CN104792914A - 一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用，利用平面色谱法对中药和天然产物等成分复杂的混合物组分具有分离、原位记载和可视定位的特点，采用阵列映射的方法建立起平面色谱斑点与微孔板试验孔之间的关联关系，并依此阵列映射关联关系将被分离的色谱斑点整体地洗脱并转移到对应的微孔板试验孔上进行各种活性实验和分析检测。本发明既保留了平面色谱的特性、又将色谱分离出的组分从平面色谱的分离介质中释放出来，避免了色谱分离介质对后续的生物活性实验等带来的可能干扰或妨碍，可在同一个平台上对色谱分离、生物活性检测和化合物分析检测的关联探索和综合研究，实现了在活性指导下对中药和天然产物等成分复杂的混合物中的活性组分的检测和筛选。本发明具有微量、快速、简捷、直观和经济的特点，并极大地减少了有机溶剂使用。

Description

一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用

技术领域

本发明属于药物分析和生物检验技术领域，具体涉及一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用，该实验方法是一种从中药等中药及天然产物复杂组分中中快速分离、活性评价和分析鉴定的一体化方法，用于中药及天然产物复杂组分中中活性组分的初步筛选及其活性检验。

背景技术

天然产物是潜在的药用资源化合物库，人类致力于从中筛选、研究和开发新药的努力从来没有间断过。目前常规的方法大都采用植化方法以有机溶剂对天然产物进行系统分离，对每个分离出的组分进行浓缩或分取，再转入微孔板中进行活性检测，对于组分复杂、含量差异巨大的天然产物来说，无异于竭泽而渔，耗时耗力。因此，在活性指导下的天然产物中活性成分的筛选对天然药用资源的研究与开发意义重大。

现阶段，国内外针对天然产物中活性化合物的快速筛选的前沿方法多采用流动色谱分离方法、如逆流色谱、液相色谱，将载有色谱分离组分的色谱流动相与微量活性试验方法（如MTT、ELISA以及免疫荧光试验等）结合进行活性评价，从中筛选出活性成分。这些分离筛选方法，相对于常规的植化方法有一定的进步，但是依然面对很多问题。

对于逆流色谱、液相色谱等流动色谱分离方法来说，考虑到分离方法对不同结构特性物质的适应性、不同检测方法及其检测条件对不同结构特性物质的选择性与灵敏度、以及收集的组分的体积和浓度，对于组分结构复杂、含量差异巨大的天然产物来说，要分离出每一个组分、识别每个色谱峰、实现每个峰的切割和收集，难度很大，即使大部分实现也会带来巨大的工作量和耗费。

而平面色谱法（Plane Chromatography）因可在色谱图上进行原位反应而独具特色，是一种可集分离、鉴定和活性检测于一体的分析方法。免疫印迹技术通过电泳与免疫反应结合进行活性大分子的分析与检测，已经发展成蛋白质、核酸等生物活性大分子研究不可缺少的工具。薄层色谱（TLC）生物自显影方法也在生物活性分子筛选中得到应用[E.G. Bjørseth A, Gether J, Landmark L, Møller M, Detection of mutagens in complex samples by the salmonella assay applied directly on thin-layer chromatography plates, Science. 215 (1982) 87-89.]，但由于薄层色谱的分离介质会给后续的生物活性反应带来干扰或妨碍而受到一定限制。如何保留平面色谱的分离特性、去除分离介质而又能方便地对分离出的成分进行生物活性实验，成了TLC与生物活性反应结合的关键。

免疫印迹技术采用亲电的硝基膜转移生物大分子在这方面取得了满意的结果[I.M. Choma, E.M. Grzelak, Bioautography detection in thin-layer chromatography, Journal of Chromatography A. 1218 (2011) 2684-2691.]，但TLC生物自显影方法却碰到了许多困难：TLC色谱组分大多水溶性差，化合物不易进入水溶性培养基介质，难以进行抑菌或抗菌实验 [A. Marston, Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry, Journal of Chromatography A. 1218 (2011)2676-2683.]；TLC分离介质（如硅胶、氧化铝或纤维素等）干扰或妨碍生物活性反应，会带来大量的背景和噪音，降低检测的灵敏度和选择性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法。

