CN103308642B - 一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，属于分析化学领域。其步骤为：（A）滤膜过滤；（B）固相小柱萃取：利用固相萃取小柱对水样中所含的抗组胺类药物进行富集；（C）溶剂洗脱：利用有机溶剂将目标物从固相萃取柱上洗脱下来；（D）浓缩与定容；（E）上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间谱联用仪对样品进行筛查和鉴定。本发明对水样实现了大规模的筛选排查，通过不同物质的一级和二级质谱谱图的提取分析并与现有的物质库进行比对，再通过软件给出的打分值判定某种物质的存在概率，定性评价综合全面，可以实现传统仪器不能达到的全面筛选非目标性的污染物这一功能。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地说，涉及一种同时快速筛查鉴定污水处理厂废水中抗组胺药物的方法，更具体地说，涉及一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法。
背景技术
随着现代医学的进步和发展，每一年在世界范围内由于预防、治疗人类和动物疾病而生产和消耗了大量的药物。这些药物会通过多种途径进入自然水体和水域。最常见的方式是制药厂附近的工业污水排放和人类及动物机体代谢而导致的生活污水排放。经过相关文献调研，目前已经检测到污水和环境中存在着一定浓度的药物及其代谢产物，虽然其浓度水平比规定的人类及动物的毒性风险浓度要低几个数量级，但是它们对于环境的长期影响仍不容忽视。
抗组胺药作为常见的药物的一大类，具体作用是拮抗组胺对人体的生物效应，进而避免组胺引起的毛细血管扩张及通透性增加、平滑肌痉挛、分泌活动增强而导致的局部充血、水肿、分泌物增多、支气管和消化道平滑肌收缩等临床症状。抗组胺药由于制作容易，价格便宜，给药方便，且对多种变态反应病有效，所以临床用途广泛。
经过大量关于抗组胺药物的文献调研，目前国内外关于其报道大部分是对于其体内和体外的药理学作用的研究探索；而有关于环境介质中的此类药物的浓度检测及存在水平的报道仍十分有限，尤其是水体中的抗组胺药物的检测仍停留在对于该类药物中某种确定化合物的液质联用的定量检测阶段，针对该一大类物质的定性筛查尚没有报道。但是随着污染物质复杂性的增加，一种能够进行非目标性的污染物的快速而全面的筛查和鉴定方法逐渐凸显出其重要意义。
中国专利号为200610018647.2，公开日2006年11月08日，公开了一份名称为一种动物可食性组织中磺胺类药物残留筛选方法及其试剂盒的专利文件，该发明属于农产品残留抗菌素检测技术领域，具体地，该发明涉及一种利用微生物学方法，检测动物可食性组织中磺胺类药物残留的方法及其试剂盒。其方法包括：制备培养基I和培养基II，用巨大芽孢杆菌作工作菌液，新霉素纸片作质控用的抗菌素纸片，甲氧苄啶作增效用的补充液，将培养基I和培养基II联用，用棉拭子粘取待测动物组织样品，并向棉拭子上滴少许甲氧苄啶补充液，然后将其与所述的培养基接触培养。根据棉拭子周围出现抑菌圈的有无判定检测结果。该发明 还公开了应用上述方法的专用试剂盒。但是该方法不适合环境介质中的抗组胺药物的浓度检测。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有技术针对环境介质中的抗组胺药物的浓度检测的问题，本发明提供一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其能够在单独的一次分析测定中对水样中的未知化合物的一级和二级质谱分别进行快速连续的扫描和筛查方法，并且通过不同物质的一级和二级质谱谱图的提取分析并与现有的物质库进行比对，再通过软件给出的打分值判定某种物质的存在概率，定性评价综合全面，可以实现传统仪器不能达到的全面筛选非目标性的污染物这一功能。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其步骤为：
（A）滤膜过滤：水样经过玻璃真空过滤器分别通过两层滤膜；
（B）固相小柱萃取：利用固相萃取小柱对水样中所含的抗组胺类药物进行富集；
（C）溶剂洗脱：利用有机溶剂将目标物从固相萃取柱上洗脱下来；
（D）浓缩与定容：对洗脱液进行浓缩，溶剂替换、定容，过膜后保存；
（E）上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间谱联用仪对样品进行筛查和鉴定，
高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：
高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；
色谱柱：Waters BEH C18柱，尺寸为2.1mm×100mm，2.5μm；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
梯度洗脱流动相：A：加入甲酸的水，B：加入甲酸的甲醇；甲酸的添加体积为甲醇或水的体积的0.1%；
流动相梯度：
| 时间/min | A% | B% |
| 0 | 90 | 10 |
| 14 | 10 | 90 |
| 24 | 10 | 90 |
| 28 | 90 | 10 |
| 30 | 90 | 10 |
质谱仪：Triple TOF5600-AB SCIEX；
