CN104774901B - 一种微生物转化生成甘草次酸及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物转化生产甘草次酸及其衍生物的方法及其培养基。该方法包括以下步骤：将枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）种子液按体积百分比3%～20%的接种量接入转化培养基，25℃～37℃培养48小时～240小时，其中所述的转化培养基包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，pH3～7。该方法能够转化甘草酸生成三种药理活性很强的代谢产物，分别为15a‑羟基‑18β甘草次酸、7β，15a‑二羟基‑18β甘草次酸和甘草次酸。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微生物转化生成甘草次酸及其衍生物的方法。
背景技术
甘草作为一种常用中药，已被人们接受和使用，其主要成分是：甘草酸、甘草甙、甘草类黄酮、后幕比檀素等。具有解毒、抗炎、镇咳、抗肿瘤、抗溃疡和抗菌等作用。甘草酸（Glycyrrhizic acid,GL)是甘草中的主要活性物质，甘草酸及其系列产品具有不同的药理活性，如肝脏保护、抑制艾滋病、抗病毒和抗癌的作用。此外，甘草酸因其具有较高的甜味和特殊的风味在食品上也有着广泛的用途，常被用作食品添加剂和香料基料。
另一方面，甘草酸也被作为前体化合物，用于其它化合物的合成。例如，甘草酸去掉两个葡萄糖醛酸基，生成甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA)。甘草次酸没有甜味，但是其药理活性比甘草酸强，具有很强的肝保护作用，抗病毒活性及抗肿瘤活性。目前，利用化学方法和生物转化的方法以甘草次酸为母核合成一系列的甘草次酸衍生物，以增强其药理活性。化学方法通过在甘草次酸的结构上添加一些基团，改变化合物的结构，增强其药理活性。但是，这种方法要用到大量的有机试剂，对环境污染较为严重，并且最终的化合物得率不高。生物转化的方法是筛选自然界存在的特定微生物，利用其特殊的酶系对甘草次酸的结构进行改造，最终得到药理活性更强的化合物。例如，Galal T.Maatooq[1]利用特定的微生物对甘草次酸进行转化得到了多种代谢产物，其中2种被评价为活性代谢产物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前微生物转化甘草酸生成甘草次酸及其衍生物的转化率低的缺陷，提供一种微生物转化生产甘草次酸及其衍生物的方法，该方法采用微生物转化甘草酸生成甘草次酸及其衍生物，其中的衍生物是药理活性比甘草次酸更强的已知化合物。
本发明采用以下技术方案来解决上述技术问题：
本发明的技术方案为：一种微生物转化生产甘草次酸及其衍生物的方法，包括以下步骤：将枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）种子液，按体积百分比3%～20%的接种量接入转化培养基，25℃～37℃培养48小时～240小时，其中所述的转化培养基包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，pH3～7。
本发明中所述的接种量为体积百分比3%～20%，更佳的是体积百分比5%～15%，最佳的是体积百分比10%。
本发明中所述的转化培养的温度是25℃～37℃，最佳的是30℃。
本发明中所述的转化培养的时间是48小时～240小时，最佳的是144小时。
本发明中所述的转化培养较佳的是振荡培养，振荡频率是较佳的是150rpm～240rpm，最佳的是220rpm。
本发明中所述的转化培养基包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，pH3～7。
较佳的，所述的转化培养基包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，MgSO4·7H2O0.1～1克/升，KH2PO40.1～5克/升，pH3～7。
优选的，所述的转化培养基中还包括以下组分中的一种或多种组分：FeSO4·7H2O0.01～0.05克/升，CoCl2·6H2O0.5～1.0克/升，MnSO4·H2O0.3～0.8克/升，ZnSO4·7H2O0.5～1.2克/升，CaCl20.1～0.8克/升，CuSO4·5H2O2.0～3.0克/升。
本发明中所述的转化培养基中，甘草酸的含量为1～15克/升，优选3～10克/升，最佳的是5克/升。
本发明中所述的转化培养基中，NaNO3的含量为1～10克/升，优选3～7克/升，最佳的是5克/升。
本发明所述的转化培养基的pH值为3～7，优选的pH值为5.0。
本发明中所述的转化培养基中，
MgSO4·7H2O的含量为0.1～1克/升，优选0.3～0.8克/升，最佳的是0.5克/升；
KH2PO4的含量为0.1～5克/升，优选0.5～2克/升，最佳的是1克/升。
FeSO4·7H2O的含量为0.01～0.05克/升，最佳的是0.01克/升。
本发明所述的转化培养基最佳的包括以下组分：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。
所述的转化培养基的制备方法是本领域常规，将各原料混合，溶解于水中，调节pH，高压灭菌即可。所述的高压灭菌是常规，较佳的，121℃条件下灭菌30分钟即可。
本发明中所述的种子液是常规的，较佳的由包括以下步骤的方法制备而得：将斜面培养的枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）孢子接种到种子培养基中，28～30℃，200～240rpm振荡培养24～72h，制得种子液。
所述的种子培养基为常规，优选的包括以下组分：0.5～1.5%葡萄糖，0.5～1.5%甘露醇或者麦芽糊精，0.5～1.5%聚蛋白胨，5～15mmol KH2PO4和5～15mmol MgSO4。
所述的种子培养基优选的为：
培养基1:1%葡萄糖、1%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基2:1%葡萄糖、1%麦芽糊精、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基3:0.5%葡萄糖、1.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基4:1.5%葡萄糖、0.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基5:0.5%葡萄糖、0.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基6:1.5%葡萄糖、1.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基7:1%葡萄糖、1%甘露醇、0.5%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基8:1%葡萄糖、1%甘露醇、1.5%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基9:PDA。
