CN105886418A - 偶发分枝杆菌在发酵生产表博醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)突变株，该菌株能够一步发酵生产表博醇，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC 9725。表博醇是合成黄体酮、角鲨胺等药品的重要中间体，采用本发明保藏号为CGMCC 9725的偶发分枝杆菌可将植物甾醇降解生产表博醇，并可将表博醇排出胞外大量积累，底物投料量浓度为2.5％，重量收率可达37～43％，纯度高达96.7％，且杂质量较少，生产成本较低，能够满足工业化生产需求。
Description
技术领域：
本发明涉及一株生产甾体激素的偶发分枝杆菌菌株，相关液体菌剂及其在生产表博醇中的应用，具体地说，本发明涉及一株发酵生产表博醇的偶发分枝杆菌菌株，含有菌株的菌剂及在生产表博醇中的应用。
背景技术：
表博醇作为一种甾醇降解物，是合成黄体酮、角鲨胺等甾体药品的重要中间体，角鲨胺是存在于鲨鱼组织中的氨基甾醇，可从多刺的角鲨鱼，海绿角鲨的胃中分泌物中分离得到，具有广谱抗菌作用和抗血管生成效应，近年来，研究人员发现这种物质还具有良好的抗癌功效，由于从角鲨以及相关鱼类提取成本高，得率低，并难以产业化，近年来，研究人员一直在探索一条大规模高效生产角鲨胺的技术路线，而本发明的发酵产物表博醇是合成角鲨胺的重要中间体，此外，黄体酮也是一种重要的天然孕激素，其规模化生产也需要大量的表博醇，因此，研究人员迫切需要寻找大规模低成本生产表博醇的工艺途径和相关菌株。
早在1972年，Marsheck et al利用甾醇经微生物降解能够生成表博醇，但表博醇的收率仅20～40mg/L，没有进行大规模工业生产的价值。对于表博醇的发酵工艺研究主要集中在20世纪80年代初期，1978年日本研究人员提出了由植物甾醇降解制备1，4表博醇及表博醇的方法，两种物质总收率50～60％，其中以1，4表博醇为主，约占总重的95％以上，且底物投料浓度仅0.5％～0.8％，同样难以满足表博醇大规模产业化生产的需要。
此后陆续有研究报道在甾醇降解制备雄烯二酮(4AD)的过程均发现有表博醇的产生，但均未以表博醇为目的产物展开详细的大规模生产相关研究。综上所述，无论从发酵工艺，还是产物收率和纯度，目前已经公开的方法都不适合大规模的工业化生产。
发明技术内容：
本发明的第一个目的是提供一株偶发分枝杆菌突变株，使用该突变株，可将植物甾醇转化为表博醇，且该突变株能有效抑制表博醇甾核1，2位脱氢，以及17位碳侧链羟甲基的降解，使表博醇得以累积并分泌到胞外。
本发明的第二个目的是提供一种含有偶发分枝杆菌突变株的液体菌剂。在必要的时候，该液体菌剂还可以包含菌剂制备常用的载体和辅料。
本发明的第三个目的是提供偶发分枝杆菌突变株及其菌剂在发酵生产表博醇中的应用。
本发明的第四个目的是提供发酵生产表博醇的方法。
本发明公开了一株偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)突变株SZ-BBC-101，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC 9725，保藏日期是2014年9月25日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明中公开的偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)突变株SZ-BBC-101，CGMCC 9725通过如下方式选育获得：
菌种分离：菌种的分离基物是存放植物甾醇库房附近的土壤，使用固体培养基划线，31℃培养，观察菌落形态，挑选单菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，显微镜微观为短杆状进行再培养，使用液体培养基在31℃，150rpm培养。
菌种诱导：当菌体密度生长至108个/ml，离心收集菌体，用柠檬酸钠溶液洗菌，并用柠檬酸钠溶液将菌体稀释到原体积，并加入亚硝基胍，制成菌悬液，菌悬液37℃水浴30分钟，再次离心，菌体用磷酸缓冲液冲洗，并重新在磷酸缓冲液中悬浮分散。
菌株生长筛选：将诱变后的菌悬液进行稀释涂布至初筛固体培养基上，于31℃培养7天，挑取单菌落接种到复筛固体培养基中，凡在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的纯化培养，得到诱变后的菌株。