本发明的另一个目的是提供平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法的应用，特别是在中药及天然产物复杂组分中活性组分的检测和筛选中的应用。

本发明利用平面色谱法对中药及天然产物复杂组分中等混合物中的组分具有分离、原位记载和可视定位的特点，采用阵列映射的方法建立起平面色谱斑点与微孔板试验孔之间的关联关系，并依此阵列映射关联关系将被分离的色谱斑点整体地洗脱并转移到对应的微孔板试验孔上进行多种活性实验。该方法既保留了平面色谱的特性、又将色谱分离出的组分从平面色谱的分离介质中释放出来，避免了分离介质对后续的生物活性实验等带来的可能干扰或妨碍，将色谱分离、活性反应和化合物追踪检测关联起来，使色谱分离、活性反应和分析检测既可独立操作又可作为一个整体进行观察、研究和关联分析，可实现活性指导下的中药及天然产物复杂组分中活性成分的快速筛选、以及对复杂组分生物活性的现场检验。本发明对中药及天然产物复杂组分中活性成分的检测和筛选具有微量、快速、简捷、直观和经济的特点，并极大地减少了有机溶剂使用。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，包括以下步骤：

S1. 配制样品溶液并进行薄层色谱分析；

S2. 薄层色谱显色及色谱参数采集；

S3. 薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系的确定；

S4. 依照薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，将色谱斑点洗脱与转移至微孔板相应的实验孔里，得到微孔板样本；

S5. 重复步骤S1和S4，平行制备多个微孔板样本；

S6. 采用平行微孔板样本对相应的各色谱斑点组分进行生物活性实验以及必要的化学分析；

S7. 依据薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，对显示出生物活性的色谱斑点组分的化学成分进行追踪分析，对其生物特性、化学成分、含量以及结构信息进行对比研究和关联分析，探索其量-效和构-效关系，初步筛选出活性成分。

本发明步骤S1配置样品溶液并进行薄层色谱分析为本领域常规技术，将天然产物提取物、中药提取物或含有多种化学成分的混合物样品配制成待测溶液，选择合适的薄层色谱固定相和色谱流动相进行一维或二维薄层色谱分析。

本发明先基于一维薄层色谱与微孔板之间的阵列映射关系，初步评价各薄层色谱条带组分对应的生物活性，考察活性实验的平行性、样品的上样量以及生物活性组分的分布情况。在此实验基础上，再基于二维薄层色谱与微孔板阵列映射关系，在活性指导下作进一步的分离、活性检测和活性成分筛选。

所述薄层色谱分析使用的薄层色谱板的载体为玻璃、塑料、金属薄膜或纸。

本发明步骤S2薄层色谱显色及色谱参数采集采用本领域常规技术，作为一种具体的实施方案，所述薄层色谱显色的方法包括喷洒显色试剂显色、碘熏显影显色或在紫外光下观察成像并作标记，所述色谱参数包括色谱斑点的Rf值和峰面积，可用作色谱鉴别和半定量分析。

具体地，所述薄层色谱显色可以利用常规方法下观察到的色谱斑点与薄层色谱载体中含有的成分相互作用产生的特定颜色（如硅胶GF254薄层板在254nm光下检视到的色谱斑点），或利用常规方法已知的显色剂及其相应方法对色谱斑点进行原位反应产生的颜色特点（如以硫酸-香草醛的乙醇溶液为显色剂喷洒在硅胶薄层板上、经约105℃加热产生的色谱斑点）。

