CN110438193A - 一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法。本发明的特征在于使用真菌曲霉和真菌半伏小薄孔混合发酵，采用过滤或离心方法去除菌丝体，利用有机溶剂萃取滤液或者上清液，减压除去有机溶剂得到浸膏，借助重结晶手段获得精制弯孢霉菌素。该方法制备的弯孢霉菌素分离产率达20%，纯度﹥99%。

Description

一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法
技术领域
本发明涉及到一种多菌混合发酵生产和精制弯孢霉菌素的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
苯二酚内酯是一类真菌产聚酮化合物，典型结构特征为1,3-间苯二酚桥连大环内酯环。该类化合物主要分为两种类型，即二羟基苯乙酸内酯 (dihydroxyphenylaceticacid lactones,简称DALs)和二羟基苯甲酸内酯(resorcylic acid lactones,简称RALs)。弯孢霉菌素是典型的12元环二羟基苯乙酸内酯天然产物，最初由Musgrave从真菌Curvularia代谢产物中分离获得(J. Chem.Soc.,1956,4301-4305)，目前共报道了72种该类化合物的类似物，该类化合物具有广泛的抗菌、抗肿瘤、抗炎等生物活性。
弯孢霉菌素多为天然来源和人工合成(ChemMedChem,2008,3,924-939)，其中脱氢弯孢霉菌素10,11位双键可与甲醇等亲核试剂发生加成反应生成11-甲氧基弯孢霉菌素(Nat.Prod.Commun.,2015,10,1277-1278)，目前暂无文献报道通过脱氢弯孢霉菌素快速、便捷规模化制备弯孢霉菌素的方法。在筛选发现一株高产脱氢弯孢霉菌素菌株(ZL201510392665.6)的基础上，本发明公布了一种多菌混合发酵弯孢霉菌素的方法，该方法可完成规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产、低成本、可规模化发酵制备高纯度弯胞霉菌素的方法。
弯孢霉菌素的化学结构如下：
本发明的具体工艺步骤如下：
(1)种子液制备：在无菌条件下，将真菌曲霉(Aspergillus sp.)和真菌半伏小薄孔(Antrodiellasemisupina)从各自活化后的平面固体培养基上，用接种针挑取约0.5cm×0.5cm菌块分别接种于各自种子摇瓶中，置于转速100-140r/min、温度25-28℃的恒温摇床中培养3-5天，得到两种真菌种子液。种子培养基为土豆液体培养基(PDB)。
(2)发酵培养：将种子液分别接种到发酵培养基中，置于转速100-140r/min、温度25-28℃的恒温摇床中培养5-8天。发酵培养基为土豆液体培养基(PDB)。
(3)混合培养：在无菌条件下，将(2)中真菌曲霉的发酵液和菌丝体整体倒入真菌半伏小薄孔发酵摇瓶中，后者置于转速100-140r/min、温度25-28℃的恒温摇床中继续培养20-28天。
(4)发酵液萃取：将混合培养的发酵基质过滤除去菌丝体，得到含弯孢霉菌素的发酵液，利用乙酸乙酯分批萃取3次，得乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩得到含弯孢霉菌素的浸膏。
(5)弯孢霉菌素的精制：将浸膏热溶于乙腈，过滤除去不溶物，室温下放置24 小时析出弯孢霉菌素晶体。
所述固体培养基是土豆琼脂固体培养基(PDA)，即将200g/L的去皮土豆、20g/L 的葡萄糖与20g/L的琼脂粉混合制得，自然pH。
所述种子培养基和发酵培养基是土豆液体培养基(PDB)，即将200g/L的去皮土豆与20g/L的葡萄糖制得，自然pH。
所述发酵液萃取用溶剂为工业级乙酸乙酯，经重蒸处理后使用。
所述产品弯孢霉菌素精制方法为重结晶技术，结晶溶剂为乙腈，分析纯。
所述的真菌曲霉为10,11-脱氢弯孢霉菌素高产菌株，分离产率达28.8％。
本发明通过共培养方式，利用真菌半伏小薄孔含有的烯醇还原酶对真菌曲霉主要代谢产物10,11-脱氢弯孢霉菌素的α,β-不饱和酮的双键形成加氢还原，获得弯孢霉菌素。所述的真菌半伏小薄孔在土豆液体培养基中生产的次级代谢产物类型少，主要包括：erythro-1-(3-氯-4-甲氧基苯基)-1,2-丙二醇、3-氯-4-甲氧基苯甲酸、 3,5-二氯-4-甲氧基苯甲酸、3,4-二甲氧基苯甲酸和对羟基苯甲酸；与弯孢霉菌素相比，化合物极性小，便于与主产物分离。本发明实施简单方便，可工业化应用。