菌株转化筛选：将诱变后的菌株接种到液体培养基上，31℃，150rpm培养48小时，再接种到转化培养基中，接种量10％，在31℃，200rpm，转化72小时，取样送液相检测，根据液相结果确定诱变后菌株转化生成表博醇能力的优略。
经过以上诱变筛选工作，得到一株优良的变异菌株，并命名为偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)突变株SZ-BBC-101，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC 9725，保藏日期是2014年9月25日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101，CGMCC 9725有如下形态学特征：在不同生长环境下，菌体形态呈现差别，但基本上均为短杆状，菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，菌体尺寸较一般细菌小，长约0.6～1.0微米，宽0.3～0.4微米。可将植物甾醇降解转化为表博醇，并在胞外大量积累，重量收率可达37～43％，达到工业化生产标准。
本发明的发酵反应如附图1所示。
本发明还公开了含有偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101，CGMCC 9725的液体菌剂，按重量计，该菌剂含菌体生物量是1％～1.5％，余量为培养过CGMCC 9725的液体培养基。
本发明还公开了制备偶发分枝杆菌突变株及其液体菌剂的方法。生产液体菌剂的方法包括下列步骤：
A斜面种子培养：将CGMCC 9725接种于固体培养基上，30-32℃培养；
B液体种子培养：从A项培养的固体斜面上刮取菌体，接种到液体培养基中，150rpm，30-32℃培养；
C计数：按重量计，含菌体生物量是1％～1.5％，余量为培养过CGMCC 9725的液体培养基，得液体菌剂；
其中，固体培养基组分是：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，琼脂1.5％-2.0％，余量为水。
液体培养基组分是：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，玉米浆54g/L，余量为水。
本发明还公开了偶发分枝杆菌突变株及其菌剂在发酵生产表博醇中的应用。
本发明还公开了生产表博醇的方法，该方法包括下列步骤：
①发酵培养：将含有偶发分枝杆菌液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为10％～15％，转化温度为30-32℃，发酵培养的转速为200-400rpm，空气流量为30-35L/min，罐压为0.045±0.055MPa；
②分离提取：加热分层，取油层，乙醇萃取，浓缩离心，正己烷过滤除油，乙醇活性炭脱色，浓缩，乙醇精制，析晶，干燥得表博醇；
其中转化培养基组分为：玉米浆54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸1g/L，吐温-801g/L，卵磷脂0.25g/L，豆油160g/L，植物甾醇25g/L，余量为水；
在本发明中植物甾醇是β-谷甾醇，豆甾醇，菜油甾醇，菜籽甾醇，玉米甾醇或木甾醇中的一种或多种。
在本发明中，表博醇是合成黄体酮、角鲨胺等药品的重要中间体。
本发明的有益效果
1.本发明利用一株突变的偶发分枝杆菌发酵生产表博醇，使用合适的发酵液，接种浓度和发酵培养条件，显著提高了偶发分枝杆菌生产表博醇的效率，并缩短的发酵工艺流程，节约发酵时间，并显著减少副产物的产生；
2.本发明采用的偶发分枝杆菌生产表博醇，可将表博醇排出胞外大量积累，由于该突变株1，2脱氢的活性丧失，因此不再产生1，4表博醇，节约了纯化流程，降低了纯化成本。
3.本发明的制备表博醇的方法还具有下面特点：
底物投料量大，重量收率可达37～43％，获得的表博醇成品纯度高达96.7％，且杂质量较少，生产成本较低，能够满足工业化生产的要求，为利用微生物发酵法大规模生产表博醇提 供了新的思路。本发明涉及的突变菌株以及相关发酵方法具有广阔的产业化应用前景。
附图说明：
图1是生物发酵反应示意图。
A表示植物甾醇，B表示表博醇。
图2是表博醇精致成品的高效液相色谱图。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1.偶发分支杆菌突变株SZ-BBC-101的选育获得。