本发明将所述微孔板是以多个小池（试验孔）作为实验小试管排列成的阵列；建立起薄层色谱中各个色谱斑点与微孔板阵列映射关联关系，并依此关系将色谱斑点洗脱转移至相应的微孔板实验孔中，可得到含有色谱斑点并保留薄层色谱特征的微孔板样本；这些微孔板样本可用于ELISA、MTT检测和DNA筛选或细菌培养等实验室分析研究和临床诊断检测。

步骤S4中所述的洗脱与转移可以根据本领域常规技术选择任一种方式，只要能将薄层色谱上的色谱斑点按照薄层色谱中各个色谱斑点与微孔板阵列映射关系洗脱并转移至微孔板中相应试验孔中即可。作为一种优选方案，所述洗脱转移的具体步骤如下：

S41. 将洗脱液加入到微孔板中，然后覆盖网格封口膜；按照薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，将薄层色谱板上的斑点尽可能地对应于微孔板的试验孔、并覆盖于网格封口膜上；加压使薄层色谱板与微孔板形成阵列化的密闭小室复合夹层；

S42. 将复合夹层垂直翻转180°、停留10秒后返回，再停留10秒后重复翻转操作，如此重复操作至薄层色谱斑点洗脱并转移到微孔板的板孔中；

S43. 挥发掉微孔板试验孔内的溶剂，得到含有色谱斑点并保留薄层色谱特征的微孔板样本，根据实验需要平行制备足够数量的微孔板样本。

本发明通过建立薄层色谱图上所有色谱斑点与微孔板上二维排列的试验孔阵列之间的映射关系，将薄层色谱斑点洗脱并转移到微孔板相应的试验孔中，使微孔板上的色谱斑点阵列最大程度地反映薄层色谱图的特征，这就要求微孔板上试验孔的大小、形状和排列与色谱斑点的大小、形状和分布区域相匹配。

优选地，所述微孔板可以选择常规的96孔板、384孔板或1536孔板，在这三个规格的微孔板中，与直径通常为1~4 mm薄层色谱斑点更匹配的是384孔微孔板（横24孔×竖16孔）。

优选地，所述微孔板的孔形为方形。方孔微孔板比圆孔微孔板开孔面积更大，更有利于薄层色谱斑点的洗脱和转移，使微孔板上的色谱斑阵列最大程度地反映薄层色谱图的特征。

本发明所述网格封口膜上的网格与微孔板的孔形相匹配，网格封口膜叠在微孔板试验孔边缘与薄层色谱板之间，加压下薄层色谱板与微孔板可形成阵列化的密闭小室。优选地，所述网格封口膜为硅胶材质。

本发明步骤S6所述生物活性实验采用常规方法，具体为取一份或多份平行微孔板样本进行生物活性实验，评价各个色谱洗脱组分的生物活性，对显示出生物活性的板孔，按照薄层色谱色谱斑点与微孔板阵列映射关系定位，对另一平行微孔板样本中相应试验孔内的色谱斑点组分进行化学成分追踪分析。

所述平行微孔板样本的生物活性检测包括生物活性检测或自由基清除活性检测等常规活性检测。

所述生物活性检测包括ELISA、MTT检测、DNA筛选或细菌培养等。

所述化学成分追踪分析包括液相色谱分析、质谱分析或液相色谱-质谱联用分析等分析化学检测，测得受试板孔内色谱组分的组成、含量以及分子量、化学结构、紫外光谱等化学特性。

采用本发明提供的方法，将薄层色谱上的色谱斑点整体地洗脱并转移到对应的微孔板试验孔上进行各种活性实验，既可以保留薄层色谱分离效果，又可避免薄层色谱分离介质对后续的活性实验干扰或妨碍，如：平面色谱分离介质对细胞贴壁、细胞生长的干扰；平面色谱分离介质对蛋白、DNA和多糖的活性影响；平面色谱分离介质对培养基组分、参与反应组分以及污染物的吸附妨碍实验程序的进行，降低反应灵敏度和选择性，增加检测背景值和噪声等。

