开始发病。从12月1日到12月27日间共处理3次，2007年1月5日调查结果如下(表13)：

表13、不同稀释倍数的R21发酵液田间处理西芹的发病情况

根据表13的数据计算，100倍发酵液处理西芹对西芹黄萎病的发病有一定的控制效果，防治效果达到60.45％。

实施例9：R21对香蕉枯萎病Fusarium oxysporum Schl.f.cubense(E.E.Smith)Snyder et Hansen的生物防治研究

(1)对不同生理和地理小种的拮抗能力测定

R21对香蕉枯萎病病原菌Fusarium oxysporum Schl.f.cubense(以下简称FOC)的不同生理和地理小种的菌丝生长和孢子萌发均具有较好的抑制效果。平板对峙测定R21对不同地理和生理小种的抑菌带宽如下：FOC1(珠海)——5.11mm；FOC4(珠海)——4.24mm；FOC1(湛江)——3.57mm；FOC4(湛江)——2.12mm。显微镜观察显示拮抗菌处理后，均引起不同地理和生理FOC小种的菌丝和分生孢子明显变化：与对照相比，处理后的菌丝表现为菌丝粗糙、畸形肿胀、破裂、内含物外流等症状；孢子畸形，出现中间膨胀、两端缢缩的非正常表现。

(2)对香蕉的温室防治试验

利用R21对香蕉枯萎病4号生理小种(FOC4)进行温室生物防治试验，试验香蕉苗品种为巴西蕉(无病组培苗，株高约15cm)。R21使用方法：发酵液稀释100倍，50ml灌根，每隔7d施用一次，共施用7次。数据统计表明：对照处理1(未接病原菌)的蕉苗死亡率为0，对照处理2(接种病原菌)的蕉苗死亡率为50％，R21处理的蕉苗(接种病原菌)死亡率为43.33％。

(3)对粉蕉的田间防治试验

利用R21对香蕉枯萎病1号生理小种(FOC1)进行田间生物防治试验，试验香蕉苗品种为粉蕉。R21使用方法为：发酵液稀释100倍，喷叶(以叶片喷湿为宜)，每个月喷一次。数据统计表明：对照小区(未喷施R21发酵液)的粉蕉发病率为20.13％，处理小区(喷施R21发酵液)的粉蕉发病率为12.88％；同时，发病后，对照小区的粉蕉植株死亡率为77.78％，而处理小区的死亡率则为0。横向剖开发病植株的球茎可以很明显看出，对照小区的粉蕉植株球茎与处理小区的相比，具有更多的褐色小点(病原菌侵入点)，甚至连成一片。而处理的则相对少很多，基本上是成散状分布。实验结果可以说明，R21对由FOC1引起的枯萎病具有明显的防治作用，甚至可以起到治愈的效果。

实施例10：R21的解磷能力测定

(1)R21对无机磷的分解能力测定

所用试剂和培养基：

1.无机磷培养基(用于具有解磷能力内生菌的筛选和解磷能力的检测)：

葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄ 0.036g，MnSO₄·H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 2g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.0。

2.50μg/ml磷标准溶液：KH₂PO₄(分析纯)0.2195g，浓硫酸5ml，蒸馏水1000ml。

准确称取在105℃烘干的KH₂PO₄(分析纯)0.2195g溶解在400ml水中，加入5ml浓硫酸，在1000ml的容量瓶中定容至1000ml。

3.钼锑抗试剂：钼酸铵10g，浓硫酸153ml，酒石酸锑钾0.5g，抗坏血酸1.5g，蒸馏水1000ml。

称取0.5g酒石酸锑钾溶解于100ml蒸馏水中成A液；10g钼酸铵溶于450ml蒸馏水中，再缓慢加入153ml浓硫酸制成B液。将A液和B液混合，定容至1000ml，储存于棕色瓶中，用之前再加入1.5g抗坏血酸，即为钼锑抗试剂。