1.1菌种分离：在本工厂厂区存放植物甾醇的厂房附近的土壤取样，使用固体培养基划线，31℃培养，观察菌落形态，挑选单菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，显微镜微观为短杆状进行再培养，使用液体培养基在31℃，150rpm培养。
固体培养基配方及配制方法：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，按实际需要秤取以上物质，加入纯化水，搅拌溶解，1mol/L氢氧化钠溶液调pH7.5，加入琼脂2.0％，加热溶清，如制作斜面，溶清后分装至试管或茄型瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却到70℃摆放斜面或倒平板，冷却至室温凝固后，31℃空培养48小时，无菌落出现则可以使用。
液体培养基配方及配制方法：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，玉米浆54g/L，1mol/L氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，用纯化水定容至1L，121℃灭菌20分钟。
1.2菌体诱变：当菌体生长密度达到108个/ml，将液体菌剂涂布于固体培养基平板上，并于涂布接种后再在固体培养基平板中央及周边数处均匀点放亚硝基胍小颗粒，31℃培养7天后，用接种环紧靠各个亚硝基胍抑菌圈外侧，将菌苔挑于无菌生理盐水中制成菌悬液，用以进行突变株筛选。
1.3突变株筛选：将诱变后的菌悬液进行稀释涂布，培养基使用初筛培养基，于31℃培养7天。挑取单菌落接种到复筛培养基中，凡是在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的纯化培养，得到诱变后的菌株。
初筛培养基配方及配制方法：葡萄糖10g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水硫酸镁0.3g/L，七水硫酸亚铁0.05g/L，琼脂20g/L，pH7.5，培养基121℃灭菌20分钟。
复筛培养基配方及配制方法：表博醇5g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾4g/L，七水硫酸镁0.3g/L，七水硫酸亚铁0.05g/L，琼脂20g/L，pH7.5，培养基121℃灭菌20分钟。
1.4菌种摇瓶转化能力测试：将诱变后的菌株接种到液体培养基上，31℃，150rpm，培养48小时，再接种到转化培养基中，接种量10％，在31℃，200rpm，转化72小时，取样送液相检测，根据液相结果对比突变后的菌株转化能力优劣，最终确定目标菌株。
液体培养基配方及配制方法：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，玉米浆54g/L，余量为水，1mol/L氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
转化培养基配方及配制方法：玉米浆54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸1g/L，吐温-801g/L，卵磷脂0.25g/L，豆油64g/L，植物甾醇10g/L，余量为水。
经过以上诱变选育工作，得到一株优良的突变株，分类命名为偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)突变株SZ-BBC-101，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC 9725，保藏日期是2014年9月25日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101，CGMCC 9725有如下特征：在不同生长环境下，菌体形态呈现差别，但基本上均为短杆状，菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，菌体尺寸较一般细菌小，长约0.6～1.0微米，宽0.3～0.4微米。可将植物甾醇降解转化为表博醇，并在胞外大量积累，纯化方便，产率高。
实施例2.偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101液体菌剂制备方法。