本发明对复杂样品色谱组分的化学、生物特性以及它们的结构与含量信息的观察与实验是在同一个研究平台并列与关联地进行的，可以及时进行相关分析和综合研究，迅速聚焦到复杂样品中的活性组分，实现在活性指导下对中药及天然产物等复杂组分中的活性成分的检测和筛选。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）既保留了平面色谱的特性、又将色谱分离出的组分从平面色谱的分离介质中释放出来，避免了分离介质对后续的生物活性实验造成干扰或妨碍。

（2）将色谱分离、活性反应和化合物追踪检测关联起来，使色谱分离、活性反应和分析检测既可独立操作又可作为一个整体进行观察、研究和关联分析，寻找活性组分的量-效和构-效等内在关系，评价各色谱组分性能，筛选其中的活性成分，实现在活性指导下对中药及天然产物等复杂组分中的活性成分的快速筛选、以及复杂组分生物活性的现场检验，尤其适用于中药多组分、多靶点、多通道协同作用的研究。

（3）本发明对中药及天然产物复杂组分中活性组分的检测和筛选具有微量、快速、简捷、直观和经济的特点，并极大地减少了有机溶剂使用。

附图说明

图1为实验流程示意图。

图2为一维薄层色谱结果，其中a为一维薄层色谱图，b为一维薄层色谱图色谱斑点与MTT实验微孔板阵列对应关系图，c为一维薄层色谱斑点与细胞培养板孔OD值的对应关系图。

图3为一维薄层色谱条带对应洗脱组分的细胞生存率结果图。

图4为二维薄层色谱结果，其中a为二维薄层色谱图，b为二维薄层色谱图色谱斑点与MTT实验微孔板阵列对应关系图，c为二维薄层色谱斑点与细胞培养板孔OD值的对应关系图。

图5为二维薄层色谱条带对应洗脱组分的细胞生存率结果图。

图6为MTT实验微孔板I18和L16板孔对应二维薄层色谱位置关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例 1

本实施例采用薄层色谱对高良姜提取物进行色谱分离，建立色谱斑点与384孔方口微孔板试验孔之间的阵列映射关系，将色谱斑点洗脱并转移至384孔微孔板的对应的试验孔里，以MTT法评价色谱斑点组分对PC12细胞损伤的保护作用，再以Post LC-MS（流动注射-液相色谱-质谱联用）对显示出活性的试验孔中的色谱成分进行分析检测。本实施例将TLC薄层色谱分离、MTT细胞生存率试验和Post LC-MS通过阵列关联的方法结合起来，实现了活性指导下高良姜提取物中活性组分的快速筛选。

实验流程示意图如图1所示，具体实验步骤及检测步骤如下：

（1）配置样品（高良姜提取物）溶液

高良姜生药材采集于广东徐闻龙塘镇八角村，人工种植3年以上。高良姜干燥根茎粉碎后，采用98%食用级乙醇提取3次，合并提取液，制备浓缩浸膏。浓缩浸膏制成5 mg/ml的高良姜提取物甲醇溶液。

（2）薄层色谱分析

一维薄层色谱分析（1D-TLC）：取高良姜提取物甲醇溶液进行薄层层析，在硅胶板上（Merck GF254）进行条带点板（7.5cm×2mm），点样量16µl；以乙酸乙酯∶石油醚II∶乙酸=3∶7∶0.2展开，展距8.2 cm。

二维薄层色谱分析（2D-TLC）：取相同高良姜提取物甲醇溶液和硅胶板，点样量为2µl，控制斑点直径小于2mm，以展开剂A（氯仿∶甲醇∶石油醚Ⅱ=7.76∶0.24∶2）和展开剂B（乙酸乙酯∶石油醚II∶乙酸=3：7：0.2）先后展开，得到8.2 cm×8.2 cm的2D薄层色谱。根据实验需要平行制备多块薄层色谱板。

（3）薄层色谱显色

将薄层板用1%香草醛-10%硫酸乙醇溶液喷雾，在105℃下加热约7min显色，即时于可见光下拍摄成像。采用Qscan Demo软件采集色谱参数、确定各斑点在色谱图上的相对位置，测定色谱斑点的Rf值和峰面积，用作半定量分析。

