CN103800385B - 从蛹虫草中提取虫草素组分的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，它包括以下步骤：取蛹虫草子实体超微粉碎，得到超微粉；超微粉用超纯水进行水提后取上清液干燥，然后用乙醇进行醇沉处理，离心，收集醇沉上清液，将醇沉上清液旋蒸后干燥，得到粗提物；将粗提物用15%甲醇-水溶液溶解至100mg/mL，经制备液相DAC反相色谱柱进行分离，反相分离填料为C18，洗脱方式为先5%-15%甲醇-水溶液梯度洗脱、再15%甲醇-水溶液等度洗脱，检测波长260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分即为目的虫草素组分。该方法简单可控，重复性好，提取得到的组分中虫草素含量高，批次稳定，可应用于制备抗肿瘤药物中。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物制备技术领域，具体涉及一种从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，以及该提取得到的虫草素组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
虫草素是蛹虫草产生的次级代谢产物，并且体外实验被证实是具有广泛的生物活性和药理作用的核苷类似物。在1951年，加拿大的Cunningham等从蛹虫草的原浆液中分离得到一种物质，命名为虫草素（Cordycepin）,是由腺苷和有着碳支链的脱氧戊糖组成的核苷酸，因此也被称为3’-脱氧腺苷，是从真菌类生物中分离出的第一个脱氧核苷类抗生素，含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物碱。
早在20世纪70年代虫草素就被发现具有抗肿瘤、抗病原虫和抑制mRNA的作用。90年代发现，添加腺苷脱氨酶抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要的作用，这说明虫草素的合成是遵循嘌呤腺苷途径的，因此有关虫草素的研究从而获得突破性的进展。虫草素能够治疗急性前B淋巴细胞和前T淋巴细胞白血病患者。关于抗肿瘤作用机制Jagger认为虫草素含有一个游离的醇基，醇基可以掺入到癌细胞中作用于DNA，从而抑制了癌细胞的核酸合成。也有研究表明，虫草素是RNA合成的抑制剂，选择性的抑制RNA合成，从而抑制蛋白质的合成。研究表明，虫草素还表现出极强的抗真菌、抗HIV-Ⅰ型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性。虫草素能干扰细胞RNA和DNA的合成，抑制不正常细胞的分裂并能作为区别细胞中不能的RNA聚合酶的工具，并具有修复基因、保护生命体遗传密码的特殊功效。
近年来蛹虫草的研究已经成为一个热点，尤其是蛹虫草中虫草素的研究，但是关于虫草素的提取与纯化方法都比较复杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，该方法简单可控，重复性好，提取得到的组分中虫草素含量高，批次稳定。
本发明所采用的技术方案为：
一种从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，该方法包括以下步骤：
（1）超微粉碎：取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，得到超微粉。
（2）溶剂提取：将超微粉用超纯水进行水煮提取，离心，取上清液干燥至固状，然后用乙醇进行醇沉处理，离心，收集醇沉上清液，将醇沉上清液旋蒸后干燥至固状，得到粗提物。
（3）高压液相制备系统分离：将粗提物用15%甲醇-水溶液（即甲醇与超纯水以3：17基础的体积比配比而成）溶解至100mg/mL，经制备液相DAC反相色谱柱进行分离，反相分离填料为C18，洗脱方式为先用5%-15%甲醇-水溶液梯度洗脱、再用15%甲醇-水溶液等度洗脱，检测波长260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，即得到本发明目的虫草素组分。该步是整个提取方法的关键，经过大量的数据研究和反复试验，我们发现当使用15%甲醇-水溶液将粗提物溶解至100mg/mL时，最后收集得到的目的虫草素组分中虫草素的含量为最高，当浓度高于100mg/mL或低于100mg/mL时，最终得到的目的虫草素组分中其虫草素含量经过测试都没有100mg/mL时高；而先用5%-15%甲醇-水溶液梯度洗脱、再用15%甲醇-水溶液等度洗脱的洗脱方式也对目的组分的获得至关重要，使用该洗脱方式时，洗脱得到的各个峰之间比较分得开，使得到的虫草素组分中虫草素纯度高，提取率高。
所述步骤（1）中超微粉碎具体步骤为每次称取100～200g蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中粉碎超微粉碎1min，使达到颗粒大小3000目的粉碎效果，同时粉碎全过程用-15～-20℃的水作为超微破碎机内部冷却液。
作为优选，所述步骤（2）中超微粉与超纯水按料液比（质量体积比）1︰8进行混合均匀，水煮时间为30～90min，提取三次，即第一次水煮完成后离心，取沉淀进行第二次水煮，第二次水煮完成后离心，取沉淀进行第三次水煮，第三次水煮完成后离心，将三次离心得到的上清液进行合并，进入下一步骤。该步骤能尽量多地将蛹虫草子实体中的组分溶解到水提上清中，从而增大了有效虫草素组分被提取的可能性，使虫草素的提取率提高。
