CN103898188A - Lc-ms研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法，包括稻瘟病菌菌丝样品的培养、过滤收集、液氮灭活处理、冷冻干燥；冻干后的菌丝块于-70℃冷藏作为样品备用。本发明还同时提供了利用上述样品进行的检测法，将样品研磨破碎后进行溶剂提取；提取完毕后，离心，所得上清过0.22μm的有机相微孔滤膜后进行上机检测：选用C18色谱柱（2.1×100mm，1.8μm）；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为含0.1%FA的水和含0.1%FA的乙腈，流速0.4mL/min；质谱采用ESI（+）电离方式，质量扫描范围100～1100。采用本发明的提取及检测方法能得到较好的TIC图。

Description

LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法

技术领域

本发明涉及丝状真菌非靶向代谢组学研究中的一种样品制备及检测方法，具体为：基于LC-MS分析平台，建立一种适用于稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）菌丝组织代谢组学样品制备检测方法。

背景技术

自20世纪90年代提出代谢组学（Metabonomics）的概念以来，代谢组学发展迅速，随着检测手段及数据分析技术的不断更新，代谢组学已经深入到基础生物学研究的方方面面，并在揭示生命基本活动及规律方面发挥着越来越重要的作用（Nicholson and Lindon，2008）。

目前，代谢组学研究一般包括：样品制备、代谢分析平台数据采集、多变量数据分析、目标物识别和研究结果的解释与应用等步骤。

在代谢组学研究中，样品制备是最容易引入系统误差的一步，样品制备分为组织取样、匀浆、提取、保存和样品预处理等步骤（Fukusaki and kobayashi，2005）。代谢物作为生物体中的终产物，在很多时候其差异比生物体相应的转录和蛋白质水平显示的差异要大，是代谢组学分析较之其他“组学”的优势之一。同时也正是因为生物代谢途径对外界环境扰动的敏感，造成不同生物个体之间的代谢物组成及含量差异很大。已有研究表明，即便是在严格控制的生长条件下，分析样品之间代谢组的生物差异也要高于其他系统差异好几倍（Roessner etal.，2000）。所以在样品取材、提取方法及分析方法尽量保持一致，以尽量避免引入系统误差。代谢产物通常用水和有机溶剂（如甲醇和乙腈等）分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性的亲脂相和极性相分开。然而生物代谢物千差万别，其中很多物质稍受干扰，结构就会发生改变，且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有通用所有代谢物的提取方法，只能根据所要分析的特定生物物种组织材料、目标代谢物特性及使用鉴定手段选择合适的提取方法，而提取时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等则是影响样品制备的水平的重要因素。

丝状真菌尤其是植物病原菌（如稻瘟病菌等）代谢组学的研究国内外报道较少，对于其代谢组学样品的提取方法没有统一适用的标准，因此建立一种高效、快速、重现性好的代谢组学样品提取及检测方法开展该菌代谢组学的研究，对于寻找稻瘟病菌生长发育、致病过程中的关键代谢物以及潜在药物靶标的发掘具有重要意义，同时，开展稻瘟病菌野生型菌株与不同基因突变体比较代谢组学的研究，将进一步明确突变基因在代谢物积累、变化方面的影响，从而将基因的功能研究推向新的层次，最终有助于更全面理解该水稻病害的致病机理。

现有的关于菌丝组织的样品制备为：

于2012年的发表的丝状真菌代谢组研究的操作Protocol文章，样品制备的工艺操作步骤如下：1）、将三角瓶培养的菌丝物，用移液器吸取10mL，转移至含有20mL萃取溶剂的50mL的大离心管中；2）、取一50mL的注射器，抽出活塞，然后将一100cm²大小的纱布折叠成三层，把它放在注射器的活塞入口；3）、将1步骤中的打离心管中的菌丝物，倾倒在三层纱布上，插入并推动活塞将培养基及水分挤出；4）、然后小心取出活塞，同时避免将菌丝组织带出，向注射器筒内加入10mL水洗溶液，然后再将活塞插入并推动将水分挤出；5）、去除活塞，用镊子将附有菌丝的纱布从注射器底部夹出；6）、然后用刮刀，将纱布的粘着的菌丝一点一点的刮下来；7、随后用液氮速冻，后对菌丝冻干。