附图说明
图1.真菌曲霉在土豆固体培养基上的菌落形态。
图2.真菌半伏小薄孔在土豆固体培养基上的菌落形态。
图3.真菌曲霉在土豆液体培养基中的菌落形态。
图4.真菌半伏小薄孔在土豆液体培养基中的菌落形态。
图5.真菌曲霉和真菌半伏小薄孔在土豆液体培养基中混合培养的菌落形态。
图6.真菌曲霉和真菌半伏小薄孔在土豆液体培养基中混合培养的液体基质乙酸乙酯提取浸膏经高效液相色谱分析所得色谱图。A.真菌曲霉和真菌半伏小薄孔混合培养发酵液乙酸乙酯提取物高效液相色谱分析图；B.真菌曲霉单独培养发酵液乙酸乙酯提取物高效液相色谱分析图；C.真菌半伏小薄孔单独培养发酵液乙酸乙酯提取物高效液相色谱分析图；D.B和C的混合样品高效液相色谱分析图。
图7.弯胞霉菌素结晶体。
图8.弯胞霉菌素结晶体高效液相色谱分析图。
图9.弯胞霉菌素结晶体核磁氢谱。
图10.弯胞霉菌素结晶体核磁碳谱。
具体实施方式
下述试验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
(1)菌种的活化：将半伏小薄孔菌种接种于PDA固体培养基中活化，28℃培养3天，肉眼可观察到菌体生长情况且无杂菌污染，同样将真菌曲霉进行活化，肉眼观察菌体生长情况良好，无杂菌。如图1和图2所示。
(2)摇瓶种子液制备：将半伏小薄孔菌和真菌曲霉从各自活化后的平面固体培养基中，在无菌条件下，用接种针挑取约0.5cm×0.5cm菌块分别接种于各自种子摇瓶中，做好标签，于转速120r/min，恒温28℃摇床中，培养3天，得到两种种子液。
(3)发酵培养：将(2)中所得种子液分别分装入含有200mL培养液的500mL 摇瓶中，其中，发酵培养基的配方与种子培养基相同，再将培养基于转速120r/min，恒温28℃摇床中，各自培养3-5天，观察菌株生长状况。如图3和图4所示。
(4)混合培养：将(3)中生长状况良好、无杂菌污染的真菌曲霉发酵液加入(3) 中半伏小薄孔发酵液中，真菌曲霉发酵液与半伏小薄孔发酵液比例为1：3(V/V)，进行共培养，同样置于转速120r/min，恒温28℃摇床中培养20天，得到菌丝体和发酵液(图5)，并与未混合的、同样条件下单独培养的半伏小薄孔菌和曲霉发酵液进行对比。
(5)发酵液萃取：将发酵液经过过滤处理除去菌丝体，得到的发酵液3L用重蒸处理过的工业级乙酸乙酯(共计5L)分批萃取3次，经过减压浓缩得到粗浸膏0.9g。用HPLC分析所述共培养是否生成了新的化合物，将所述半伏小薄孔菌株和真菌曲霉在相同条件下单独培养，然后也对所述发酵液进行分析，并取各自单独发酵液萃取后混合后再用HPLC分析，通过上述分析证明共培养下确实产生了单独培养没有的化合物，如图6所示。
图6.真菌曲霉和真菌半伏小薄孔在土豆液体培养基中混合培养的液体基质乙酸乙酯提取浸膏经高效液相色谱分析所得色谱图。
分析条件：高效液相色谱仪为DIONEX Ultimate/3000；色谱柱为YMC-Pack ODS-A-HG(250×4.6mm)；洗脱条件为甲醇-水混合体系，甲醇与水的体积比在 30min内从10％升到100％；弯胞霉菌素保留时间为22.84分钟，脱氢弯胞霉菌素的保留时间为21.28分钟；紫外检测波长220nm。
图注：A.真菌曲霉和真菌半伏小薄孔混合培养发酵液乙酸乙酯提取物高效液相色谱分析图；B.真菌曲霉单独培养发酵液乙酸乙酯提取物高效液相色谱分析图； C.真菌半伏小薄孔单独培养发酵液乙酸乙酯提取物高效液相色谱分析图；D.B 和C的混合样品高效液相色谱分析图。
(6)弯孢霉菌素的重结晶：将萃取所得粗浸膏用常压柱层析进行分离，洗脱溶剂为乙酸乙酯和石油醚，得到不同的极性组分，其中乙酸乙酯/石油醚(v/v)洗脱比例为0/1至2/3所得组分共451mg，热溶于乙腈，放置于室温下24h，有晶体析出共180mg，产率为20％，经鉴定即为弯孢霉菌素，如图7所示。
(7)弯孢霉菌素的纯度分析(如图8所示)：产品纯度>99.0％。
(8)产品各项指标分析：
图8.弯胞霉菌素结晶体高效液相色谱分析图。
