CN102636612B - 一种分析骆驼蓬草中有效成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析骆驼蓬草中有效成分的方法，包括：构建指纹图谱，通过指纹图谱定性分析其中的有效成分，通过HPLC法检测有效成分的含量；所述指纹图谱指TLC指纹图谱和/或HPLC指纹图谱。本发明构建的指纹图谱具有优异的重现性和专属性，对有效成分的含量检测方法具有良好的稳定性、精密度和加样回收率，可实现定性和定量分析骆驼蓬草中的多种有效成分：鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰骆驼蓬苷和骆驼蓬苷，能较全面地评价骆驼蓬草的质量，可为研究和开发骆驼蓬草的药用价值提供科学的依据；而且本发明的分析方法还具有操作简单、快速、经济、可操作性强等优点，可推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析骆驼蓬草中有效成分的方法，属于中药分析技术领域。
背景技术
骆驼蓬是维吾尔、蒙古族民间沿用已久的药材，已被列入中国人民共和国卫生品药品标准维吾尔药分册。骆驼蓬性平，味苦，辛，有毒，它具有坚固筋脉、助阳暖阴、消除黏稠体液、消散寒湿之气等功能。主治筋脉软弱、关节骨痛、咳嗽痰多、偏瘫健忘、神昏头痛、月经不调等症。在我国西北部的新疆、甘肃、青海、宁夏、内蒙古及陕西等地区的荒漠、沙质、干旱草地等地带主要分布骆驼蓬(p.harmala Linn)、多裂骆驼蓬(P.multisecrum(Maxim)Bobr)及骆驼蒿(P.nigellastrum Bge.)3个种。
骆驼蓬(P.harmala Linn)草是蒺藜科多年生草本植物，主要产于新疆。在民间人们常用其治疗咳嗽气喘、无名肿瘤、风湿痹痛等疾病；亦有用于治疗心血管系统和神经系统方面的疾病；还见过用于灭虫杀蛆及杀灭牲畜体表寄生虫等方面的报道。在20世纪70年代中国学者首次报道了骆驼蓬中的主要成分生物碱具有明确的抗肿瘤作用，就使得该植物及其有效成份越来越受到了众多学者的重视。
研究报道，骆驼蓬草主要含有生物碱类、黄酮类化合物，此外还含有甾体、蒽醌、氨基酸、多糖等成份。生物碱按骨架主要可分为β咔波啉类(β-carboline)和喹唑啉类(quinazoline)两大类生物碱。β咔波啉类主要有去氢骆驼蓬碱(harmine,HAR)、骆驼蓬碱(harmaline,HAL)、去甲氧基骆驼蓬碱(harmalol)、哈尔醇(harmol)和哈尔满(harman)等；喹唑啉类主要有鸭嘴花碱(vasicine)、脱氧鸭嘴花碱(deoxyvasicine)、鸭嘴花酮碱(vasicinone)和去氧鸭嘴花酮碱(deoxyvasicinone)等。开花期的骆驼蓬地上部分中分离得到双骆驼蓬碱(dipegine)、双骆驼蓬醇(dipeginol)、骆驼宁碱A(luotonin A)、骆驼宁碱B(luotonin B)、骆驼宁碱C(luotonin C)、骆驼宁碱(luotonin D)以及nigellastrine I和nigellastrine II等喹唑啉二聚体生物碱或喹唑啉与咔波啉二聚体生物碱。
目前，关于骆驼蓬草的质量标准为部颁标准WS3-BW-0081-98，该标准“鉴别”项采用理化鉴别及粉末显微鉴别，是将药材经乙醇提取后，取滤液滴于滤纸上，干后，在紫外灯（365nm）下观察蓝色荧光。但该标准未对其中的有效成分进行专属的定性和定量分析，不能全面反映骆驼蓬草的质量水平，成为研究和开发骆驼蓬草药用价值的瓶颈。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种分析骆驼蓬草中有效成分的方法，实现对骆驼蓬草中的多种有效成分进行专属的定性和定量分析，促进对骆驼蓬草药用价值的研究和开发。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种分析骆驼蓬草中有效成分的方法，包括：构建指纹图谱，通过指纹图谱定性分析其中的有效成分，通过HPLC法检测有效成分的含量；所述指纹图谱指TLC指纹图谱和/或HPLC指纹图谱；其特征在于，
①TLC指纹图谱的构建包括如下步骤：
a)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末，加甲醇超声处理，其中：1g骆驼蓬草粉末加10mL甲醇；过滤，蒸干滤液；残渣用甲醇溶解，即得供试品溶液，其中：1g骆驼蓬草得到的残渣用2～20mL甲醇溶解；