所述的PDA是本领域常规的培养基，可以商购而得，也可以根据已有的配方自行配制。PDA液体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然。具体的配制方法如下：马铃薯去皮切成小块称量200g，开水煮沸30min，4层纱布过滤，加入葡萄糖20g，溶化后加水定容至1000ml，pH自然，121℃灭菌30min，即得。如本领域常规，在液体培养基中加入适量琼脂，即获得固体或半固体培养基。
所述的种子培养基更佳的为培养基2、5、7、9，最佳的为培养基7。
所述种子培养的温度较佳为28～30℃，最佳的为28℃。
所述种子培养的时间为24～72小时，较佳为36～60小时，最佳的为48小时。
所述种子培养的振荡频率较佳为200～240rpm，最佳的为240rpm。
本发明中，所述的斜面培养是常规的，一般在斜面培养基上28℃，静置培养3～10天，优选5～7天，即达到孢子丰富时期，即可用于接种种子培养基。斜面培养基是常规的，一般为在PDA液体培养基的基础上添加质量体积比1.8%的琼脂。
本发明中，转化培养结束后，培养液中即含有甘草次酸及其两种衍生物，15a-羟基-18β甘草次酸、7β,7β，15a-二羟基-18β甘草次酸。从培养液中即可获得甘草次酸及该两种衍生物。
本发明中所述的枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）是指属于枝顶孢属（Acremonium）pinkertoniae种下的任何菌株，较佳的选自枝顶孢霉（Acremoniumpinkertoniae）CBS157.70、CBS158.70和CBS517.81中的一种或多种。
本发明中，若无特别说明，所述的百分比是质量百分比。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明首次利用枝顶孢霉，将甘草酸底物同时转化为甘草次酸及其两种衍生物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸（参见图1），优点在于本发明与文献报道的菌株及最终的产物谱不同。另外本方法反应条件温和，操作简单，环境友好。包括三个方面：
1、首次利用枝顶孢霉对甘草酸进行转化；
2、该菌株能够作用于甘草酸中的糖苷键，并能够对甘草次酸进行羟化反应；
3、该菌株能够转化甘草酸生成三种代谢产物分别为15a-羟基-18β甘草次酸、7β，15a-二羟基-18β甘草次酸和甘草次酸。
附图说明
图1：利用微生物将甘草酸底物转化为甘草次酸或其衍生物。1，甘草酸；2，18β甘草次酸；3，7β，15a-二羟基-18β甘草次酸；4，15a-羟基-18β甘草次酸。
图2：甘草次酸标品。2号峰代表：甘草次酸。
图3：菌株Acremonium pinkertoniae CBS157.70转化产物的图谱。1号峰代表：甘草酸；2号峰代表：甘草次酸；3号峰代表：化合物7β，15a-二羟基-18β甘草次酸；4号峰代表：化合物15a-羟基-18β甘草次酸。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中摩尔生成率的计算如下：
甘草酸的摩尔质量470.68g/mol；甘草次酸的摩尔质量822.93g/mol。
实施例中总转化率计算如下：
实施例所用的原料如下：
枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）CBS157.70、CBS158.70、CBS517.81（购自荷兰微生物菌种保藏中心）。枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）CBS157.70、CBS158.70、CBS517.81分别用于实施例1～35、36、37。
斜面培养基：为在PDA液体培养基的基础上添加质量体积比1.8%的琼脂。
实施例1
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基中，28℃，240rpm振荡培养48h，得种子液。该种子液用于以下实施例2～28。
其中，种子培养基为：PDA液体培养基。
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度25℃、200rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为46.0%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为36.6%。
实施例2
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、200rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为41.1%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为46.2%。
实施例3
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度37℃、200rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为47.3%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为37.2%。
实施例4
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、150rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为46.3%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为36.9%。
实施例5
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为51.9%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为41.9%。
实施例6
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、240rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为43.2%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为30.8%。
实施例7
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养48h，甘草次酸的摩尔生成率为40.3%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为20.2%。
实施例8
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养168h，甘草次酸的摩尔生成率为47.8%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为39.9%。
实施例9
将种子液以3%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为27.8%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为26.2%。
实施例10