平行制备的其它薄层板置于紫外分析仪在254nm波长紫外光下检视和拍照、并与硫酸-香草醛试剂显色的薄层板对照，确定两种检视方法各色谱斑点的相应位置、并在薄层板背面作标记。

（4）薄层色谱阵列定位与洗脱转移

以含有0.5% DMSO和2%甘油的甲醇溶液作为色谱斑点洗脱液。以384孔方口微孔板进行MTT实验。

将洗脱液（60µL/孔）加入到微孔板中，然后覆盖硅胶网格封口膜；在254nm紫外光检视下将薄层色谱板上的斑点尽可能地对应于微孔板的试验孔、并覆盖于硅胶封口膜上。加压使薄层色谱板与细胞培养板形成阵列化的密闭小室复合夹层。在密闭情况下，复合夹层垂直翻转180º、停留10s后返回，停留10s后再重复操作，如此重复操作8次，使洗脱液与薄层色谱充分接触和分离，将薄层色谱斑点洗脱并转移到对应的板孔中。挥发掉微孔板中的甲醇，得到含有薄层色谱斑点并保留博层色谱图特点的在微孔板样本。制备足够的平行微孔板样本，分别用于MTT活性检测和Post LC-MS分析检测。

（5）MTT细胞生存率实验

设正常组、H₂O₂模型组、总提取物组和薄层色谱斑点组，每组设6个复孔。将浓度为5.0×10⁴/ml的 PC12细胞（培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中）接种于384孔板，每孔50μl，培养24h至细胞贴壁。总提取物组加入高良姜提取物（12.5μg/ml，培养基配制）50μl /孔，薄层分离药物组为薄层色谱阵列以50μl/孔培养基溶解后对应转入，各组均加有相同的试剂空白（0.5% DMSO和2%甘油），培养24h。然后，除正常组外，各组加IC50预选浓度的H₂O₂，作用4h后每孔再加入10μl的5mg·mL^-1 MTT溶液，继续培养4h。吸弃各培养孔内液体，每孔加入75μl DMSO，振荡10min，于微孔板分光光度计570nm波长处测量吸光度OD值。按下式计算各组细胞生存率，以其评价试样的抗氧化活性。

生存率=（处理组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）×100%。

（5）Post LC-MS分析质谱

检测器采用ESI电离源，电极电压-4.0kV、温度250℃，检测器电压1.7 kV，喷雾氮气流速4.5L·min^-1；采用负离子扫描方式，质量范围m/z50~800，扫描间隔1s。对薄层色谱阵列中显示出生物活性的试验孔进行检测，以流动注射方式（Infusion）获得样本的质谱图。

（6）TLC色谱斑点洗脱率分析

对相同点样量的同一高良姜乙醇提取物样品进行洗脱对比试验，洗脱组和对照组（不洗脱）均设置6个平行斑点，洗脱组按照上述方法步骤（4）进行洗脱。得到的洗脱组的洗脱液与对照组进行平行点样，以一维薄层层析展开，观察和比较不同Rf值斑点的洗脱效果。采用QScanDemo软件采集和处理各薄层色谱斑点Rf值和峰面积，计算洗脱组平行样的标准偏差，并与相同Rf值的对照组比较，计算洗脱率。结果如表1所示，从表1中可以看出，不同Rf值物质洗脱率依序为76.8 %、76.3 %、61.7%、71.9 %、75.0 %、74.2 %。比较洗脱组和对照组的斑点总面积，总洗脱率为71.2 %。