2.1斜面固体培养基的配制：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，按实际需要秤取以上物质，余量为水，搅拌溶解，1mol/L氢氧化钠溶液调pH7.5，加入琼脂2.0％，加热溶清，分装至茄型瓶中，加入量约为茄型瓶的20％，然后塞好胶塞，于121℃灭菌20分钟，冷却到70℃摆放斜面，冷却至室温凝固后，31℃空培48小时，无菌落出现则可以使用。
2.2液体种子培养基的配制：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，玉米浆54g/L，1mol/L氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，余量为水，121℃灭菌20分钟，冷却到室温。
2.3将偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101接种到斜面固体培养基上，于31℃培养7天。从斜面固体培养基上刮取菌体接种到液体种子培养基中，在31℃，150rpm，培养48小时，得液体菌剂。
2.4取样计数，按生物量测定方法测菌体含量，按重量计，该液体菌剂的含生物量约为1％～1.5％，余量为培养过偶发分枝杆菌突变株的培养基。
生物量测定方法：取100ml样品，抽滤，滤渣刮下，放置在滤纸上将培养基吸干，称重结果如下。
| 实验批次 | 菌体重量 | 生物量 | 余量 |
| 20140401 | 1.23g | 1.23％ | 培养基 |
| 20140402 | 1.49g | 1.49％ | 培养基 |
| 20140403 | 1.00g | 1.00％ | 培养基 |
| 20140404 | 1.37g | 1.37％ | 培养基 |
| 20140405 | 1.50g | 1.50％ | 培养基 |
| 20140406 | 1.02g | 1.02％ | 培养基 |
实施例3.偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101菌株及液体菌剂的应用。
3.1检测方法
(1)高效液相色谱检测条件
流动相：甲醇∶水＝70∶30，流速：1.0ml/min，检测波长：254nm，柱温：25℃，进样量：10μl，溶液配制：准确称取15mg供试品，用甲醇稀释至50ml，操作：分别进10μl空白溶液和测试液。
(2)重量收率＝(表博醇重量÷底物重量)×100％。
3.2 5L摇瓶转化
发酵培养：将液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中，接种量为10％，于31℃，200rpm，转化72小时，转化培养基配方为玉米浆54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸1g/L，吐温-801g/L，卵磷脂0.25g/L，豆油160g/L，总含量95％植物甾醇25g/L，余量为水；
分离提取：取样，薄层色谱(TLC)点板检测，转化完全，加热至75-80℃，并充分搅拌混匀，静置分层，取油层，用3体积95％乙醇萃取三次，乙醇萃取液浓缩至绝大部分结晶析出，离心得到表博醇萃取粗品，1.5体积的正己烷搅拌保温(55-57℃)2小时，过滤除油得到表博醇除油半成品，7体积95％乙醇，5％重量的活性碳搅拌保温(58-60℃)2小时，离心分离活性炭，料液浓缩得到表博醇脱色半成品，2体积95％乙醇搅拌保温(58-60℃)2小时，充分溶解，冷却水缓慢降温至30℃，再用冰水冷却到15℃析晶，离心分离得到表博醇精制半成品，70℃，-0.07MPa，干燥12小时，得到表博醇精制成品，送高效液相色谱检测含量，表博醇重量收率如下。
| 实验批次 | 重量收率 |
| 20140601 | 39.3％ |
| 20140602 | 37.0％ |
| 20140701 | 42.7％ |
| 20140702 | 41.5％ |
| 20140801 | 38.6％ |
| 20140802 | 43.0％ |
3.3 50L发酵罐转化
发酵培养：将液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中，转化培养基装样量为27L，接种量为10％，共计30L，转化温度31℃，搅拌速度400rpm，空气流量为30-35L/min，罐压为0.05MPa，转化66小时。转化培养基配方为玉米浆54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸1g/L，吐温-801g/L，卵磷脂0.25g/L，豆油160g/L，总含量95％植物甾醇25g/L，余量为水。
