CN103789240A - 一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基及发酵方法，培养基配方为：蔗糖25～35g／L，NH4Cl0.8～1.2g／L，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·H2O0.03g，MgSO4·7H2O0.3g，KH2PO42.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。本发明还提供了该提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法。本发明使蜡样芽孢杆菌处于最佳生长状态，能有效提高解磷细菌菌剂制备的效率和解磷效果，降低菌剂生产成本，促进植物生长。
Description
技术领域
本发明属于蜡样芽孢杆菌解磷能力探索技术领域，涉及一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
磷是植物生长发育必需的营养元素，缺磷可导致农作物产量明显降低。土壤全磷含量虽然较高，但多以难溶态存在，难以被植物吸收利用。为了获得高产，生产上反复施用大量磷素化肥，其中大约70％转化为Ca-P，Fe-P和Al-P等难溶性化合物而储存在土壤中，这不仅耗竭有限的磷矿资源、造成环境污染，还会给食物安全和人类健康带来影响。
微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，作物能够获得特定的肥料效应，在这种效应的产生中，制品中活性微生物起关键作用。所以产品中必须要有足够数量的有效微生物存在，以保证在施入田间后能够作为优势菌种存活，具备抗逆、强竞争存活能力。而研究其最佳生长条件对于提高微生物的生物量具有十分重要的作用。
影响微生物生长的因素很多，总体可以分为营养条件和培养条件两方面。前者包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和微量元素等，涉及它们的种类、浓度及相互之间的比例关系。后者包括温度、氧分压、pH、渗透压等因素。
解磷微生物是土壤中能够将无效磷转化为植物可以吸收利用的有效磷的一类特殊微生物功能群体，在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用。解磷细菌是解磷微生物中重要的一类，通过活化土壤磷元素或影响植物根系分泌物的种类和数量，增加植物根系对K，Ca，Mg，Fe，Zn等营养元素的吸收，从而促进植物的生长发育。解磷细菌还通过分泌各种酶类或有机酸来活化土壤中的难溶态磷，并影响根际微生物的群落结构。大量研究表明，施用含有高效解磷细菌的微生物菌剂能显著促进植物生长、改善植株根际环境。
目前针对解磷细菌采用的发酵培养基为：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·H2O0.03g，MgSO4·7H2O0.3g，KH2PO42.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。这是一种广谱性的发酵培养基，而针对来自不同植物根际、不同种类的解磷细菌筛选出适宜的培养基，优化解磷细菌的培养条件，提高解磷细菌的解磷活性，对开发高效优质解磷菌剂、降低解磷细菌菌剂的生产成本，提高菌剂生产效率等具有重要的意义。
核桃是长江中上游地区退耕还林、水土保持常用的经济林之一。目前针对从核桃根际筛选出的高效解磷细菌的培养基以及相应的培养方法的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有培养解磷细菌的培养基存在成本高、发酵后生物量低及不适合于发酵培养蜡样芽孢杆菌的问题，提供一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基及发酵方法。其具体技术方案为：
一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基，其配方为：蔗糖25～35g／L，NH4Cl0.8～1.2g／L，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·H2O0.03g，MgSO4·7H2O0.3g，KH2PO42.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。
一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，括以下步骤：
步骤一：蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化培养得到斜面菌种；
步骤二：将斜面菌种接种到液体种子培养基上培养，得到液体种子液；
步骤三：将步骤二获得的液体种子液接种到提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基上，搅拌培养，即得到蜡样芽孢杆菌液体菌剂。
进一步优选，步骤一中蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化培养的温度为28℃，活化培养的时间为24h。
进一步优选，步骤一获得的液体种子液pH值为7.0。
进一步优选，步骤三中液体种子液接种到培养基的比例为：6％液体种子液：100mL培养基。
进一步优选，步骤三液体种子液接种到提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基后搅拌速度为125r／min，温度为28℃，搅拌时间为56h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基及发酵方法是针对从核桃根际筛选出来的高效解磷细菌-蜡样芽孢杆菌，获得能提高该菌株解磷能力的一种发酵培养基和发酵方法。本发明通过改变发酵培养基中的碳源、氮源，并对发酵条件接种量、初始pH值及装液量及进行优化，发酵培养基成本低，发酵周期短，活菌量高，使蜡样芽孢杆菌处于最佳生长状态，解磷活性大幅提高，能有效提高解磷细菌菌剂制备的效率和解磷效果，降低菌剂生产成本，促进植物生长。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明的实施例提供的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基配方如下：
蔗糖25～35g／L，NH4Cl0.8～1.2g／L，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·H2O0.03g，MgSO4·7H2O0.3g，KH2PO42.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。
图1示出了本发明提供的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
如图1所示，本发明实施例的另一目的是提供一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，该提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法包括以下步骤：
步骤一：蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化培养得到斜面菌种；
步骤二：将斜面菌种接种到液体种子培养基上培养，得到液体种子液；
步骤三：将步骤二获得的液体种子液接种到提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基上，搅拌培养，即得到蜡样芽孢杆菌液体菌剂。
作为本发明实施例的一优化方案，步骤一中蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化培养的温度为28℃，活化培养的时间为24h。
作为本发明实施例的一优化方案，步骤一获得的液体种子液pH值为7.0。
作为本发明实施例的一优化方案，步骤三中液体种子液接种到培养基的比例为：6％液体种子液：100mL培养基。
