CN104988193A - 一种10,11-脱氢弯孢霉菌素的生产方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种微生物发酵法生产10,11-脱氢弯孢霉菌素的方法。本发明的特征在于使用液体发酵技术获得发酵基质，利用过滤方法去除菌丝体，然后通过乙酸乙酯萃取，减压浓缩得浸膏，利用乙酸乙酯重结晶技术，获得精制的10,11-脱氢弯孢霉菌素产品，纯度﹥99%。该菌种对发酵原料适应性强，产品10,11-脱氢弯孢霉菌素分离产率达28.8%。产品10,11-脱氢弯孢霉菌素具有防除杂草、抗肿瘤等多种药理活性，在医药、生物农药等领域具有广泛的应用。

Description

一种10,11-脱氢弯孢霉菌素的生产方法及其应用
技术领域
发明涉及到一种微生物发酵法生产和精制10,11-脱氢弯孢霉菌素方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
10,11-脱氢弯孢霉菌素(10,11-dehydrocurvularin)是一种优良的天然除草剂，此外还具有多种生物活性，如对人肺成纤维细胞的毒性，TGF-β抑制活性，抗氧化活性，以及抑菌活性等。Turner W.B.(Fungal Metabolites,1971,Academic Press,London)首次从真菌Curvularia sp.的代谢物中分离获得10,11-dehydrocurvularin，未见产率报道。更多的报道集中在化合物的分离与鉴定，未见该类化合物的微生物发酵及精制工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产、低成本、工艺简单的微生物发酵法生产高纯度10,11-脱氢弯孢霉菌素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种10,11-脱氢弯孢霉菌素的生产方法，采用微生物发酵法制得10,11-脱氢弯孢霉菌素，具体工艺步骤如下：
(1)摇瓶种子液制备：将斜面菌种接种于种子培养基中，30℃下活化培养72小时后得到菌块，在无菌操作环境下，用接种针划取0.5cm×0.5cm的菌块接种于种子摇瓶中，将种子培养摇瓶置于转速为120r/min的恒温振荡器中，在28℃下恒温培养7天，得到种子液；
(2)发酵培养：按摇瓶发酵液的配方配制发酵培养基，将该培养液装入步骤(1)中的种子液中，在转速为160r/min的恒温振荡器中，在28℃下恒温培养15天，得到含有菌丝体和10,11-脱氢弯孢霉菌素的发酵基质；
(3)发酵液的萃取：将发酵基质经过滤去除菌丝体，得到含10,11-脱氢弯孢霉菌素的发酵液，利用经重蒸处理过的工业级乙酸乙酯分批萃取3次，得乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩得10,11-脱氢弯孢霉菌素浸膏。
(4)产品110,11-脱氢弯孢霉菌素精制：将10,11-脱氢弯孢霉菌素浸膏热溶于分析纯乙酸乙酯，在室温放置12h，过滤，分析纯乙酸乙酯洗涤，得淡黄色颗粒状晶体，即为10,11-脱氢弯孢霉菌素。
所述的种子培养基为土豆液体培养基(PDB)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖经混合后制得，pH自然。
所述的发酵培养基为土豆液体培养基(PDB)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖经混合后制得，pH自然。
而且，所述发酵液萃取使用的溶剂为工业级乙酸乙酯，经重蒸处理。
而且，所述产品10,11-脱氢弯孢霉菌素精制方法为重结晶技术，结晶溶剂为乙酸乙酯，分析纯。
本发明将上述的10,11-脱氢弯孢霉菌素应用于制备除草剂的药剂上。
所述的防除杂草类别包括马唐、牛筋草、稗草、狗尾草、画眉草、荩草类的禾本科杂草。
进一步，本发明将上述的10,11-脱氢弯孢霉菌素还应用于制备抗肿瘤的药剂上。所述的肿瘤性疾病为人宫颈癌细胞(CaSki细胞)和人肝癌细胞(HepG2细胞)。本发明的优点和积极效果是：本发明利用微生物发酵技术和重结晶技术高效生产和精制天然来源的化合物10,11-脱氢弯孢霉菌素，获得精制的10,11-脱氢弯孢霉菌素产品，纯度﹥99％。该菌种对发酵原料适应性强，产品10,11-脱氢弯孢霉菌素分离产率达28.8％。该化合物具有防除杂草、抗肿瘤等生物活性，可应用于医药及生物农药等领域。
附图说明
图1.活化后的微生物菌落形态(PDA)。
图2.摇瓶发酵状态下的菌落形态(PDB)。
图3.摇瓶发酵15天后培养液中10,11-脱氢弯孢霉菌素的检测。
