CN102220247A - 一株产甘草次酸的甘草内生真菌 - Google Patents
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Abstract
一株产甘草次酸的甘草内生真菌，它涉及一株内生真菌。产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，属于丝孢科轮枝孢属，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2011114，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年4月9日。本发明中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7，其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，甘草次酸是经典的抗炎药物目前在医药化妆品等领域中广泛应用，还具有防癌和抗癌作用；本发明对采用甘草内生真菌RE7生产甘草次酸具有指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术
植物内生真菌是产生活性物质和新化学物质的潜在资源，不但可以帮助维护人类健康，也可以维护动物和植物的健康。药用植物本身就能产生多种活性物质，实验研究表明，植物与内生细菌在相互作用的过程中，有内生细菌能产生与植物相同或相似的活性物质，因此从药用植物中分离到产生活性物质的内生细菌已成为当今学者的研究趋势。
发明内容
本发明提供了一株产甘草次酸的甘草内生真菌。
产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，属于丝孢科轮枝孢属(Verticillium)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M2011114，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年4月9日；它的分生孢子头呈圆柱状，分生孢子梗细长、有分支，顶端小梗下部膨大而尖端细削，分生孢子单生，为单细胞；它在PDA固体培养基上形成白色圆形菌落，基质为黄红色，菌落直径为7～9cm，中心凸起，菌落边缘整齐，紧贴培养基，菌丝致密，呈毡毛状。
本发明中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，其ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过DNAMAN软件构建系统进化树，RE7菌株的ITS序列与轮枝孢属菌(Verticillium dahlia，编号GU461624.1)菌株的同源性都达到了96％以上，结合形态学观察结果，确定轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)为丝孢科轮枝孢属的一个新菌种。
本发明中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，属于丝孢科轮枝孢属(Verticillium)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M 2011114，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年4月9日。
本发明利用微生物制药手段提取分离甘草健康植株的内生真菌，以抑菌活性为指标，采用滤纸片法进行抑菌实验，筛选得到抑菌活性较强的RE7，并以薄层层析法，HPLC法为分析手段，从甘草内生真菌中找到能够产生活性成分的菌株，并从其发酵液中提取分离活性物质，测定其活性代谢产物，最后将获得的RE7菌株通过形态学观察和16S rDNA序列分析鉴定其种属。
本发明中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，甘草次酸是经典的抗炎药物目前在医药化妆品等领域中广泛应用，还具有防癌和抗癌作用；本发明对采用甘草内生真菌RE7生产甘草次酸具有指导意义。
附图说明
图1为具体实施方式一中产甘草次酸的甘草内生真菌的孢子显微结构图；图2为具体实施方式一中产甘草次酸的甘草内生真菌的PCR扩增的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE7；图3为具体实施方式一中产甘草次酸的甘草内生真菌的系统进化树图；图4为具体实施方式一中甘草次酸对照品的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图5为具体实施方式一中供试品晶体A的HPLC色谱图，其中a表示供试品晶体A；图6为具体实施方式一中加入对照品后供试品晶体A的HPLC色谱图，其中a表示加甘草次酸后供试品晶体A。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，属于丝孢科轮枝孢属(Verticillium)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M2011114，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年4月9日；它的分生孢子头呈圆柱状，分生孢子梗细长、有分支，顶端小梗下部膨大而尖端细削，分生孢子单生，为单细胞，孢子直径为1.4m；它在PDA固体培养基上形成白色圆形菌落，基质为黄红色，菌落直径为7～9cm，中心凸起，菌落边缘整齐，紧贴培养基，菌丝致密，呈毡毛状。
本实施方式中轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，其生长温度为28℃，生长pH值为7。
本实施方式中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahliaRe7)，该菌株分离自健康的野生甘草的根茎，采自大庆地区，植株年龄3年，植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养：
(1)材料预处理：选取健康的野生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成1cm小段，备用；
(2)表面消毒：于无菌超净台内将甘草的根茎按下述方法进行表面消毒：75％酒精浸泡1min-2％次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗3次；用无菌手术刀将甘草的根茎从中间切开，分别置于马铃薯固体分离培养基和马铃薯液体分离培养基中，分别在28℃恒温培养箱和摇床中培养，待其边缘及顶端长出菌丝后，挑取菌落转移到相应的培养基中；
(3)阴性对照：取最后一次无菌水冲洗液涂布培养平板或取适量此冲洗液倒入马铃薯液体培养基内作对照，另将消毒后的实验材料在马铃薯固体分离培养基上滚动一周作对照，于相同的条件下培养；
(4)菌体培养：将消毒后的实验材料分别置于5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基和5％甘草提取液马铃薯液体分离培养基中，于28℃恒温水浴摇床和恒温培养箱中，培养3～5d，待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4℃保存备用；
其中5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的5％甘草提取液组成，pH值为7.0～7.2，121℃下高压灭菌30min；
5％甘草提取液马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的5％甘草提取液组成，pH值为7.0～7.2，121℃下高压灭菌30min；
斜面固体培养基为取5mL的5％甘草提取液马铃薯固体分离培养基装于试管中，121℃高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。