表1薄层色谱斑点洗脱回收率

Rf	对照组峰面积S1（mean±SD，n=6）	洗脱组峰面积S2（mean±SD，n=6）	洗脱率（S1/S2×100 %）
				0.86	1069.02±167.49	820.98±75.32	76.8 %
0.79	1138.04±189.92	868.06±108.53	76.3 %
				0.56	3434.91±244.97	2120.23±314.21	61.7%
0.52	3574.11±291.68	2569.93±523.34	71.9 %
				0.47	2767.40±249.31	2075.42±326.64	75.0 %
0.31	2737.61±247.60	2031.67±295.10	74.2 %
				Total	14721.08±1052.50	10486.30±1559.60	71.2 %

（7）基于一维TLC-MTT实验阵列映射关系评价各薄层色谱条带组分的生物活性

高良姜提取物的一维薄层色谱色谱棒镜像分割为两块。一块用1%香草醛-10%硫酸乙醇显色，得到一维薄层色谱图如图2a所示，以其设计薄层色谱条带与384细胞培养孔板对应阵列，得到一维薄层色谱图色谱条带与MTT实验微孔板阵列映射关系图，如图2b所示。另一块依照色谱图色谱条带与MTT实验微孔板阵列映射关系，按上述方法进行色谱斑点洗脱和转移到微孔板相应的试验孔里进行MTT细胞生存率实验。得到一维薄层色谱斑点与细胞培养板孔OD值的对应关系图如图2c所示。

MTT细胞生存率实验结果如表2及图3所示。A→P共16组为对应的细胞培养板的16行板孔，同一行对应于同一色谱条带。采用SPSS 22对数据进行统计分析，结果表明：与正常组相比，H₂O₂组细胞生存能力明显降低（P<0.05）；与H₂O₂组相比，I、J、L和M组均能显著抑制氧化损伤导致的细胞生存率下降，其中I组提高细胞生存率约20%（P<0.05）。统计各组测量值，最大相对标准偏差为15.2 %。

表2 各测试样本的细胞生存率

分组	生存率（mean±SD，n=6）	分组	生存率（mean±SD，n=6）
				正常组	1.000±0.049	H	0.584±0.066
H2O2组	0.549±0.039*	I	0.716±0.062#
				A	0.560±0.045	J	0.632±0.082#
B	0.597±0.068	K	0.441±0.045
				C	0.536±0.062	L	0.605±0.023#
D	0.589±0.056	M	0.633±0.031#
				E	0.509±0.046	N	0.525±0.071
F	0.530±0.074	O	0.562±0.041
				G	0.526±0.083	P	0.524±0.080

与正常组对比^* p< 0.05 ，与 H₂O₂ 组对比^# p< 0.05。

（8）基于二维TLC-MTT实验阵列映射关系评价各薄层色谱斑点组分的生物活性

在1D-TLC-MTT实验的基础上，基于二维TLC-MTT实验阵列映射关系进一步进行分离、活性评价和活性成分筛选。按照上述方法步骤（2），平行制备两块薄层色谱板，一块用1%香草醛-10%硫酸乙醇显色，二维薄层色谱图如图4a所示，以其设计薄层色谱斑点与384细胞培养孔板阵列对应关系，得到二维薄层色谱图色谱斑点与MTT实验微孔板阵列对应关系图如图4b所示，再按上述方法进行色谱斑点洗脱和转移，进行MTT细胞生存率实验，得到二维薄层色谱斑点与细胞培养板孔OD值的对应关系图如图4c所示。

MTT细胞生存率实验结果表明， 微孔板的I18和L16两个板孔洗脱组分的细胞生存率分别为0.737、0.692，与H₂O₂模型组相比能显著提高细胞（P<0.05），二维薄层色谱斑点对应洗脱组分的细胞生存率结果如图5所示。采用Image-Pro Plus 6.0 分别采集I18和L16试验孔对应的TLC二维薄层色谱斑点的面积，以色谱斑点面积作为半定量依据比较二者的量效关系。结果表明，L16号斑点物质的抗氧化损伤活性略强于I18。