上述方法虽然也能收集到菌丝，但操作步骤比较繁琐，费时费力，人为因素干扰较大，可操作性差，样品误差及损失大，且对菌丝样品的完整性破坏性较大，主要缺陷主要表现在以下几点：

1、整个操作过程中步骤繁多，尤其是不断抽拔活塞，每一次都需小心翼翼，避免将菌丝带出，所用的器具物品变换多，容易造成外源物的带入，影响实验的准确性；

2、收集菌丝量少，每次仅收集10mL的菌丝培养物，收集效率低；

3、在用注射器活塞挤压菌丝除水时，不可避免的将菌丝压破，造成内部代谢物的外渗，同时，活塞与菌丝的接触面，会多多少少的沾有菌丝碎片，造成样品的损失，因此，这样代谢物外渗和人为损失造成的误差非常大；

4、同样的问题发生在用刮刀刮取纱布上粘着的菌丝过程中，菌丝因会部分进入纱布的网孔中，且真菌菌丝因分泌多糖等物质，非常粘，用刮刀片很难将其从纱布上刮除干净，而且同样不可避免的刮破菌丝，造成内容物的外渗损失，因此，可操作性难度大，且样品损失及误差大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法，包括稻瘟病菌菌丝样品的培养、过滤收集、液氮灭活处理、冷冻干燥；

所述稻瘟病菌菌丝样品的培养为：将稻瘟病菌的菌丝组织于CM液体培养基中黑暗摇菌培养3～4d，培养温度为25.5～26.5℃（较佳为26℃），转速为100～200rpm；得菌丝培养物；

所述过滤收集为：将菌丝培养物通过抽滤装置收集（快速收集）到干净的滤纸上并抽沥干；

所述液氮灭活处理为：将附有菌丝的滤纸取出折成小纸包，投入（迅速投入）到液氮（-196℃）中速冻3～5min；

所述冷冻干燥为：将经灭活处理后的菌丝小包于-35～-45℃的低温下真空冷冻2～3天；从而确保菌丝组织的含水率≤3%（质量%）；冻干后的菌丝块于-70℃冷藏作为样品备用。

作为本发明的基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法的改进：所述过滤收集为：

先将滤纸铺在布氏漏斗中，用无菌水冲洗一次，然后将菌丝培养物倒入布氏漏斗中的滤纸上，开启真空泵抽滤（快速抽滤）掉多余培养基，用无菌水冲洗三次并抽沥干。

本发明还同时提供了利用上述制备法所得样品进行的检测法，将样品依次进行以下步骤：

1）、研磨破碎：

取冻干后的菌丝块进行研磨破碎处理，得菌丝粉末；

2）、溶剂提取：

在19.9～20.1mg的菌丝粉末中加入1.425～1.575mL的提取溶剂，还加入20μL作为内标的浓度为5mg/mL的伞形酮（Umbelliferone）溶液；采用超声提取的方式于24.5～25.5℃（较佳为25℃）提取38～42min（较佳为40min）；

所述提取溶剂为：在100体积份的体积浓度为75%甲醇中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；简称为：75%甲醇（0.1%FA）；

即，提取溶剂用量按照V/W=75：1（mL/g）；

备注说明：

伞形酮（Umbelliferone）即伞形酮内酯Umbelliferone；

伞形酮（Umbelliferone）溶液以上述提取溶剂作为溶剂；

3）、提取完毕后，离心，所得上清过有机相微孔滤膜（0.22μm）后进行下述步骤4）；

4）、上机检测：

选用C18色谱柱（2.1×100mm，1.8μm）；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为含0.1%FA的水和含0.1%FA的乙腈，流速0.4mL/min；质谱采用ESI（+）电离方式，质量扫描范围100～1100；

所述含0.1%FA的水为：在100体积份的水中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；简称为：水（0.1%FA）；

所述含0.1%FA的乙腈为：在100体积份的乙腈中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；简称为：乙腈（0.1%FA）。