取样，薄层色谱(TLC)点板检测，转化完全，加热至75-80℃，并充分搅拌混匀，静置分层，取油层，用3体积95％乙醇萃取三次，乙醇萃取液浓缩至绝大部分结晶析出，离心得到表博醇萃取粗品，1.5体积的正己烷搅拌保温(55-57℃)2小时，过滤除油得到表博醇除油半成品，7体积95％乙醇，5％重量的活性碳搅拌保温(58-60℃)2小时，离心分离活性炭，料液浓缩得到表博醇脱色半成品，2体积95％乙醇搅拌保温(58-60℃)2小时，充分溶解，冷却水缓慢降温至30℃，再用冰水冷却到15℃析晶，离心分离得到表博醇精制半成品，70℃，-0.07MPa，干燥12小时，得到表博醇精制成品送高效液相色谱检测，高效液相色谱谱图见图2，表博醇重量收率43.0％。
根据图2显示的产物及杂质如下：
本发明相关技术方案的保护范围并不限于实施例中的内容，实施例的内容仅起到解释本发明技术方案的示例性作用，与实施例相关技术方案的变体或常规参数调整后的技术方案仍在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一株偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)突变株SZ-BBC-101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号是CGMCC 9725。
2.一种含有权利要求1所述突变株的液体菌剂，按重量计，该菌剂含菌体生物量是1％～1.5％。
3.一种制备权利要求2所述液体菌剂的方法，该方法包括下列步骤：
A斜面种子培养：将权利要求1所述的偶发分枝杆菌突变株SZ-BBC-101接种于固体培养基上，30-32℃培养；
B液体种子培养：从A步骤中培养的固体斜面上刮取菌体，接种到液体培养基中，150rpm，30-32℃培养；
C获得液体菌剂：按菌体湿重计，获得含菌体生物量是1％～1.5％的液体菌剂，余量为培养权利要求1所述偶发分枝杆菌突变株的液体培养基；
其中，所述固体培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，琼脂1.5％-2.0％，余量为水；
所述液体培养基包括：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，玉米浆54g/L，余量为水。
4.权利要求1所述的突变株在发酵生产表博醇中的应用，所述表博醇的结构式为：
5.权利要求2所述的液体菌剂在发酵生产表博醇中的应用，其中所述表博醇的结构式为：
6.一种生产表博醇的方法，该方法包括下列步骤：
①发酵培养：将权利要求2所述的液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为10％～15％，转化温度为30-32℃，转速为200-400rpm，空气流量为30-35L/min，罐压为0.045±0.055MPa；
②分离提取：加热分层，取油层，乙醇萃取，浓缩离心，正己烷过滤除油，乙醇活性炭 脱色，浓缩，乙醇精制，析晶，干燥得表博醇；
其中所述转化培养基包括：玉米浆54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，柠檬酸1g/L，吐温-801g/L，卵磷脂0.25g/L，豆油160g/L，植物甾醇25g/L，余量为水；
所述植物甾醇为β-谷甾醇，豆甾醇，菜油甾醇，菜籽甾醇，玉米甾醇或木甾醇中的一种或多种。
7.根据权利要求6中的方法，该方法包括下列步骤：
①发酵培养：将液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为10％，于31℃，转速400rpm转化，转化时间为66小时，空气流量为35L/min，罐压为0.050MPa；
②分离提取：取样，薄层色谱(TLC)点板检测，转化完全，加热至75-80℃，并充分搅拌混匀，静置分层，取油层，用3体积95％乙醇萃取三次，乙醇萃取液浓缩至绝大部分结晶析出，离心得到表博醇萃取粗品，1.5体积的正己烷搅拌保温2小时，保温温度为55-57℃，过滤除油得到表博醇除油半成品，7体积95％乙醇，5％重量百分比的活性碳搅拌保温2小时，保温温度为58-60℃，离心分离活性炭，料液浓缩得到表博醇脱色半成品，2体积95％乙醇搅拌保温2小时，保温温度为58-60℃，使其充分溶解，冷却水缓慢降温至30℃，再用冰水冷却到15℃析晶，离心分离得到表博醇精制半成品，70℃，-0.07MPa，干燥12小时，得到表博醇精制成品。
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