（10）Post LC-MS追踪分析与活性成分的归属

MTT细胞生存率实验表明，I18和L16号试验孔具有显著的抗氧化活性。依照TLC-MTT实验阵列映射关系，追踪到I18和L16号试验孔对应的二维薄层色谱上的斑点，MTT实验微孔板I18和L16板孔对应二维薄层色谱位置如图6所示。采用离线LC-MS对平行微孔板样本I18和L16试验孔的色谱斑点组分进行分析检测，结果显示，I18号色谱斑点的质谱峰主要为m/z 269、[M-H]^-；L16号斑点的质谱峰主要为m/z 327、[M-H]^-。参照高良姜的植化研究文献报道[X. Bu, G. Xiao, L. Gu, M. Zhang, Chemical study of Alpiniaofficinarum, Journal of Chinese medicinal materials. 23 (2000) 84-87.]，m/z 269的化合物归属为高良姜素， m/z327的化合物归属为1-苯基-7-( 3′-甲氧基-4′-羟基)-苯基-5-醇-3-庚酮。高良姜素和1-苯基-7-( 3′-甲氧基-4′-羟基)-苯基-5-醇-3-庚酮作为高良姜提取物中具有显著抗氧化活性成分被初步筛选出来。

Claims (10)

1.一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 配制样品溶液并进行薄层色谱分析；

S2. 薄层色谱显色及色谱参数采集；

S3. 薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系的确定；

S4. 依照薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，将色谱斑点洗脱与转移至微孔板相应的实验孔里，得到微孔板样本；

S5. 重复步骤S1和S4，平行制备多个微孔板样本；

S6. 采用平行微孔板样本对相应的各色谱斑点组分进行生物活性实验以及必要的化学分析；

S7. 依据薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，对显示出生物活性的色谱斑点组分的化学成分进行追踪分析，对其生物特性、化学成分、含量以及结构信息进行对比研究和关联分析，探索其量-效和构-效关系，初步筛选出活性成分。

2.根据权利要求1所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，步骤S4所述洗脱与转移的具体步骤如下：

S41. 将洗脱液加入到微孔板中，然后覆盖网格封口膜；按照薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，将薄层色谱板上的斑点尽可能地对应于微孔板的试验孔、并覆盖于网格封口膜上；加压使薄层色谱板与微孔板形成阵列化的密闭小室复合夹层；

S42. 将复合夹层垂直翻转180°、停留10秒后返回，再停留10秒后重复翻转操作，如此重复操作至薄层色谱斑点洗脱并转移到微孔板的板孔中；

S43. 挥发掉微孔板试验孔内的溶剂，得到含有色谱斑点并保留薄层色谱特征的微孔板样本，根据实验需要平行制备足够数量的微孔板样本。

3.根据权利要求1所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，所述微孔板的孔形为方形。

4.根据权利要求1所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，步骤S1具体为将天然产物提取物、中药提取物或混合物样品配制成待测溶液，选择合适的薄层色谱固定相和色谱流动相进行一维或二维薄层色谱分析。

5.根据权利要求4所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，所述薄层色谱分析使用的薄层色谱板的载体为玻璃、塑料、金属薄膜或纸。

6.根据权利要求1所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，步骤S6的具体步骤为先取一份或多份平行微孔板样本进行生物活性实验，评价各个色谱洗脱组分的生物活性，对显示出生物活性的试验孔依据薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系定位，在另一平行微孔板样本相应的试验孔进行化学成分分析检测。

7.根据权利要求6所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，所述生物活性实验包括生物活性检测或自由基清除活性检测。

8.根据权利要求7所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，所述生物活性检测包括ELISA、MTT检测、DNA筛选或细菌培养。

9.根据权利要求1所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，其特征在于，步骤S2所述薄层色谱显色包括喷洒显色试剂显色、碘熏显影显色或在紫外光下观察成像并作标记；所述色谱参数包括色谱斑点的Rf值和峰面积，用作色谱鉴别和半定量分析。

10.权利要求1至9任一项所述平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法在中药或天然产物复杂组分的生物活性检测和活性成分筛选中的应用。