作为本发明的检测法的改进：

所述步骤4）的上机检测中：

色谱梯度洗脱程序参数中，流动相中乙腈的百分比为2min，10%；5min，40%；10min，50%；16min，68%；23min，85%；25min，90%；27min，100%；31min，100%；32min，5%。

作为本发明的检测法的进一步改进：

所述步骤1）为：取冻干后的菌丝块，放入到液氮预冷过的研钵中，加入液氮，快速研磨至粉末（或用球磨仪进行磨碎）；得菌丝粉末。

在本发明的样品制备法中，采用了本发明所特设的过滤收集步骤、液氮灭活处理步骤；即具体为：将三角瓶中的菌丝培养物倒入铺有滤纸的抽滤装置中，开动真空泵即可立刻将菌丝抽沥干；收集菌丝量大，抽滤一次可收集250mL培养物甚至更大量的菌丝，保证开展各种研究的样品量；抽滤过程可用纯净水多次反复冲洗、抽滤，可最大可能地去除掉菌丝表面的培养基，保证了菌丝样品的洁净度；随后将附着有菌丝的滤纸取下，快速折叠，投入到液氮速冻。因此具有如下优点：操作简单，收集量大，效率高，省时，保持了菌丝的完整性。整个操作熟练完成，仅需10s即可，快速灭活，避免了代谢物的降解，大大减少了实验误差。

本发明的检测法，从最终检测结果可以看出，本发明所用的提取及检测方法确实可以得到了较好的TIC图。

为了实现对稻瘟病菌这种植物病原模式真菌非靶向代谢组学的研究，本发明提供一种基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备方法，包括样品的培养、收集、冻干以及保存等，并对影响代谢物提取效果的四个因素（提取溶剂成分、提取方式、提取温度、提取时间）在三个水平上进行正交设计，从而找出了最适的代谢物提取方法。

本发明的优点是：

1、在样品制备方面，实现了稻瘟病菌菌丝的培养、过滤收集、液氮灭活处理及冷冻干燥等一系列操作的高效、连续组合，操作简单、装置搭配巧妙实用，尤其是实现了样品的快速收集并灭活，保证了样品内及样品间代谢物的实时性和处理一致性；

2、在样品提取检测方面，进行了各种影响因素组合效果的检测，得出了最适提取方法，并进一步优化了色谱梯度洗脱程序参数，使色谱峰随保留时间得到有效分离且峰形质量好，可以达到目标峰峰面积的准确积分的要求，实例验证该方法操作快速简单、提取效率高、重现性好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明工艺流程图。

图2为9种提取方法的实验样本TIC轮廓谱比较。

图3为采用本发明方法对稻瘟病菌Guy11菌丝6份平行重复进样的总离子流色谱图（Totalion chromatogram，TIC）。

图4为采用本发明方法对稻瘟病菌2539菌丝样品进样的总离子流色谱图。

图5为采用本发明方法对稻瘟病菌突变体ΔATG1菌丝6份平行重复进样的总离子流色谱图。

图6稻瘟病菌Guy11分生孢子5份平行重复进样的总离子流色谱图。

具体实施方式

实施例1、

1、基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法：

1）、稻瘟病菌菌丝样品的培养：

取一生长5～7d左右的稻瘟病菌Guy11的CM培养基平板，在超净工作台中，滴加3mL无菌水，用三角玻棒刮取菌落，收集菌丝组织洗脱液，用移液器吸取并加入到装有125mL CM液体培养基的三角瓶中，于26℃摇床黑暗振荡培养3～4d（不易时间过长，以免菌丝黑化），转速140rpm；得菌丝培养物；

2）、过滤收集：

待培养好后，将盛有稻瘟病菌菌丝（菌丝培养物）的三角瓶，先置于冰上备用。先将滤纸铺在布氏漏斗中，用无菌水冲洗一次，后将菌丝培养物倒入布氏漏斗中的滤纸上，开启真空泵快速抽滤掉多余培养基，用无菌水冲洗三次并抽沥干；

3）、液氮灭活处理：

将附有菌丝的滤纸取出折成小纸包，迅速投入到液氮（-196℃）中速冻3～5min；

4）、冷冻干燥：

将将经灭活处理后的菌丝小包取出，然后置于真空冷冻干燥机中，低温（即-40℃）干燥2～3天，直至菌丝组织充分干燥（即，含水率≤3%），冻干后的菌丝块于-70℃冷藏作为样品备用。