b)对照品溶液的制备
取去氢骆驼蓬碱对照品、骆驼蓬碱对照品和鸭嘴花碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg～0.1mg的混合溶液，即为对照品溶液；
c)取上述供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别点样于含荧光的硅胶高效薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水按体积比10∶1.5∶0.5形成的混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干后，采用紫外显色或/和碘化铋钾显色或/和生物自显影，测算各特征峰的Rf值；
d)测定10~30批骆驼蓬草的TLC指纹图谱并进行比较，得到由其共有特征峰构成的骆驼蓬草的TLC指纹图谱：鸭嘴花碱峰的Rf值为0.60±0.025，骆驼蓬碱峰的Rf值为0.67±0.030，去氢骆驼蓬碱峰的Rf值为0.84±0.026；
②HPLC指纹图谱的构建包括如下步骤：
e)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末，加醇水溶液超声处理，其中：0.5g骆驼蓬草粉末加10mL醇水溶液；取出，放置至室温，用醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，即为供试品溶液；
f)对照品溶液的制备
精密称取鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬苷和骆驼蓬苷适量，精密称定，加甲醇或乙醇配制成每1mL含鸭嘴花碱80μg、骆驼蓬碱20μg、去氢骆驼蓬碱20μg、脱乙酰基骆驼蓬苷50μg和骆驼蓬苷50μg的混合溶液，即为对照品溶液；
g)精密吸取步骤e)制备的供试品溶液和步骤f)制备的对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱条件如下：色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A是乙腈，流动相B是体积百分比为0.1%的三氟乙酸水溶液，进行梯度洗脱，检测波长为265nm，进样量为2~50μL，柱温为15~50℃，流速为0.5~1.5mL/min，测定时间为70~80min；
h)根据10~30批骆驼蓬草的测定结果，采用均值法，分别从16个特征指纹峰中确定了5个共有特征峰：2号峰鸭嘴花碱、9号峰骆驼蓬碱、10号峰去氢骆驼蓬碱、12号峰脱乙酰基骆驼蓬苷、15号峰骆驼蓬苷；以鸭嘴花碱峰为参照的其它4个共有特征峰的平均相对保留时间及相对标准偏差(RSD)分别如下：9号峰骆驼蓬碱的平均相对保留时间为2.76，RSD为0.71%；10号峰去氢骆驼蓬碱的平均相对保留时间为2.87，RSD为0.79%；12号峰脱乙酰基骆驼蓬苷的平均相对保留时间为3.16，RSD为0.79%；15号峰骆驼蓬苷的平均相对保留时间为3.59，RSD为0.76%；
③通过HPLC法对有效成分的含量检测，包括如下步骤：
i)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末，加醇水溶液超声处理，其中：0.5g骆驼蓬草粉末加10mL醇水溶液；取出，放置至室温，用醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，即为供试品溶液；
j)精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱条件如下：色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A是乙腈，流动相B是体积百分比为0.1%的三氟乙酸水溶液，进行梯度洗脱，检测波长为265nm，进样量为2~50μL，柱温为15~50℃，流速为0.5~1.5mL/min，测定时间为70~80min；
k)得到的高效液相色谱图中：2号峰为鸭嘴花碱，保留时间为18.6±0.18分钟；9号峰为骆驼蓬碱，保留时间为51.1±0.10分钟；10号峰为去氢骆驼蓬碱，保留时间为53.1±0.10分钟；12号峰为脱乙酰基骆驼蓬苷，保留时间为58.4±0.08分钟；15号峰为骆驼蓬苷，保留时间为66.4±0.08分钟。