图4.精制10,11-脱氢弯孢霉菌素。
图5.精制10,11-脱氢弯孢霉菌素纯度分析(纯度99.17％)。
具体实施方式
下述试验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
一种微生物发酵法生产10,11-脱氢弯孢霉菌素的方法，其工艺过程如下：
(1)摇瓶种子液制备：将斜面菌种接种于PDA固体培养皿中活化，30℃培养72小时，肉眼观察菌体生长良好，无杂菌污染(图1)。在无菌操作环境下，用接种针划取0.5cm×0.5cm的菌块接种于种子摇瓶中培养。将种子培养摇瓶置于转速为120r/min的恒温振荡器中，并使其培养温度维持在28℃，培养7天，得到液体菌种。
(2)发酵培养：按摇瓶发酵液的配方配制培养液，分别装入100个500mL的摇瓶中，每个摇瓶装液量为200mL。发酵摇瓶置于转速为160r/min的恒温振荡器中，并使其培养温度维持在28℃，培养15天，得到含有菌丝体和10,11-脱氢弯孢霉菌素的发酵基质(图2，图3)。图3为摇瓶发酵15天后培养液中10,11-脱氢弯孢霉菌素的检测；分析条件：色谱仪器，Waters 1525EF；分析柱，VenusilXBP C18；洗脱条件，50％CH3OH-H2O；化合物保留时间，17.5分钟。
(3)发酵液的萃取：将发酵基质通过过滤装置去除菌丝体，得到含10,11-脱氢弯孢霉菌素的发酵液20L，利用工业级乙酸乙酯(重蒸处理，总计用量20L)分批萃取3次，得乙酸乙酯萃取液18L，经减压浓缩得浸膏12.0g。
(4)产品10,11-脱氢弯孢霉菌素精制：将12.0g发酵产物浸膏热溶于200mL乙酸乙酯(分析纯)，室温放置12h，过滤，乙酸乙酯(分析纯)洗涤，得淡黄色颗粒状晶体3.45g，分离产率28.8％。
产品质量指标：
性状：淡黄色颗粒晶体(图4)，纯度﹥99％(图5)；图5为精制10,11-脱氢弯孢霉菌素纯度分析(纯度﹥99％)；分析条件：色谱仪器，Waters 1525EF；分析柱，YMC-Pack ODS-A-HG；洗脱条件，50％CH3OH-H2O；化合物保留时间，14.017分钟。
熔点:224-226℃。
比旋光度[α]D 20:-90.2(c 0.61,CH3OH)。
薄层色谱比移值Rf:0.5(CHCl3-CH3OH,30:1)。
紫外吸收波长UV/Visλmax(MeOH)nm(logε):234(1.76),296(1.94)and 348(1.49)。核磁共振氢谱1H NMR(400MHz,CDCl3):12.70(1H,s,OH-7),6.71-6.59(2H,m,H-10and H-11),6.58(1H,brs,OH-5),6.25(1H,d,J＝2.4,H-6),6.22(1H,d,J＝2.4,H-4),4.92-4.83(1H,m,H-15),4.05(1H,d,J＝18.0,H-2a),3.53(1H,d,J＝18.0,H-2b),2.52-2.46(1H,m,H-12a),2.38-2.28(1H,m,H-12b),2.02-1.87(2H,m,H-13a andH-14a),1.69-1.60(2H,m,H-13b and H-14b),1.26(3H,d,J＝6.4,H-16)。
核磁共振碳谱13C NMR(100MHz,CDCl3):196.2(C-9),172.1(C-1),166.3(C-7),161.2(C-5),148.2(C-11),137.6(C-3),131.5(C-10),114.3(C-8),113.8(C-4),103.3(C-6),73.1(C-15),44.0(C-2),33.8(C-14),32.7(C-12),24.0(C-13),19.8(C-16).高分辨质谱HRMS-ESI:m/z[M+H+]calcd.for C16H19O5:291.1232；found:291.1225。10,11-脱氢弯孢霉菌素化学结构式如下：
(5)10,11-脱氢弯孢霉菌素的除草作用：化合物10,11-脱氢弯孢霉菌素(0-20.0g)以一定剂量的溶液兑水，对马唐进行茎叶、土壤双重处理，用水40-50kg/亩，喷药15天后，对杂草的生长形成有效抑制，与常见商业农药如草甘膦以一定比例联合处理，除草效果保持。
(6)10,11-脱氢弯孢霉菌素的抗肿瘤作用：化合物10,11-脱氢弯孢霉菌素对人宫颈癌细胞(CaSki细胞)和人肝癌细胞(HepG2细胞)具有一定的抑制活性，IC50值分别为52.1和45.6μM；对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)和人胃癌细胞(HGC-27细胞)基本没有抑制活性，IC50值分别为117.8和274.9μM。