将种子液20%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为31.1%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为36.2%。
实施例11
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH3.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为22.7%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为16.2%。
实施例12
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH7.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为35.8%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为26.8%。
实施例13
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，NaNO35克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为37.2%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为24.6%。
实施例14
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，NaNO35克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为43.8%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为37.5%。
实施例15
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为31.7%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为49.2%。
实施例16
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸15克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为44.4%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为22.7%。
实施例17
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.1克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为33.4%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为35.7%。
实施例18
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O1克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为38.7%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为40.5%。
实施例19
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO31克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为27.7%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为46.2%。
实施例20
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO310克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为41.9%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为45.2%。
实施例21
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.05克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为24.2%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为28.5%。
实施例22
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO40.1克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为34.8%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为35.4%。
实施例23
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO45克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为37.7%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为33.2%。
实施例24
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，CoCl2·6H2O2.4g/L，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为21.7%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为53.8%。
实施例25
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，MnSO4·H2O1.7g/L，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为20.0%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为59.3%。
实施例26
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，ZnSO4·7H2O2.9g/L，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为22.5%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为51.2%。
实施例27
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，CaCl21.1g/L，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为26.1%，化合物15a～hydroxy～18β～glycyrrhetinicacid和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为56.9%。
实施例28
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸1克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，CuSO4·5H2O2.5g/L，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为1.1%，化合物15a～hydroxy～18β～glycyrrhetinicacid和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为0.9%。
实施例29
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基中，种子培养基的组成：1%葡萄糖、1%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4，28℃，240rpm振荡培养48h，得种子液。
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为33.2%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为59.4%。
实施例30
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基中，种子培养基的组成：1%葡萄糖、1%麦芽糊精、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4，28℃，240rpm振荡培养48h，得种子液。
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升，pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为39.3%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为56.7%。
实施例31
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基中，种子培养基的组成：1%葡萄糖、1%甘露醇、0.5%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4，28℃，240rpm振荡培养48h，得种子液。
将种子液以10%的接种量接种至含转化培养基的锥形瓶中，转化培养基的组成：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，NaNO35克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，KH2PO41克/升,pH5.0。自动控制发酵温度30℃、220rpm振荡培养144h，甘草次酸的摩尔生成率为57.0%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为41.0%。
实施例32
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基中，28℃，240rpm振荡培养48h，得种子液。检测所得种子液的菌体的PMV值（菌体湿重值）。
PMV值的测定方法：取10ml种子液，3000rpm离心10min，测上清液的体积V（ml），
其中所述的种子培养基分别如下：
培养基1:1%葡萄糖、1%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基2:1%葡萄糖、1%麦芽糊精、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基3:0.5%葡萄糖、1.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基4:1.5%葡萄糖、0.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基5:0.5%葡萄糖、0.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基6:1.5%葡萄糖、1.5%甘露醇、1%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基7:1%葡萄糖、1%甘露醇、0.5%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基8:1%葡萄糖、1%甘露醇、1.5%聚蛋白胨、10mmol KH2PO4、10mmol MgSO4；
培养基9:PDA。
所得种子液的菌体PMV值分别如下：
| 培养基 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 菌体的PMV值（%） | 7 | 12 | 11 | 7 | 12 | 8 | 13 | 6 | 10 |
实施例33
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基（种子培养基为PDA）中，在不同的温度，240rpm振荡培养48h，得种子液。所得种子液的菌体PMV值分别如下：
| 温度℃ | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 |
| 菌体的PMV值（%） | 7 | 10 | 9 | 7 | 8 |
实施例34
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基（种子培养基为PDA）中，在28℃，240rpm振荡培养一定时间，得种子液。所得种子液中的菌体PMV值分别如下：
| 时间（h） | 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 |
| 菌体的PMV值（%） | 2 | 3 | 7 | 10 | 9 | 8 |
实施例35
斜面培养：将菌株接种斜面培养基，28℃，静置培养3～7d。
种子培养：将所得的斜面培养物，接种到种子培养基（种子培养基为PDA）中，在28℃，在不同的振荡频率振荡培养48h，得种子液。所得种子液中的菌体PMV值分别如下：
| 振荡频率(rpm) | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 |
| 菌体的PMV值（%） | 6 | 8 | 8 | 10 | 7 |
实施例36
采用枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）CBS158.70，如实施例1进行斜面培养和种子培养，种子培养液采用同实施例5的条件进行转化培养。甘草次酸的摩尔生成率为36.4%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为46.1%。
实施例37
采用枝顶孢霉（Acremonium pinkertoniae）CBS517.81，如实施例1进行斜面培养和种子培养，种子培养液采用同实施例5的条件进行转化培养。甘草次酸的摩尔生成率为36.3%，化合物15a-羟基-18β甘草次酸和7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的总转化率为45.0%。