作为一种优选方案，步骤a)、步骤e)和步骤i)中所述的超声处理是指在160~250W、40kHz频率下超声20~60min。
作为一种优选方案，步骤c)中所述的紫外显色是指在254nm的紫外灯下检视；所述的碘化铋钾显色是指喷碘化铋钾试液后置105℃加热至斑点显色；所述的生物自显影是指将薄层板浸入含有0.05mol/L乙酰胆碱酯酶、pH=7.8的盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）缓冲液中，先于37℃的恒温水浴中保温、保湿处理20分钟，再在由乙酸-α-萘酯与坚牢蓝B盐(FastBlue B Salt)现配的混合溶液中浸板1～2分钟，然后取出在自然光下观察薄层色谱图。
作为一种优选方案，步骤e)和步骤i)中所述的醇水溶液是体积百分比浓度为20%～95%的甲醇水溶液或乙醇水溶液。
作为进一步优选方案，步骤e)和步骤i)中所述的醇水溶液是体积百分比浓度为70%的甲醇水溶液。
作为一种优选方案，步骤g)和步骤j)中所述的色谱柱选用径长为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm的Boston Symmetrix ODS-AQ、Boston Symmetrix ODS-H、Agilent ZORBAXSB-C18或Dikma DiamonsilCl8柱。
作为进一步优选方案，所述色谱柱选用径长为4.6mm×250mm的Boston SymmetrixODS-AQ柱。
作为一种优选方案，步骤g)和步骤j)中所述的洗脱梯度如下：
0至5分钟，流动相A的体积为5%，流动相B的体积为95%；
5至70分钟，流动相A的体积由5%变为29%，流动相B的体积由95%变为71%；
70至80分钟，流动相A的体积为29%，流动相B的体积为71%。
作为一种优选方案，步骤g)和步骤j)中所述的进样量为5~20μL，柱温为20~40℃，流速为0.8~1.2mL/min。
作为一种优选方案，步骤g)和步骤j)中所述的色谱柱柱效以鸭嘴花碱计算不低于2500理论塔板数。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1）构建的指纹图谱具有优异的重现性和专属性，对有效成分的含量检测方法具有良好的稳定性、精密度和加样回收率，可实现定性和定量分析骆驼蓬草中的多种有效成分，能较全面地评价骆驼蓬草的质量，可为研究和开发骆驼蓬草的药用价值提供科学的依据；
2）本发明的分析方法还具有操作简单、快速、经济、可操作性强等优点，可推广应用。
附图说明
图1为实施例1获得的TLC指纹图谱，其中：A为紫外显色图谱，B为碘化铋钾显色图谱，C为生物自显影图谱；
图2为实施例2测定的10批骆驼蓬草的HPLC图谱；
图3为实施例2获得的骆驼蓬草的特征HPLC图谱；
图4为实施例2获得的骆驼蓬草特征峰混合对照品的标准HPLC指纹图谱；
图5为实施例3测定得到的骆驼蓬草的高效液相色谱图；
图6为实施例3测定得到的混合对照品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细、完整地说明。
实施例1：构建TLC指纹图谱
a)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末1g，加10mL甲醇，在160~250W、40kHz频率下超声处理30min，冷却，用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤，蒸干滤液，残渣加2mL甲醇溶解，取上清液，即为供试品溶液。
b)对照品溶液的制备
取去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱和鸭嘴花碱对照品各1mg，分别用1mL甲醇配制成溶液，即为对照品溶液；
c)取上述供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别点样于含荧光的硅胶高效薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水按体积比10∶1.5∶0.5形成的混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干后，置254nm紫外灯下检视，得到图1中A图所示图谱；再喷以碘化铋钾试液，置105℃加热至斑点显色清晰，得到图1中B图所示图谱；