离子源：ESI；
电离模式：正离子模式；
MS扫描范围：100-1000m/z；
MS-MS扫描范围：50-800m/z；
离子源气压：55psi；
驱簇电压：80V；
碰撞能量：35±15eV。
最后的筛查和鉴定是利用仪器自带的compound数据库进行排查和筛选，检查是否含有生物抗组胺类药物的存在。
进一步地，所述的步骤（A）中所用两层滤膜分别是1um的玻璃纤维滤膜和0.45um的尼龙滤膜。
进一步地，所述的步骤（B）中固相萃取小柱为Oasis HLB的C18小柱，使用前分别用质量比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂以及去离子水加以活化；富集过程中流速保持为5mL/min，整个过程保持小柱湿润。
进一步地，所述的步骤（C）中的有机溶剂是质量比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，洗脱2次。
进一步地，所述的步骤（D）中对洗脱液进行浓缩是用旋转蒸发仪浓缩，再用N2缓缓吹扫溶剂；所述的定容是用甲醇定容；所述的过膜是采用PTFE滤膜。
更进一步地，所述的步骤（E）中的数据分析采用Peakview软件的XIC manager对样品中的分子式，保留时间，一级质谱质荷比，同位素以及二级质谱库匹配分数信息进行采集，可以通过最后的得分大于90分来基本判定抗组胺类药物的存在。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
（1）本发明建立了滤膜过膜与固相萃取串联的前处理方法，利用高效液相色谱-飞行时间质谱联用的仪器检测并配合peakview综合评价打分的软件分析方法对水样实现了大规模的筛选排查，在一级质谱和二级质谱的模式下分别进行扫描，分辨率高，准确度高，并通过二 级质谱的谱图峰形与化合物物质库进行匹配，定性优势明显，purity score的结果呈现方式简洁直观，结果更加准确可信；
（2）本发明前处理简单，操作易行，并且所选用的仪器测量的分辨率好，准确性高，并且可以利用该仪器的IDA（information dependent acquisition）手段来对化合物进行一级质谱全扫之后的二级质谱扫描，从而增强该方法的灵敏度和可信度，数据分析与处理的结果呈现简单明了，定性评价综合全面，可以实现传统仪器不能达到的全面筛选非目标性的污染物这一功能；
（3）本发明是一种能够在单独的一次分析测定中对水样中的未知化合物的一级和二级质谱分别进行快速连续的扫描和筛查方法；
（4）本发明高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；色谱柱：Waters BEH C18柱，尺寸为2.1mm×100mm，2.5μm；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；梯度洗脱流动相：A：加入甲酸的水，B：加入甲酸的甲醇；甲酸的添加体积为甲醇或水的体积的0.1%；质谱仪：Triple TOF5600-AB SCIEX；离子源：ESI；电离模式：正离子模式；MS扫描范围：100-1000m/z；MS-MS扫描范围：50-800m/z；离子源气压：55psi；驱簇电压：80V；碰撞能量：35±15eV，取这个条件，检测的速度最快，准确度最高。
附图说明
图1为实施例1中的样品一级和二级质谱图；
图2为物质Mequitazine的XIC鉴定图示；
图3物质Oxomemazine的XIC鉴定图示；
图4物质Levocabastine的XIC鉴定图示；
图5实施例2中的样品一级和二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其步骤为：
（A）滤膜过滤：取1L采集来的养殖场附近污水处理厂的一级出水经过玻璃真空过滤器分别通过两层滤膜；两层滤膜分别是1um的玻璃纤维滤膜和0.45um的尼龙滤膜。
（B）固相小柱萃取：利用固相萃取小柱对水样中所含的抗组胺类药物进行富集；固相萃取小柱为Oasis HLB的C18小柱，使用前分别用质量比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂以及去离子水加以活化；富集过程中流速保持为5mL/min，整个过程保持小柱湿润。
（C）溶剂洗脱：利用有机溶剂将目标物从固相萃取柱上洗脱下来；有机溶剂是质量比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，洗脱2次，2次洗脱液收集在同一收集瓶中。
（D）浓缩与定容：对洗脱液进行浓缩，溶剂替换、定容，过膜后保存；洗脱液进行浓缩是用旋转蒸发仪浓缩，再用N2缓缓吹扫溶剂；定容是用甲醇定容；所述的过膜是采用PTFE滤膜，利用旋转蒸发仪将洗脱液体积降低至1mL以下，清洗转移后用高纯氮慢慢吹至近干，将溶剂替换成甲醇，经过PTFE针头过滤器过滤后最终定容到1.0mL转移到进样小瓶中，保存在-20℃冰箱中待测。
（E）上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间谱联用仪对样品进行筛查和鉴定，
高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：
高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；