Claims (7)

1.一种10,11-脱氢弯孢霉菌素的生产方法，其特征在于，采用微生物发酵法制得10,11-脱氢弯孢霉菌素，具体工艺步骤如下：
（1）摇瓶种子液制备：将斜面菌种接种于种子培养基中，30℃下活化培养72小时后得到菌块，在无菌操作环境下，用接种针划取0.5 cm×0.5 cm的菌块接种于种子摇瓶中，将种子培养摇瓶置于转速为120 r/min的恒温振荡器中，在28℃下恒温培养7天，得到种子液；
（2）发酵培养：按摇瓶发酵液的配方配制发酵培养基，将该培养液装入步骤（1）中的种子液中，在转速为160 r/min的恒温振荡器中，在28℃下恒温培养15天，得到含有菌丝体和10,11-脱氢弯孢霉菌素的发酵基质；
（3）发酵液的萃取：将发酵基质经过滤去除菌丝体，得到含10,11-脱氢弯孢霉菌素的发酵液，利用经重蒸处理过的工业级乙酸乙酯分批萃取3次，得乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩得10,11-脱氢弯孢霉菌素浸膏；
（4）产品110,11-脱氢弯孢霉菌素精制：将10,11-脱氢弯孢霉菌素浸膏热溶于分析纯乙酸乙酯，在室温放置12 h，过滤，分析纯乙酸乙酯洗涤，得淡黄色颗粒状晶体，即为10,11-脱氢弯孢霉菌素。
2. 根据权利要求1所述的10,11-脱氢弯孢霉菌素的生产方法，其特征在于，所述的种子培养基为土豆液体培养基（PDB），即将200 g/L的去皮土豆浆液与20 g/L的葡萄糖经混合后制得，pH自然。
3. 根据权利要求1所述的10,11-脱氢弯孢霉菌素的生产方法，其特征在于，所述的发酵培养基为土豆液体培养基（PDB），即将200 g/L的去皮土豆浆液与20 g/L的葡萄糖经混合后制得，pH自然。
4. 权利要求1~3任一项所述的10,11-脱氢弯孢霉菌素在制备除草剂的药剂上的应用。
5.权利要求1~3任一项所述的10,11-脱氢弯孢霉菌素在制备抗肿瘤的药剂上的应用。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的防除杂草类别包括马唐、牛筋草、稗草、狗尾草、画眉草、荩草类的禾本科杂草。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤性疾病为人宫颈癌细胞（CaSki细胞）和人肝癌细胞（HepG2细胞）。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109893523A (zh) * 2019-03-01 2019-06-18 三峡大学 一种广谱抗肿瘤细胞增殖的atp-柠檬酸裂解酶抑制剂
CN110438193A (zh) * 2019-08-13 2019-11-12 三峡大学 一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174440A (zh) * 2011-01-28 2011-09-07 广东省农业科学院植物保护研究所 一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174440A (zh) * 2011-01-28 2011-09-07 广东省农业科学院植物保护研究所 一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HENDRIK GREVE ET AL.,: "Fungal metabolites: structural diversity as incentive for anticancer drug development", 《PHYTOCHEM REV》 *
吴晓燕等: "细胞周期调控因子CDC25A、B抑制剂F09ZB-860H的研究", 《中国抗生素杂志》 *
姜述君等: "画眉草弯孢霉菌除草活性化合物的分离鉴定及其生物活性测定", 《植物保护学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109893523A (zh) * 2019-03-01 2019-06-18 三峡大学 一种广谱抗肿瘤细胞增殖的atp-柠檬酸裂解酶抑制剂
CN110438193A (zh) * 2019-08-13 2019-11-12 三峡大学 一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法

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