d)取a)项下的供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；
e)取b)项下的对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液；
f)分别吸取上述d)、e)项下的供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别点样于含荧光的硅胶高效薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶1.5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，将薄层板浸入含有0.05mol/L乙酰胆碱酯酶的盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）缓冲液(pH=7.8)中，先于37℃的恒温水浴中保温、保湿处理20分钟，再在由乙酸-α-萘酯与坚牢蓝B盐(FastBlue B Salt)现配的混合溶液（即，取50mg α-乙酸萘酯溶解于20mL无水乙醇中，另称取FastBlue B盐200mg溶解于80mL双蒸水中，临用前将两溶液混合）中浸板1～2分钟，然后取出在自然光下观察薄层色谱图（图1中C图所示图谱），计算各特征峰的Rf值；
g)测定10批骆驼蓬草的TLC指纹图谱并进行比较，得到由其共有特征峰构成的骆驼蓬草的TLC指纹图谱（见图1所示）：鸭嘴花碱峰的Rf值为0.60±0.025，骆驼蓬碱峰的Rf值为0.67±0.030，去氢骆驼蓬碱峰的Rf值为0.84±0.026。
由图1中A图和B图可快速、简便定性分析骆驼蓬草中是否含有去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱和鸭嘴花碱等生物碱类有效成分；由图1中C图可快速、简便定性分析骆驼蓬草中是否含有去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱和鸭嘴花碱等具有抗乙酰胆碱酯酶活性的生物碱类有效成分。另外，由图1可见：所构建的TLC指纹图谱重现性好，稳定性高，各斑点分离度较好，Rf值在0.3~0.9之间。
实施例2：构建HPLC指纹图谱
a)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末0.5g，加10mL体积百分比浓度为70%的甲醇水溶液，在160~250W、40kHz频率下超声处理30分钟，取出，放置至室温，用70%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；
b)对照品溶液的制备
精密称取鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬苷和骆驼蓬苷适量，精密称定，加甲醇配制成每1mL含鸭嘴花碱80μg、骆驼蓬碱20μg、去氢骆驼蓬碱20μg、脱乙酰基骆驼蓬苷50μg和骆驼蓬苷50μg的溶液，即为对照品溶液；
c)精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱条件如下：色谱柱为Boston Symmetrix ODS-AQ柱（4.6mm×250mm），流动相A是乙腈，流动相B是体积百分比为0.1%的三氟乙酸水溶液，洗脱梯度如下：
0至5分钟，流动相A的体积为5%，流动相B的体积为95%；
5至70分钟，流动相A的体积由5%变为29%，流动相B的体积由95%变为71%；
70至80分钟，流动相A的体积为29%，流动相B的体积为71%；
检测波长为265nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；
d)根据10批骆驼蓬草的测定结果（见图2所示），采用均值法，分别从16个特征指纹峰（见图3所示）中确定了5个共有特征峰（见图4所示的指纹图谱）：2号峰鸭嘴花碱、9号峰骆驼蓬碱、10号峰去氢骆驼蓬碱、12号峰脱乙酰基骆驼蓬苷、15号峰骆驼蓬苷。
测定的10批骆驼蓬草的色谱图与构建的指纹图谱相比较的相似度结果见表1所示：
表1相似度评价结果
| 样品批号 | 产地 | 相似度 |
| S1 | 新疆乌鲁木齐市五一农场 | 0.980 |
| S2 | 新疆昌吉市六工镇1 | 0.977 |
| S3 | 新疆昌吉市六工镇2 | 0.985 |