4、R21对无机磷的溶解能力测定结果(表14)

在添加有磷酸钙的无机磷培养基中接种R21，发酵后测定培养基中可溶性磷的含量，通过标准曲线计算获得R21处理后，发酵液中磷的含量达到39.76μg/ml，校正后的净溶磷量达到30.89μg/ml。

表14、R21对磷酸钙的溶解能力测定结果

(2)R21对有机磷的分解能力测定

基础培养基葡萄糖10g，酵母粉0.5g，CaCl₂ 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，蒸馏水1000mL，琼脂20g。有机磷细菌分离方法：用酒精棉球擦净鸡蛋外壳，用10ml注射器(灭菌备用)从鸡蛋中抽取蛋黄置一灭菌的空试管中，加入等量的0.85％生理盐水(灭菌)充分摇匀，制成蛋黄液(注意不要混有蛋清)。吸取3ml蛋黄液加入已融化的基础培养基中(培养基温度不宜过高，在45℃左右加入蛋黄液较适宜)，充分混匀后，倒平板。根据平板上菌落周围出现的透明区来判断该菌株是否产生有机磷分解酶，可根据透明圈的大小初步判断细菌分解卵磷脂能力的强弱。测定发现R21能够在含有卵磷脂的培养基上生长，能够形成0.8cm的溶磷圈。

实施例11、R21对西芹的增产效果研究

使用穴盘育苗的西芹用于实验。在西芹苗期使用R21发酵液稀释不同倍数喷叶，每个处理50株苗，设不喷R21的对照。所有西芹苗均盆栽，种植于珠海市农业科学研究中心温室中，103天后收获西芹，测量单株西芹的地上部分的高度和重量，并使用SPSS10.0的方差分析和多重比较工具对数据进行分析。

表15.R21不同处理对西芹株高的影响

注：表中同一栏中不同的小写字母表示方差分析和多重比较差异显著(P＜0.05)，下同。

表16.R21发酵液处理对单株重量的影响

从表15和16可以看出，R21发酵液苗期喷施西芹叶面，可以显著提高西芹的株高和单株重量，以发酵液稀释100倍喷施5次的效果最好。

Claims (10)

1.一种地衣芽胞杆菌R21，保藏号为CCTCC M 207113。

2.根据权利要求1所述的一种地衣芽胞杆菌R21，其特征在于，该菌株为革兰氏阳性菌，菌体杆状，产生芽孢，接触酶阳性。

3.根据权利要求1所述的一种地衣芽胞杆菌R21，其特征在于，该菌株具有淀粉水解、明胶液化能力，能够利用柠檬酸，V.P.试验呈正反应，具有糖酵解能力，硝酸盐还原能力，能够在厌氧条件下生长，可以在7％NaCl中生长，能够以果糖、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、精氨酸、苹果酸为唯一碳源生长，能够以牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、酪蛋白、氯化铵为唯一氮源生长，几乎不利用硝酸钾，生长最适pH范围为5.1～8.2，最适生长温度为37℃，最高可以在55℃生长。

4.根据权利要求1所述的一种地衣芽胞杆菌R21，其特征在于，该菌株在LB培养基上，菌落的老培养物呈现出干燥皱缩的菌落特征。

5.权利要求1所述的地衣芽胞杆菌R21在抑制植物病原菌方面的应用。

6.权利要求1所述的地衣芽胞杆菌R21在防治尖孢镰刀菌引起的西芹黄萎病方面的应用。

7.权利要求1所述的地衣芽胞杆菌R21在防治香蕉枯萎病病原菌FOC方面的应用。

8.权利要求1所述的地衣芽胞杆菌R21在解磷方面的应用。

9.权利要求1所述的地衣芽胞杆菌R21在作物促生长方面的应用。

10.根据权利要求9所述的地衣芽胞杆菌R21在作物促生长方面的应用，其特征在于，所述作物为西芹。

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