作为优选，所述步骤（2）中用乙醇进行醇沉处理具体步骤为先按料液比（质量体积比）（1～4）︰1加超纯水溶解，然后加入95%的乙醇至终浓度为80%，充分混匀后，4℃醇沉过夜。与传统的直接用无水乙醇进行醇沉处理的提取方式相比，本发明先用超纯水溶解，使物质颗粒处于尽量分散状态，然后加入95%的乙醇至终浓度为80%，即在乙醇加入的整个过程中，物质颗粒所在的液体环境其乙醇浓度是慢慢由0%升至80%，而我们知道固体物质的溶解与其溶剂的浓度是有关系的，所以本发明使乙醇浓度由0%升至80%的过程中可以使尽可能多的物质种类和数量被溶解在液体中，这有利于提高虫草素被提取的可能性，有利于提高虫草素的提取率。
作为优选，所述步骤（3）中反相分离填料C18中硅球粒径为10μm，DAC反相色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，流速为80mL/min，进样量为20mL，洗脱方式为先用5%-15%甲醇-水溶液梯度洗脱10min、再用15%甲醇-水溶液等度洗脱30min。
所述步骤（3）中体外抗肿瘤活性筛选具体是指进行抑制人肺癌A549细胞生长试验和抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验，更具体的，是指采用实时无标记动态细胞分析技术实时检测加药后人肺癌A549细胞和人肝癌Hep-G2细胞的生长情况，同时可获得药物介导的细胞效应曲线，通过该曲线判断该药物是否抑制癌细胞的生长。与传统方法（MTT）对比优势在于，实验操作简单，步骤少，人为误差小。采用无标记方法，不存在标记效率问题，并且对细胞无损伤，细胞在最接近生理状态下进行检测，结果准确度高。实验结果客观，重复性好，不需设置重复孔。该方法可以很好地判断待测组分的抗肿瘤活性，因为在实验中我们发现，各待测组分对这两种细胞的抑制基本是同步的，即不存在第1号组分对人肺癌A549细胞抑制作用最好而第2组分对人肝癌Hep-G2细胞抑制作用最好的情况，基本上选取的目的组分要么对两种细胞的抑制作用都是最好的，要么对其中一种细胞抑制作用最好、而另一种细胞所有的组分抑制效果都比较差。
本发明还进一步提供上述从蛹虫草中提取得到的虫草素组分在制备抗肿瘤药物中的应用。该虫草素组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
1、本发明采用超微粉碎机进行低温超微粉碎，以破除蛹虫草子实体坚硬的细胞壁，有利于内容物的溶出，蛹虫草粉末达到3000目，增加了粒子的比表面积，有利于虫草素等小分子的提取，有效提高了蛹虫草中虫草素有效组分的提取率；
2、本发明采用制备液相DAC反相色谱柱进行蛹虫草中物质组分的分离纯化，通过对各个分离步骤的试剂选择、工艺条件和工艺参数的优化，以及各个分离步骤之间良好的协同作用，最终成功提取到虫草素活性组分，相对于传统的溶剂萃取法，该虫草素组分活性组分的提取方法不但稳定性好，重复性好，得到的物质组分批次之间一致性高，而且提取率高，得到的活性组分具有强抗肿瘤活性；
3、本发明采用甲醇和水作为流动相，不仅减少了对环境的污染，且有利于节约成本；
4、本发明通过人肺癌A549细胞生长抑制试验和人肝癌Hep-G2细胞生长抑制试验来判定蛹虫草中提取到的虫草素组分的体外抗肿瘤能力，并设阳性对照，结果直观、易判断；
5、本发明从蛹虫草中提取虫草素组分的方法工艺简单，易于实施，具有快速、高效、重复性好、稳定可控、分离纯化制备量大、适用于工业化大规模生产等特点，所得的虫草素组分中虫草素含量高，可用于研发制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1中利用制备液相DAC反相色谱柱分离的色谱图；
图2所示的是本发明实施例2中虫草素组分对肺癌A549细胞的抑制作用示意图；
图3所示的是本发明实施例2中虫草素组分对肝癌Hep-G2细胞的抑制作用示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
1、原料：
蛹虫草子实体为本实验室培育和生产。
2、试剂和材料：
超纯水由密立博纯水仪生产；乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱纯制备级甲醇购自天津康科德科技公司；F-12K购自Gibco公司。
仪器和设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；DAC反相色谱柱购自江苏迪沃特仪器设备科技有限公司；日立高效液相色谱仪购自天美（中国）科学仪器有限公司；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物（杭州）有限公司。
实施例1：蛹虫草虫草素组分的提取
从蛹虫草中提取虫草素组分，具体包括以下步骤：
（1）蛹虫草子实体室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎机中粉碎1min，得到超微粉；
（2）取上述蛹虫草子实体超微粉3Kg，经过三次水煮：第一次水煮：3kg蛹虫草粉加入24L超纯水，水煮70min，水煮结束，25℃，6000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥固状；第二次水煮：第一次水煮残渣加入12L超纯水，水煮70min，水煮结束，按第一次水煮方法进行处理，其中水体上清可与第一次提取上清混合，烘干固状；第三次水煮：第二次水煮残渣加入9L超纯水，水煮70min，水煮结束，按第一次水煮处理方法进行处理，可将三次水煮上清合并，旋蒸浓缩后烘干固状。