| S4 | 新疆伊宁县后山 | 0.913 |
| S5 | 新疆伊宁市巴彦岱 | 0.910 |
| S6 | 新疆乌鲁木齐市西山农场1 | 0.957 |
| S7 | 新疆乌鲁木齐市西山农场2 | 0.929 |
| S8 | 新疆喀什黒孜戈壁1 | 0.973 |
| S9 | 新疆喀什黒孜戈壁2 | 0.930 |
| S10 | 新疆吉木莎尔县 | 0.834 |
由表1可见：构建的指纹图谱具有优异的重现性和专属性，可实现定性分析骆驼蓬草中的多种有效成分，能较全面地评价骆驼蓬草的质量，可为研究和开发骆驼蓬草的药用价值提供科学的依据。
以鸭嘴花碱峰为参照的其它4个共有特征峰的相对保留时间RT及相对标准偏差RSD见表2所示：
表2各特征峰的相对保留时间RT及相对标准偏差RSD
由表2可见：2号峰鸭嘴花碱的平均RT为1，RSD为0；9号峰骆驼蓬碱的平均RT为2.76，RSD为0.71%；10号峰去氢骆驼蓬碱的平均RT为2.87，RSD为0.79%；12号峰脱乙酰基骆驼蓬苷的平均RT为3.16，RSD为0.79%；15号峰骆驼蓬苷的平均RT为3.59，RSD为0.76%。
实施例3：对有效成分的含量测定
a)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末0.5g，加10mL体积百分比浓度为70%的甲醇水溶液，在160~250W、40kHz频率下超声处理30分钟，取出，放置至室温，用70%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；
b)精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱条件如下：色谱柱为Boston Symmetrix ODS-AQ柱（4.6mm×250mm），流动相A是乙腈，流动相B是体积百分比为0.1%的三氟乙酸水溶液，洗脱梯度如下：
0至5分钟，流动相A的体积为5%，流动相B的体积为95%；
5至70分钟，流动相A的体积由5%变为29%，流动相B的体积由95%变为71%；
70至80分钟，流动相A的体积为29%，流动相B的体积为71%；
检测波长为265nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；
测定得到的骆驼蓬草的高效液相色谱图见图5所示。
精密称取鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬苷和骆驼蓬苷标准品适量，加甲醇制成每1mL含鸭嘴花碱80μg、骆驼蓬碱20μg、去氢骆驼蓬碱20μg、脱乙酰基骆驼蓬苷50μg和骆驼蓬苷50μg的溶液，即得标准品混合溶液；
精密吸取标准品溶液10μL，按上述高效液相色谱条件进行测试，得到混合标准品的色谱图（见图6所示），其中：2号峰为鸭嘴花碱（保留时间为18.5min），9号峰为骆驼蓬碱（保留时间为51.1min），10号峰为去氢骆驼蓬碱（保留时间为53.1min），12号峰为脱乙酰基骆驼蓬苷（保留时间为58.4min），15号峰为骆驼蓬苷（保留时间为66.4min）。
对比图5和图6可知：本发明提供的含量测定方法可有效分离和定量检测骆驼蓬草中的多种有效成分。
对10批骆驼蓬草样品中的有效成分的含量测定结果见表3所示。
表3.10批骆驼蓬草样品中的有效成分的含量测定结果(n=3)
实施例4：对含量检测方法的方法学考察
1、系统适应性试验
材料和方法同实施例3。该测定方法理论塔板数按鸭嘴花碱计算不低于2500。
2、标准曲线及线性范围
取鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬甙和骆驼蓬甙适量，精密称定，分别置不同的量瓶中，加甲醇制成每1ml分别含鸭嘴花碱0.9904mg、骆驼蓬碱0.0520mg、去氢骆驼蓬碱0.0596mg、骆驼蓬甙1.0180mg、脱乙酰基骆驼蓬甙0.5100mg的溶液，摇匀，即为储备液。将各溶液分别按表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5中浓度稀释，HPLC检测，进样量10μL，检测数据见表4-1、4-2、4-3、4-4、4-5所示：
表4-1鸭嘴花碱标准曲线数据
| C(μg/mL) | 990.4 | 792.3 | 594.2 | 316.9 | 158.5 | 79.2 | 0.792 |