色谱柱：Waters BEH C18柱，尺寸为2.1mm×100mm，2.5μm；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
梯度洗脱流动相：A：加入甲酸的水，B：加入甲酸的甲醇；甲酸的添加体积为甲醇或水的体积的0.1%；
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| 14 | 10 | 90 |
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离子源气压：55psi；
驱簇电压：80V；
碰撞能量：35±15eV。
最后的筛查和鉴定是利用仪器自带的compound数据库进行排查和筛选，检查是否含有生物抗组胺类药物的存在。
步骤（E）中的数据分析采用Peakview软件的XIC manager对样品中的分子式，保留时间，一级质谱质荷比，同位素以及二级质谱库匹配分数信息进行采集，可以通过最后的得分大于90分来基本判定抗组胺类药物的存在。实验结果如图1、图2、图3和图4所示。
由Peakview软件的XIC manager将样品中的保留时间，一级质谱质荷比，同位素以及二级质谱库匹配分数（purity score）等信息列于一张表格中，筛查和鉴定是利用仪器自带的compound数据库进行排查和筛选；为保证物质鉴定的准确性，选择了purity score分数为100分的化合物，与物质库里的化合物进行匹配，筛选其中的抗组胺药物，得到三种药物Mequitazine(美喹他嗪)、Oxomemazine(二氧异丁嗪)和Levocabastine(左卡巴斯汀)。
实施例2
将该污水处理厂的二级出水同实施例1进行样品处理，同样进行类似的仪器测量与数据分析，实验结果如图5所示，得到与一级出水水样中相同的三种抗组胺药物Mequitazine（美喹他嗪）、Oxomemazine（二氧异丁嗪）和Levocabastine（左卡巴斯汀）。
以上两个实例可以说明养殖场的废水中的确存在着抗组胺类药物，并且污水处理厂现有的处理流程不能去除此类药物。
Claims (4)
1.一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其步骤为：
(A)滤膜过滤：水样经过玻璃真空过滤器分别通过两层滤膜；
(B)固相小柱萃取：利用固相萃取小柱对水样中所含的抗组胺类药物进行富集，固相萃取小柱为OasisHLB的C18小柱，使用前分别用质量比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂以及去离子水加以活化；富集过程中流速保持为5mL/min，整个过程保持小柱湿润；
(C)溶剂洗脱：利用有机溶剂将目标物从固相萃取柱上洗脱下来；
(D)浓缩与定容：对洗脱液进行浓缩，溶剂替换、定容，过膜后保存；
(E)上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间谱联用仪对样品进行筛查和鉴定，
高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：
高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；
色谱柱：WatersBEHC18柱，尺寸为2.1mm×100mm，2.5μm；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
梯度洗脱流动相：A：加入甲酸的水，B：加入甲酸的甲醇；甲酸的添加体积为甲醇或水的体积的0.1％；
流动相梯度：
质谱仪：TripleTOF5600-ABSCIEX；
离子源：ESI；
电离模式：正离子模式；
MS扫描范围：100-1000m/z；
MS-MS扫描范围：50-800m/z；
离子源气压：55psi；
驱簇电压：80V；
碰撞能量：35±15eV；
最后的筛查和鉴定是利用仪器自带的compound数据库进行排查和筛选，检查是否含有生物抗组胺类药物的存在，数据分析采用Peakview软件的XICmanager对样品中的分子式，保留时间，一级质谱质荷比，同位素以及二级质谱库匹配分数信息进行采集，可以通过最后的得分大于90分来基本判定抗组胺类药物的存在。
2.根据权利要求1所述的一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其特征在于：所述的步骤(A)中所用两层滤膜分别是1um的玻璃纤维滤膜和0.45um的尼龙滤膜。
3.根据权利要求1所述的一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其特征在于：所述的步骤(C)中的有机溶剂是质量比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，洗脱2次。
4.根据权利要求1所述的一种同时快速筛查鉴定水样中抗组胺类药物的高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法，其特征在于：所述的步骤(D)中对洗脱液进行浓缩是用旋转蒸发仪浓缩，再用N2缓缓吹扫溶剂；所述的定容是用甲醇定容；所述的过膜是采用PTFE滤膜。
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