分析条件：高效液相色谱仪为DIONEX Ultimate/3000；色谱柱为COSMOSIL 5C18-MS-II；洗脱条件为乙腈-水混合体系，乙腈与水的体积比在30min内从10％升到100％；弯胞霉菌素保留时间为16.81分钟；紫外检测波长220nm。
熔点MP：208-211℃。
比旋光度[α]D 20:-46.7(c 0.021,CH3OH)。
紫外-可见特征吸收：λmax(MeOH)nm(logε):222(1.37),272(0.71)和306(0.53)。核磁共振氢谱(如图9所示，分析条件：核磁共振氢谱在Bruker-ARX-400核磁共振谱仪上测定，溶剂为氘代氯仿，内标为四甲基硅烷。)：
1H NMR(400MHz,DMSO):9.96(1H,s,OH-7),9.77(1H,s,OH-5),6.27(1H,d,J＝2,H-6),6.17(1H,d,J＝2.4,H-4),4.85-4.82(1H,m,H-15),3.71(1H,d,J＝15.6,H-2a), 3.59(1H,d,J＝15.6,H-2b),2.98-2.96(1H,m,H-10a),2.70-2.66(1H,m,H-10b), 1.62-1.54(1H,m,H-12a),1.53-1.51(1H,m,H-14a),1.46-1.40(1H,m,H-12b), 1.38-1.29(3H,m,H-11a,H-13a and H-14b),1.21-1.17(2H,m,H-11b and H-13b), 1.07(3H,d,J＝6.4,H-16).
核磁共振碳谱(如图10所示，分析条件：核磁共振碳谱在Bruker-ARX-400核磁共振谱仪上测定，溶剂为氘代氯仿，内标为四甲基硅烷。)：
13C NMR(100MHz,DMSO):206.5(C-9),170.7(C-1),159.6(C-5),157.8(C-7),135.7(C-3),120.1(C-8),111.4(C-4),102.1(C-6),71.9(C-15),43.4(C-10),39.1(C-2),32.1(C-14),26.7(C-11),23.8(C-13),22.8(C-12),20.6(C-16).
分子量：m/z[M+H+]calcd.forC16H21O5:293.1389；found:293.1360。

Claims (4)

1.一种多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法，其特征在于，具体工艺步骤如下：
（1）种子液制备：在无菌条件下，分别挑取真菌曲霉、真菌半伏小薄孔菌块置于各自的种子培养基中，恒温摇床中培养3-5天，得到真菌曲霉种子液及真菌半伏小薄孔种子液待用；
（2）发酵培养：将步骤（1）中的种子液真菌曲霉种子液及真菌半伏小薄孔种子液分别接种到各自的发酵培养基中，恒温摇床中培养5-8天，得到真菌曲霉发酵液及真菌半伏小薄孔发酵液；
（3）混合培养：在无菌条件下，将步骤（2）中真菌曲霉发酵液整体倒入真菌半伏小薄孔发酵液中，再在恒温摇床中继续培养20-28天，得到发酵基质；
（4）发酵液萃取：将步骤（3）中混合培养得到的发酵基质过滤除去菌丝体，得到含弯孢霉菌素的发酵液，利用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩得到含弯孢霉菌素的浸膏；
（5）弯孢霉菌素的精制：将浸膏热溶于乙腈，过滤除去不溶物，室温下静置至析出弯孢霉菌素晶体，即为得到弯孢霉菌素。
2.根据权利要求1所述的多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法，其特征在于，所述的种子培养基和发酵培养基均是土豆液体培养基，即将去皮土豆与葡萄糖按质量比10-12:1制得。
3.根据权利要求1所述的多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法，其特征在于，恒温摇床培养过程中，转速为100-140 r/min、温度为25-28°C的恒温条件。
4.根据权利要求1所述的多菌混合发酵制备弯孢霉菌素的方法，其特征在于，真菌曲霉发酵液与真菌半伏小薄孔发酵液的体积关系为5:1-1:5（V/V），优选1:3（V/V）。
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