| A | 12806.3 | 10299.9 | 7620.9 | 4045.4 | 2000.4 | 1046.3 | 24.3 |
表4-2骆驼蓬碱标准曲线数据
| C(μg/mL) | 41.6 | 31.2 | 20.8 | 10.4 | 5.2 | 0.52 |
| A | 606.8 | 463.6 | 303.1 | 161.1 | 81.4 | 12 |
表4-3去氢骆驼蓬碱标准曲线数据
| C(μg/mL) | 47.7 | 35.8 | 23.8 | 11.9 | 2.98 | 0.6 |
| A | 1743.9 | 1325.4 | 875 | 458.9 | 110.1 | 30 |
表4-4脱乙酰基骆驼蓬苷标准曲线数据
| C(μg/mL) | 408.0 | 306.0 | 204.0 | 102.0 | 51.0 | 2.55 |
| A | 7970.3 | 5973.9 | 3992.6 | 2004.4 | 1003 | 53.6 |
表4-5骆驼蓬苷标准曲线数据
| C(μg/mL) | 407.2 | 203.6 | 101.8 | 50.9 | 10.18 | 1.018 |
| A | 8801.8 | 4529.8 | 2322.6 | 1190.9 | 130.4 | 39.4 |
根据上述各成分的检测数据绘制标准曲线，具体见表5所示：
表5各成分标准曲线和线性范围
| 检测成分 | 标准曲线 | 相关系数/r | 线性范围/μg/mL |
| 鸭嘴花碱 | y=12947x–17.363 | 0.9999 | 990.4-0.792 |
| 骆驼蓬碱 | y=14597x+6.0739 | 0.9995 | 41.6-0.52 |
| 去氢骆驼蓬碱 | y=36510x–9.9059 | 0.9999 | 47.69-0.60 |
| 脱乙酰基骆驼蓬苷 | y=19513x+8.3152 | 1.0000 | 480.0-2.55 |
| 骆驼蓬苷 | y=21679x+36.749 | 0.9997 | 407.2-1.018 |
3、定量限（LOQ）和检测限（LOD）
当标准品（鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬苷和骆驼蓬苷）进样浓度分别如表6所示时，信噪比S/N＝10或3，分别为上述各指标成分的定量限和检测限。
表6各成分定量限（LOQ）和检测限（LOD）
| 检测成分 | 鸭嘴花碱 | 骆驼蓬碱 | 去氢骆驼蓬碱 | 脱乙酰基骆驼蓬苷 | 骆驼蓬苷 |
| LOQ（ng） | 7.92 | 10.40 | 6.0 | 25.5 | 10.18 |
| LOD（ng） | 3.96 | 5.20 | 1.20 | 5.10 | 2.04 |
4、精密度考察
分别取三种不同浓度的标准品溶液：鸭嘴花碱的浓度分别为792.3μg/L、316.9μg/mL、79.2μg/mL；骆驼蓬碱的浓度分别为41.6μg/mL、31.2μg/mL、10.4μg/mL；去氢骆驼蓬碱的浓度分别为47.7μg/mL、35.8μg/mL、11.9μg/mL；脱乙酰基骆驼蓬苷浓度分别为306μg/mL、204μg/mL、51μg/mL；骆驼蓬苷的浓度分别为407.2μg/mL、203.6μg/mL、50.9μg/L；进样量10μL，每组浓度重复进样6次，HPLC检测，测定平均峰面积，计算RSD，测定结果见表7所示。
表7日内精密度测定结果（n＝6）
由表7可见：同一天测试，各成分不同浓度组的RSD均小于2％，表明该测定方法日内精密度良好。
按上述条件连续三天测试，计算RSD，测定结果见表8所示。
表8日间精密度测定结果（n＝6）
由表8可见：连续三天测试，各成分各浓度组的RSD均小于2％，表明该测定方法日间精密度良好。
5、样品稳定性
取骆驼蓬草，按实施例3的方法制备供试品溶液，分别于0、2、6、10、24、48、72小时进行HPLC检测，测定结果见表9所示。
表9稳定性测定结果
由表9可见：样品在72h内稳定，RSD在0.44%～2.90%间。
6、重复性实验
取骆驼蓬草，按实施例3的方法制备6份供试品溶液，进行HPLC检测，测定结果见表10所示。
表10重复性测定结果
由表10可见：各成分RSD为1.72%~3.39%，说明该检测方法重复性良好。
7、加样回收实验