作为本发明实施例的一优化方案，步骤三液体种子液接种到提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基后搅拌速度为125r／min，温度为28℃，搅拌时间为56h。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
针对本发明中从核桃植株根际筛选出来的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，对碳源(蔗糖)、氮源(NH4Cl)的浓度，以及发酵方法进行了优化。
(一)发酵培养基制备实施例
发酵培养基制备实施例1：
蔗糖10g／L、NH4Cl0.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H12O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例2：
蔗糖10g／L、NH4Cl1.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例3：
蔗糖10g／L、NH4Cl1.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例4：
蔗糖10g／L、NH4Cl2.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H200.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例5：
蔗糖15g／L、NH4Cl0.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2OO.03g、MgSO4·7H2O O.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例6：
蔗糖15g／L、NH4Cl1.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例7：
蔗糖15g／L、NH4Cl1.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例8：
蔗糖15g／L、NH4Cl2.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例9：
蔗糖20g／L、NH4Cl0.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0 g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例10：
蔗糖20g／L、NH4Cl1.0g／L、NaCl O.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例11：
蔗糖20g／L、NH4Cl1.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.O～7.5。
发酵培养基制备实施例12：
蔗糖20g／L、NH4Cl2.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例13：
蔗糖30g／L、NH4Cl0.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例14：
蔗糖30g／L、NH4Cl1.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例15：
蔗糖30g／L、NH4Cl1.5g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H200.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
发酵培养基制备实施例16：
蔗糖30g／L、NH4Cl2.0g／L、NaCl0.3g、KCl0.3g、FeSO4·7H200.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.O～7.5。
用于解磷细菌培养的常规培养基：
葡萄糖10g／L、(NH4)2SO40.5g／L、NaCl0.3g、KCl O.3g、FeSO4·7H2O O.03g、MnSO4·H2O0.03g、MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
(二)发酵方法实施例
发酵方法实施例1：
将发酵培养基pH值调至7.0，其他组分和浓度不变。
发酵方法实施例2：
将蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上28℃活化培养24h得到斜面菌种，然后将斜面菌种接种到液体种子培养基上培养，得到液体种子液。将种子液按6％的接种量接种培养。
发酵方法实施例3：
将上述液体种子液以6％的接种量装入100mL本发明的培养基，在28℃条件下以125r／min的速度搅拌培养56h，即得到蜡样芽孢杆菌液体菌剂。
常规发酵方法：
发酵培养基pH值为6.0～6.5，种子液接种量为5％，装液量为125mL，28℃条件下以125r／min的速度搅拌培养。
实施例效果：在本申请的培养基上解磷细菌蜡样芽孢杆菌的菌体生长量和解磷能力最高，分别为2.013和172.05mg／L，是常规培养基上的118.51％和152.07％。另外，解磷细菌蜡样芽孢杆菌的种子液以6％的接种量，100mL的装液量，转速为125r／min，发酵培养温度28℃时其液体菌剂的菌体生长量和解磷量最高，分别为2.149和188.23mg／L。
(三)促生效应实施例
采用盆栽法，以1年生美国山核桃实生苗为材料，接种以本发明培养和制备的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌剂50mL，以采用常规培养基和常规发酵方法制备的菌剂为对照。本发明培养和制备的菌剂对核桃植株的生长具有明显的促进作用。
表1蜡样芽孢杆菌对1年生核桃实生苗的促生效应
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基，其特征在于，其配方为：蔗糖25～35g／L，NH4Cl0.8～1.2g／L，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·H2O0.03g，MgSO4·7H2O0.3g，KH2PO42.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。
2.一种权利要求1所述提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化培养得到斜面菌种;
步骤二：将斜面菌种接种到液体种子培养基上培养，得到液体种子液；
步骤三：将步骤二获得的液体种子液接种到提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基上，搅拌培养，即得到蜡样芽孢杆菌液体菌剂。
3.根据权利要求2所述的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，其特征在于，步骤一中蜡样芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化培养的温度为28℃，活化培养的时间为24h。
4.根据权利要求2所述的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，其特征在于，步骤一获得的液体种子液pH值为7.0。
5.根据权利要求2所述的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，其特征在于，步骤三中液体种子液接种到培养基的比例为：6％液体种子液：100mL培养基。
6.根据权利要求2所述的提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基的发酵方法，其特征在于，步骤三液体种子液接种到提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基后搅拌速度为125r／min，温度为28℃，搅拌时间为56h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140514 |