2、利用上述所得样品进行的检测法（代谢物提取与检测）：

所用仪器平台及参数条件：仪器LC Q-TOF/MS；色谱条件：色谱柱C18，2.1×100mm，1.8μm；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为：溶剂A为水（0.1%FA），溶剂B为乙腈（0.1%FA），所用初始UPLC梯度洗脱程序如表1-1；质谱条件：电离方式ESI（+），质量扫描范围100～1100。

备注说明：

水（0.1%FA）：在100体积份的水中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；

乙腈（0.1%FA）：在100体积份的乙腈中加入0.1体积份的甲酸混合后而得。

具体操作步骤如下：

1）、研磨破碎：

取冻干后的菌丝块，放入到液氮预冷过的研钵中，加入液氮，快速研磨至粉末（或用球磨仪进行磨碎）；得菌丝粉末。

2）、溶剂提取：

精确称量步骤1）所得的菌丝粉末20mg，要求误差小于0.5％，即，19.9～20.1mg；

用玻璃进样针，向上述菌丝粉末中精确加入提取溶剂1.5mL，要求误差小于5％；然后精确加入作为内标的Umbelliferone溶液（5mg/mL）20μL（备注说明：以相应的提取溶剂作为溶剂）；涡旋10s，接着再次涡旋混匀一次；

超声（或震荡、静置）提取数十分钟（如表1-2所示），期间取出上下颠倒混匀2～3次；

3）、提取完毕后，14000rpm，4℃离心15min；取上清过有机相微孔滤膜（0.22μm）后进行下述步骤4）；

4）、转移至新的2mL样品瓶中进行液相质谱联用仪（LC Q-TOF/MS）上样检测，得到相应的代谢物总离子流色谱图，获得原始质谱数据结果。

表1-1初始色谱梯度洗脱程序参数

时间（min）	流速(mL/min)	流动相B(%)
			2	0.4	10
8	0.4	20
			10	0.4	50
18	0.4	85
			23	0.4	90
26	0.4	100
			30	0.4	100

31

0.4

5

3、不同提取方法提取效果比较如下：

对本试验分析，影响稻瘟病菌菌丝内代谢物提取效果的因素有很多，如提取溶剂成分、提取方式、提取时间、提取温度等，并将它们确定为本试验的试验因素，分别记作A、B、C和D，进行四因素正交试验，各因素均取三个水平，因素水平表见表1-2，正交表见表1-3。