精密称定标准品鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬苷、骆驼蓬苷适量，加甲醇制成每1mL分别含鸭嘴花碱0.9904mg、骆驼蓬碱0.0520mg、去氢骆驼蓬碱0.0596mg、脱乙酰基骆驼蓬苷0.5100mg、骆驼蓬苷1.018mg的溶液，摇匀，即为各自的储备液，备用。
精密量取骆驼蓬草0.25g，按实施例3方法制备供试品溶液。
针对每种检测成分，分别向上述供试品溶液中加入含该检测成分量80%、100%和120%的标准品，加入70%甲醇至刻度10mL，摇匀，进行HPLC测定，按如下公式计算加样回收率：加样回收率%=[(测得量-供试品溶液所含指标成分的量)/实际加入量]×100%；测试结果见表11-1、11-2、11-3、11-4、11-5所示。
表11-1鸭嘴花碱加样回收实验结果
表11-2骆驼蓬碱加样回收实验结果
表11-3去氢骆驼蓬碱加样回收实验结果
表11-4脱乙酰基骆驼蓬苷加样回收实验结果
表11-5骆驼蓬苷加样回收实验结果
由表11-1~11-5可见：针对各检测成分，本发明的检测方法具有良好的加样回收率。
综上所述可见：本发明构建的指纹图谱具有优异的重现性和专属性，对有效成分的含量检测方法具有良好的稳定性、精密度和加样回收率，可实现定性和定量分析骆驼蓬草中的多种有效成分，能较全面地评价骆驼蓬草的质量，可为研究和开发骆驼蓬草的药用价值提供科学的依据；而且本发明的分析方法还具有操作简单、快速、经济、可操作性强等优点，可推广应用。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种分析骆驼蓬草中有效成分的方法，包括：构建指纹图谱，通过指纹图谱定性分析其中的有效成分，通过HPLC法检测有效成分的含量；所述指纹图谱指TLC指纹图谱和/或HPLC指纹图谱；其特征在于，
①TLC指纹图谱的构建包括如下步骤：
a)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末，加甲醇超声处理，其中：1g骆驼蓬草粉末加10mL甲醇；过滤，蒸干滤液；残渣用甲醇溶解，即得供试品溶液，其中：1g骆驼蓬草得到的残渣用2～20mL甲醇溶解；
b)对照品溶液的制备
取去氢骆驼蓬碱对照品、骆驼蓬碱对照品和鸭嘴花碱对照品，加甲醇制成每1ml各含0.1mg～1mg的混合溶液，即为对照品溶液；
c)取上述供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别点样于含荧光的硅胶高效薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水按体积比10∶1.5∶0.5形成的混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干后，采用紫外显色或/和碘化铋钾显色或/和生物自显影，测算各特征峰的Rf值；所述的紫外显色是指在254nm的紫外灯下检视；所述的碘化铋钾显色是指喷碘化铋钾试液后置105℃加热至斑点显色；所述的生物自显影是指将薄层板浸入含有0.05mol/L乙酰胆碱酯酶、pH=7.8的盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）缓冲液中，先于37℃的恒温水浴中保温、保湿处理20分钟，再在由乙酸-α-萘酯与坚牢蓝B盐(Fast Blue B Salt)现配的混合溶液中浸板1～2分钟，然后取出在自然光下观察薄层色谱图；
d)测定10～30批骆驼蓬草的TLC指纹图谱并进行比较，得到由其共有特征峰构成的骆驼蓬草的TLC指纹图谱：鸭嘴花碱峰的Rf值为0.60±0.025，骆驼蓬碱峰的Rf值为0.67±0.030，去氢骆驼蓬碱峰的Rf值为0.84±0.026；
②HPLC指纹图谱的构建包括如下步骤：
e)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末，加醇水溶液超声处理，其中：0.5g骆驼蓬草粉末加10mL醇水溶液；取出，放置至室温，用醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，即为供试品溶液；所述的醇水溶液是体积百分比浓度为70%的甲醇水溶液；
f)对照品溶液的制备
精密称取鸭嘴花碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、脱乙酰基骆驼蓬苷和骆驼蓬苷适量，精密称定，加甲醇或乙醇配制成每1mL含鸭嘴花碱80μg、骆驼蓬碱20μg、去氢骆驼蓬碱20μg、脱乙酰基骆驼蓬苷50μg和骆驼蓬苷50μg的混合溶液，即为对照品溶液；