效果实施例1
以上实施例中，采用UPLC检测甘草次酸、15a-羟基-18β甘草次酸、7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的生成量，方法如下：
对照品溶液配制：分别精确称取定量的干燥到恒重的甘草次酸、15a-羟基-18β甘草次酸、7β，15a-二羟基-18β甘草次酸纯品（HPLC纯度≥95%），配制成0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml的乙醇溶液，UPLC测定不同浓度对照品对应的峰面积，绘制标准曲线。
样品的制备：甘草酸液体发酵产物，加入2倍体积的丙酮，振荡，静置浸泡过夜，取1ml的丙酮浸泡液，14000rpm高速离心3min，上清液用孔径为0.22μm的有机滤膜过滤后即可测样。
UPLC检测条件：
色谱柱：ultimate XB-C18（2.1×100mm，1.8μm）；
梯度洗脱：
posttime:5min；
流速0.22ml/min，检测波长254nm，进样量2μL，柱温35℃。
其中，甘草次酸标品的UPLC图谱见图2。
其中，菌株Acremonium pinkertoniaeCBS157.70转化产物的图谱见图3。
将UPLC纯化的甘草次酸、15a-羟基-18β甘草次酸、7β，15a-二羟基-18β甘草次酸进行质谱鉴定，质谱数据如下。
甘草次酸的质谱数据：
ESI-TOF-MS（negative）m/z：469.33[M-H]-（C30H45O4;计算值：469.33）。
化合物15a-羟基-18β甘草次酸的质谱数据：
ESI-TOF-MS（negative）m/z：485.40[M-H]-（C30H45O5;计算值：485.40）。
化合物7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的质谱数据：
ESI-TOF-MS（negative）m/z：501.53[M-H]-（C30H45O6;计算值：501.53）。
化合物15a-羟基-18β甘草次酸的核磁数据：
13C-NMR（100MHZ,DMSO-d6）：δ38.9（C-1），δ27.1（C-2），δ76.8（C-3），δ35.5（C-4），δ54.2（C-5），δ18.6（C-6），δ37.1（C-7），δ46.4（C-8），δ61.3（C-9），δ36.9（C-10），δ199.2（C-11），δ127.8（C-12），δ170.3（C-13），δ48.6（C-14），δ65.8（C-15），δ37.4（C-16），δ32.0（C-17），δ48.8（C-18），δ40.6（C-19），δ43.1（C-20），δ30.6（C-21），δ38.8（C-22），δ28.2（C-23），δ16.1（C-24），δ16.3（C-25），δ18.0（C-26），δ19.0（C-27），δ29.1（C-28），δ28.0（C-29），δ177.6（C-30）。
化合物7β，15a-二羟基-18β甘草次酸的核磁数据：
13C-NMR（100MHZ,DMSO-d6）：δ38.4（C-1），δ27.1（C-2），δ76.6（C-3），δ38.6（C-4），δ50.9（C-5），δ26.9（C-6），δ70.5（C-7），δ50.8（C-8），δ61.5（C-9），δ36.9（C-10），δ198.3（C-11），δ128.0（C-12），δ170.0（C-13），δ49.6（C-14），δ65.7（C-15），δ35.1（C-16），δ31.7（C-17），δ49.3（C-18），δ40.7（C-19），δ43.1（C-20），δ30.5（C-21），δ37.3（C-22），δ28.2（C-23），δ16.1（C-24），δ15.9（C-25），δ12.7（C-26），δ18.0（C-27），δ29.0（C-28），δ28.0（C-29），δ177.7（C-30）。
Claims (10)
1.一种微生物转化生产甘草次酸及其衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将枝顶孢霉(Acremonium pinkertoniae)种子液按体积百分比3％～20％的接种量接入转化培养基，25℃～37℃培养48小时～240小时，其中所述的转化培养基包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，pH3～7；其中，所述衍生物为15a-羟基-18β甘草次酸和7β,15a-二羟基-18β甘草次酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子液由包括以下步骤的方法制备而得：将斜面培养的枝顶孢霉(Acremonium pinkertoniae)孢子接种到种子培养基中，28～30℃，200～240rpm振荡培养24～72h，制得种子液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括以下组分：0.5～1.5％葡萄糖，0.5～1.5％甘露醇或者麦芽糊精，0.5～1.5％聚蛋白胨，5～15mmol KH2PO4和5～15mmol MgSO4。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为PDA培养基。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括以下组分：1％葡萄糖，1％甘露醇，0.5％聚蛋白胨，10mmol KH2PO4和10mmol MgSO4，所述的百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枝顶孢霉(Acremonium pinkertoniae)选自枝顶孢霉(Acremonium pinkertoniae)CBS157.70、CBS158.70和CBS517.81中的一种或多种。
7.一种用于微生物转化生产甘草次酸及其衍生物的转化培养基，其特征在于，包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，pH3～7；其中，所述微生物为枝顶孢霉；所述衍生物为15a-羟基-18β甘草次酸和7β,15a-二羟基-18β甘草次酸。
8.如权利要求7所述的转化培养基，其特征在于，所述的转化培养基包括以下组分：甘草酸1～15克/升，NaNO31～10克/升，MgSO4·7H2O0.1～1 克/升，KH2PO4 0.1～5克/升，pH3～7。
9.如权利要求7所述的转化培养基，其特征在于，所述的转化培养基中还进一步包括以下组分中的一种或多种：FeSO4·7H2O 0.01～0.05克/升，CoCl2·6H2O0.5～1.0克/升，MnSO4·H2O 0.3～0.8克/升，ZnSO4·7H2O 0.5～1.2克/升，CaCl2 0.1～0.8克/升，CuSO4·5H2O 2.0～3.0克/升。
10.如权利要求7所述的转化培养基，其特征在于，所述的转化培养基为：甘草酸5克/升，MgSO4·7H2O 0.5克/升，NaNO3 5克/升，FeSO4·7H2O 0.01克/升，KH2PO4 1克/升，pH5.0。
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