表1-2影响代谢物提取效果的因素及各种水平

备注说明：75%甲醇（0.1%FA）为：在100体积份的体积浓度为75%甲醇中加入0.1份的甲酸混合后而得。

其余以此类推。

表1-3稻瘟病菌菌丝代谢物提取优化试验正交设计表L₉（3⁴）

注：溶剂Ⅰ：75%甲醇（0.1%FA）；溶剂Ⅱ：甲醇：氯仿：水5:2:2（0.1%FA）；溶剂Ⅲ：乙腈（0.1%FA）。

图2中比较了9种提取方法的TIC图，结果显示：不同提取溶剂轮廓差异较大，如溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ、溶剂Ⅲ各有3个样本，同一溶剂组内比较相似，不同溶剂组间差异较大。在3～9min，偏大极性、中高极性组分在三组提取溶剂之间都有差别，溶剂Ⅲ（乙腈0.1%FA）出现的峰明显最少（如图2中左侧框所示），偏大极性的化合物溶出偏少；混合溶剂Ⅱ（甲醇：氯仿：水5:2:20.1%FA）出现的峰的数量最多（如图2中中间框所示），有效富集了此类成分；而75%甲醇其次。对于10～18min，中低极性的化合物三溶剂组差别不大，甲醇和混合溶剂较多，乙腈最少，但是较其它高、中高极性组分而言，乙腈相对更容易提取极性偏低的化合物。在19～28min之间主要是低极性化合物，就峰形及数量而言，甲醇典型峰数量最多、效果最好（如图2中右侧框所示），乙腈其次，混合溶剂峰形质量最差。由此可见，甲醇有较好的浸出能力，溶解性兼容性强，适合比较宽广的极性范围，因此大多数代谢组学和其它分析都使用甲醇作为提取溶剂，乙腈对对极性偏低的化合物较好，而混合溶剂因为有萃取分相的步骤，对大极性、中高极性代谢物有富集作用，相对而言低级性化合物偏少。通过对提取效果指标（峰的数量、高度、峰形）分析，因素作用的主次顺序为A>B>D>C，即提取溶剂成分对于代谢物提取影响最大，其次是提取方式和提取温度，最后是提取时间。通过分析比较不同提取溶剂组内及组间不同提取方法的效果得出：因素A2即混合溶剂Ⅱ（甲醇：氯仿：水5:2:20.1%FA）的提取峰数量最多，但保留时间后期色谱总离子流图峰形波动大、不规则，不利于物质的分离鉴定与定量分析；因素A1溶剂Ⅰ（75%甲醇0.1%FA）较A2提取峰数量稍少，但峰形规则；因素A3（乙腈0.1%FA）峰最少；另外，采用超声提取的效果稍好，在本试验所选温度及时间范围内，提取温度及提取时间对最终效果影响差异不明显。

因此，结合代谢物温度稳定性、节省时间及溶剂与液相色谱体系兼容性等因素的考虑，确立最适提取方法为A1B1C2D2即：以75%甲醇（0.1%FA）作为提取溶剂，采用超声提取，25℃提取40min，提取效果好。

4、色谱梯度洗脱程序参数进一步优化及方法重复性考查

采用上述样品代谢物的最佳提取方法（以75%甲醇（0.1%FA）作为提取溶剂，采用超声提取，25℃提取40min），对色谱梯度洗脱程序参数进一步优化如表1-4，平行提取6份稻瘟病菌Guy11菌丝样品进样分析，每份样品的TIC图及6份样品TIC图叠加效果见图3，样品检测时间短，色谱图峰形质量好；6份平行样品在出峰时间、出峰数量、峰高等方面几乎完全一样，试验结果证明该方法简单快速、稳定可靠、重复性好。

表1-4优化后的色谱梯度洗脱程序参数

时间（min）	流速(mL/min)	流动相B(%)
			2	0.4	10
5	0.4	40
			10	0.4	50
16	0.4	68
			23	0.4	85
25	0.4	90
			27	0.4	100
31	0.4	100
			32	0.4	5

实施例2、将实施例1中的稻瘟病菌菌株Guy11菌丝改成稻瘟病菌菌株2539菌丝，其余按照实施例1所述的最佳方法进行。即，按照以75%甲醇（0.1%FA）作为提取溶剂，采用超声提取，25℃提取40min。色谱梯度洗脱程序参数如表1-4所示。

稻瘟病菌菌株2539菌丝样品的TIC图见图4，样品的色谱图峰形质量好，样品间在出峰时间、出峰数量、峰高等方面与与稻瘟病菌野生型Guy11的TIC图类似，表明本发明的方法在稻瘟病菌通用菌株以及其它稻瘟病菌的不同菌株间有很好的适用性。

实施例3、将实施例1中的稻瘟病菌Guy11菌丝改成稻瘟病菌突变体ΔATG1（专利公开号CN1995353中有相应告知）菌丝，其余按照实施例1所述的最佳方法进行。

所得结果具体如下：

每份稻瘟病菌突变体ΔATG1菌丝样品的TIC图见图5，与稻瘟病菌野生型Guy11的TIC图类似，6份平行样品的色谱图峰形质量好，样品间在出峰时间、出峰数量、峰高等方面几乎完全一致，试验结果证明该方法稳定可靠、适用性强。另外，通过该法获得的差异色谱峰（差异代谢物）的比较分析，发现突变体ΔATG1与野生型Guy11相比，总体上峰的数量和对应峰的峰高均有明显的下降，明确了基因缺失对于真菌代谢物的影响，从而证明了该法进行不同遗传背景来源稻瘟病菌菌株（如野生型和突变体）比较代谢组学研究的可行性。