g)精密吸取步骤e)制备的供试品溶液和步骤f)制备的对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱条件如下：色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A是乙腈，流动相B是体积百分比为0.1%的三氟乙酸水溶液，进行梯度洗脱，检测波长为265nm，进样量为2～50μL，柱温为15～50℃，流速为0.5～1.5mL/min，测定时间为70～80min；所述的洗脱梯度如下：
0至5分钟，流动相A的体积为5%，流动相B的体积为95%；
5至70分钟，流动相A的体积由5%变为29%，流动相B的体积由95%变为71%；
70至80分钟，流动相A的体积为29%，流动相B的体积为71%；
h)根据10～30批骆驼蓬草的测定结果，采用均值法，分别从16个特征指纹峰中确定了5个共有特征峰：2号峰鸭嘴花碱、9号峰骆驼蓬碱、10号峰去氢骆驼蓬碱、12号峰脱乙酰基骆驼蓬苷、15号峰骆驼蓬苷；以鸭嘴花碱峰为参照的其它4个共有特征峰的平均相对保留时间及相对标准偏差(RSD)分别如下：9号峰骆驼蓬碱的平均相对保留时间为2.76，RSD为0.71%；10号峰去氢骆驼蓬碱的平均相对保留时间为2.87，RSD为0.79%；12号峰脱乙酰基骆驼蓬苷的平均相对保留时间为3.16，RSD为0.79%；15号峰骆驼蓬苷的平均相对保留时间为3.59，RSD为0.76%；
③通过HPLC法对有效成分的含量检测，包括如下步骤：
i)供试品溶液的制备
取骆驼蓬草粉末，加醇水溶液超声处理，其中：0.5g骆驼蓬草粉末加10mL醇水溶液；取出，放置至室温，用醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，即为供试品溶液；所述的醇水溶液是体积百分比浓度为70%的甲醇水溶液；
j)精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱条件如下：色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A是乙腈，流动相B是体积百分比为0.1%的三氟乙酸水溶液，进行梯度洗脱，检测波长为265nm，进样量为2～50μL，柱温为15～50℃，流速为0.5～1.5mL/min，测定时间为70～80min；所述的洗脱梯度如下：
0至5分钟，流动相A的体积为5%，流动相B的体积为95%；
5至70分钟，流动相A的体积由5%变为29%，流动相B的体积由95%变为71%；
70至80分钟，流动相A的体积为29%，流动相B的体积为71%；
k)得到的高效液相色谱图中：2号峰为鸭嘴花碱，保留时间为18.6±0.18分钟；9号峰为骆驼蓬碱，保留时间为51.1±0.10分钟；10号峰为去氢骆驼蓬碱，保留时间为53.1±0.10分钟；12号峰为脱乙酰基骆驼蓬苷，保留时间为58.4±0.08分钟；15号峰为骆驼蓬苷，保留时间为66.4±0.08分钟。
2.根据权利要求1所述的分析骆驼蓬草中有效成分的方法，其特征在于：步骤a)、步骤e)和步骤i)中所述的超声处理是指在160～250W、40kHz频率下超声20～60min。
3.根据权利要求1所述的分析骆驼蓬草中有效成分的方法，其特征在于：步骤g)和步骤j)中所述的色谱柱选用径长为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm的Boston SymmetrixODS-AQ、Boston Symmetrix ODS-H、Agilent ZORBAX SB-C18或Dikma DiamonsilCl8柱。
4.根据权利要求3所述的分析骆驼蓬草中有效成分的方法，其特征在于：所述色谱柱选用径长为4.6mm×250mm的Boston Symmetrix ODS-AQ柱。
5.根据权利要求1所述的分析骆驼蓬草中有效成分的方法，其特征在于：步骤g)和步骤j)中所述的进样量为5～20μL，柱温为20～40℃，流速为0.8～1.2mL/min。
6.根据权利要求1所述的分析骆驼蓬草中有效成分的方法，其特征在于：步骤g)和步骤j)中所述的色谱柱柱效以鸭嘴花碱计算不低于2500理论塔板数。
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