结果：从甘草的根茎中分离出内生真菌RE7，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。筛选出的内生真菌RE7根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，其菌落特征和孢子形态与轮枝孢属菌特征极为相近，孢子显微结构如图1所示；
分子鉴定：内生真菌RE7发酵液抽滤得菌丝体用5％乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，提取总DNA后进行目的片段的PCR扩增，将含有目标条带的PCR产物全部进行再一次的点样，用2％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用解剖刀将目的条带切下，用DNA胶回收试剂盒回收，制备感受态大肠杆菌细胞，将PCR产物与pMD18-T载体进行连接后，连接产物加入到感受态细胞中，进行菌落PCR验证；挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后，将克隆阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序；所测定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，并根据分子系统学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的18S rDNA序列应用软件CLUSTALX 1.83和MEGA 4.1以近邻结合法(Neighbor-joining)构建系统发育树，bootstrap检验值≥50％(1000重复)，确定目标菌株的分类地位；
内生真菌RE7基因组经尿素法提取后，采用PCR扩增后凝胶成像结果如图2所示，在750bp附近得到一扩增片段，证明已成功从内生真菌RE7菌株中提取出其基因组DNA；
根据内生真菌RE7的ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过DNAMAN软件构建系统进化树(见图3)，RE7菌株的ITS序列与轮枝孢属菌(Verticillium dahlia，编号GU461624.1)菌株的同源性都达到了96％以上，结合形态学观察结果，确定筛选出的内生真菌RE7为丝孢科轮枝孢属的一个新菌种，命名为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahlia Re7)。
本实施方式中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahliaRe7)，其发酵液的甲醇提取物抑菌活性实验，结果如表1所示，甘草内生真菌发酵液的甲醇提取物抑菌活性实验结果表明，RE7对单增李斯特菌具有较强的抑制作用。
表1 RE7发酵液甲醇提取物对12种试验菌的抑菌活性筛选结果
| 样品 | A | B | C | D | E | F | G | H | I | J | K | L |
| RE7 | 15.7 | 8.3 | 11.9 | 15.6 | 7.8 | 12.9 | 11.2 | 12.6 | -- | -- | -- | -- |
| 甲醇 | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| Str | 23.2 | 24.1 | 23.0 | 22.5 | 24.0 | 22.8 | 21.9 | 21.3 | 22.8 | 23.5 | 22.8 | -- |
| Nys | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | 17.9 |
注：A：金黄色葡萄球菌；B：短小芽孢杆菌；C：枯草芽孢杆菌；D：单增李斯特菌；E：酿脓链球菌；F：粪肠球菌；G：屎肠球菌；H：大肠杆菌；I：肺炎克雷伯菌；J：鲍曼不动杆菌；K：铜绿假单孢菌；L：白假丝酵母；Str：链霉素；Nys：制霉素，--：无活性。
本实施方式中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahliaRe7)，它活性代谢物的检测如下：
用接种环挑取已活化的甘草内生真菌RE7菌株的菌丝接种于含有50mL马铃薯液体培养基的100mL的三角瓶中，28℃，128r/min摇床培养24h；将RE7种子培养液以5％的接种量接种于装有50mL马铃薯液体培养基的100mL的三角瓶中，于28℃，128r/min摇床培养15d，抽滤去除菌体，得到的发酵液用大孔树脂进行分离，以抑菌试验选取活性较好的30％乙醇洗脱所得的馏分进行进一步的分离纯化；通过硅胶柱色谱分离30％乙醇洗脱所得的馏分，以氯仿∶甲醇＝29∶1(v/v)洗脱得馏分1，薄层层析检测有两个斑点；再次使用硅胶柱色谱分离馏分1，用石油醚∶乙酸乙酯＝16∶4(v/v)洗脱得馏分2，最后通过重结晶的得到结晶A；此过程以薄层层析对活性物质进行追踪；所得单体物质(即结晶A)置于4℃冰箱保存，备用；
采用滤纸片法对所得单体物质进行抑菌实验，结果如表2所示，甘草内生真菌分离纯化出的单体物质(结晶A)具有一定的抑菌活性；
表2 结晶A对12种试验菌的抑菌活性筛选结果
| 样品 | A | B | C | D | E | F | G | H | I | J | K | L |
| 结晶A | 7.4 | 3.4 | 2.3 | 6.1 | 2.8 | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| 甲醇 | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| Str | 18.2 | 19.6 | 18.7 | 21.0 | 19.1 | 20.3 | 19.7 | 20.1 | 19.2 | 18.5 | 17.4 | -- |
| Nys | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | 15.8 |
注：A：金黄色葡萄球菌；B：短小芽孢杆菌；C：枯草芽孢杆菌；D：单增李斯特菌；E：酿脓链球菌；F：粪肠球菌；G：屎肠球菌；H：大肠杆菌；I：肺炎克雷伯菌；J：鲍曼不动杆菌；K：铜绿假单孢菌；L：白假丝酵母；Str：链霉素；Nys：制霉素，--：无活性。
活性代谢物结晶A的检测结果：
色谱条件
色谱柱：VenusiL XBP-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：甲醇-水-磷酸(79∶20∶1)；
流速：1mL·min-1；
检测波长：254nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
在色谱条件下，甘草内生真菌RE7分离纯化出的单体物质结晶A供试品与甘草次酸对照品相应位置的色谱峰一致，而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认，结果见图4、5和6，结论：产甘草次酸的甘草内生真菌，它为轮枝孢属菌RE7(Verticillium dahliaRe7)，其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，本实施方式对采用甘草内生真菌RE7生产甘草次酸具有指导意义。
Claims (1)
1.一株产甘草次酸的甘草内生真菌，其特征在于它为轮枝孢属菌RE7(Verticilliumdahlia Re7)，属于丝孢科轮枝孢属(Verticillium)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2011114，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年4月9日。
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