备注说明：

所用稻瘟病菌菌株名称为Guy11，为野生型菌株，该菌株为国际上水稻稻瘟病菌研究的通用菌株，自身通用性强；

ΔATG1为通过对野生型菌株Guy11的细胞自噬基因ATG1进行基因敲除获得的基因缺失突变体；在专利公开号CN1995353中有相应告知。

突变体ΔATG1用该优化方法进行测定的结果，TIC图谱见图5，进一步验证该方法的适用性。

实施例4、

将实施例1中的稻瘟病菌Guy11菌丝改成稻瘟病菌Guy11分生孢子，其余按照实施例1所述的最佳方法进行。

所得结果具体如下：

每份稻瘟病菌Guy11分生孢子样品的TIC图见图6，5份平行样品的色谱图峰形质量好，样品间在出峰时间、出峰数量、峰高等方面几乎完全一致。试验结果表明该法不仅适用于稻瘟病菌菌丝材料，而且对于其分生孢子这种特殊无性生殖细胞样品材料代谢物的检测同样可得到好的效果，达到检测分析的目的，再次证明该方法稳定可靠、通用性强。

备注说明：分生孢子是真菌在繁殖期产生的用于繁殖传播的特殊细胞，与菌丝相比，具有孢子个体体积微小、难定量、细胞壁厚、不易破碎、内容物少等特点。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法，其特征是：包括稻瘟病菌菌丝样品的培养、过滤收集、液氮灭活处理、冷冻干燥；

所述稻瘟病菌菌丝样品的培养为：将稻瘟病菌的菌丝组织于CM液体培养基中黑暗摇菌培养3～4d，培养温度为25.5～26.5℃，转速为100～200rpm；得菌丝培养物；

所述过滤收集为：将菌丝培养物通过抽滤装置收集到干净的滤纸上并抽沥干；

所述液氮灭活处理为：将附有菌丝的滤纸取出折成小纸包，投入到液氮中速冻3～5min；

所述冷冻干燥为：将经灭活处理后的菌丝小包于-35～-45℃的低温下真空冷冻2～3天；从而确保菌丝组织的含水率≤3%；冻干后的菌丝块于-70℃冷藏作为样品备用。

2.根据权利要求1所述的基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法，其特征是：所述过滤收集为：

先将滤纸铺在布氏漏斗中，用无菌水冲洗一次，然后将菌丝培养物倒入布氏漏斗中的滤纸上，开启真空泵抽滤掉多余培养基，用无菌水冲洗三次并抽沥干。

3.利用如权利要求2所述制备法所得样品进行的检测法，其特征是：将样品依次进行以下步骤：

1）、研磨破碎：

取冻干后的菌丝块进行研磨破碎处理，得菌丝粉末；

2）、溶剂提取：

在19.9～20.1mg的菌丝粉末中加入1.425～1.575mL的提取溶剂，还加入20μL作为内标的浓度为5mg/mL的伞形酮（Umbelliferone）溶液；采用超声提取的方式于24.5～25.5℃提取38～42min；

所述提取溶剂为：在100体积份的体积浓度为75%甲醇中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；

3）、提取完毕后，离心，所得上清过0.22μm的有机相微孔滤膜后进行下述步骤4）；

4）、上机检测：

选用C18色谱柱（2.1×100mm，1.8μm）；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为含0.1%FA的水和含0.1%FA的乙腈，流速0.4mL/min；质谱采用ESI（+）电离方式，质量扫描范围100～1100；

所述含0.1%FA的水为：在100体积份的水中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；

所述含0.1%FA的乙腈为：在100体积份的乙腈中加入0.1体积份的甲酸混合后而得。

4.根据权利要求3所述的检测法，其特征是：

所述步骤4）的上机检测中：

色谱梯度洗脱程序参数中，流动相中乙腈的百分比为2min，10%；5min，40%；10min，50%；16min，68%；23min，85%；25min，90%；27min，100%；31min，100%；32min，5%。

5.利用如权利要求4所述制备法所得样品进行的检测法，其特征是：

所述步骤1）为：取冻干后的菌丝块，放入到液氮预冷过的研钵中，加入液氮，快速研磨至粉末；得菌丝粉末。

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