干燥后的水煮上清加适量水（溶解即可，约2:1（w/v））溶解，加入95%的乙醇至终浓度为80%，充分混匀后，4℃冰箱中沉淀过夜，分别收集上清液和沉淀，上清液于旋转蒸发仪中浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至固状，得粗提物。
（3）将粗提物用流动相（15%甲醇-水溶液）配制成100mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到蛹虫草子实体小分子提取物的样品溶液，所述样品溶液经制备液相DAC反相色谱柱进行分离，反相分离填料为C18，反相分离材料中硅球粒径为10μm，采用的DAC反相色谱柱直径为50mm，柱长为250mm。采用流动相A为纯水、流动B相为甲醇二元流动相体系进行固相萃取。5%-15%甲醇-水溶液梯度洗脱10min，15%甲醇-水溶液等度洗脱30min，色谱分离图如图1所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，即得到本发明目的虫草素，共255g。
该目的虫草素组分经过HPLC验纯及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有虫草素及其他未知物。
实施例2：抑制人肺癌A549细胞生长的试验
细胞培养：
在5%C02，37℃，饱和湿度下，用F-12K（10%FBS+1%PS）培养基培养人肺癌A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2×104个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物（实施例1提取得到的虫草素组分）至终浓度为25μg/ml，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
空白对照孔：不加药物，加1‰DMSO；
实验孔：加药物（实施例1提取得到的虫草素组分）。
试验结果如图2所示。
结果表明：虫草素组分在25μg/mL时对A549细胞生长抑制较强。
实施例3：抑制人肝癌Hep-G2细胞生长的试验
细胞培养：
在5%C02，37℃，饱和湿度下，用DMEM（10%FBS、1%PS）培养基培养人肺癌Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4×104个，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物（实施例1提取得到的虫草素组分）至终浓度为所需药物浓度（25μg/ml），含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
空白对照孔：不加药物，加入1‰DMSO；
实验孔：加药物（实施例1提取得到的虫草素组分）。
实验结果如图3所示。
结果表明：虫草素组分在25μg/mL时能较好的抑制HEP-G2细胞生长。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合医药生物制备的普通市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (4)
1.一种从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，得到超微粉；
(2)将超微粉用超纯水进行水煮提取，离心，取上清液干燥至固状，然后用乙醇进行醇沉处理，离心，收集醇沉上清液，将醇沉上清液旋蒸后干燥至固状，得到粗提物；
(3)将粗提物用15％甲醇-水溶液溶解至100mg/mL，经制备液相DAC反相色谱柱进行分离，反相分离填料为C18，洗脱方式为先用5％-15％甲醇-水溶液梯度洗脱、再用15％甲醇-水溶液等度洗脱，检测波长260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，即得到目的虫草素组分；
所述步骤(2)中超微粉与超纯水按料液比1︰8进行混合均匀，水煮时间为30～90min，提取三次；
所述步骤(2)中用乙醇进行醇沉处理具体步骤为先按料液比(1～4)︰1加超纯水溶解，然后加入95％的乙醇至终浓度为80％，充分混匀后，4℃醇沉过夜；
所述步骤(3)中反相分离填料C18中硅球粒径为10μm，DAC反相色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，流速为80mL/min，进样量为20mL。
2.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，其特征在于：所述步骤(1)中超微粉碎具体步骤为每次称取100～200g蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中粉碎超微粉碎1min，同时粉碎全过程用-15～-20℃的水作为超微破碎机内部冷却液。
3.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取虫草素组分的方法，其特征在于：所述步骤(3)中体外抗肿瘤活性筛选具体是指进行抑制人肺癌A549细胞生长试验和抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验。
4.权利要求1所述的从蛹虫草中提取得到的虫草素组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
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