CN105616552B

CN105616552B - 两头尖提取物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN105616552B
Application number: CN201410708241.1A
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 唐楚沉; 马琳; 顾朋嫒; 李聪聪
Original assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: CN105616552A

Abstract

本发明提供一种两头尖提取物的制备方法：将两头尖烘干脱水后超微粉碎，加入乙酸乙酯提取，过滤，收集滤渣用乙醇提取，过滤取上清，减压浓缩后加入甲醇‑水溶液进行超声溶解，然后在C18反相分离色谱柱分离纯化，采用A超纯水、B甲醇二元流动相，分离条件为0～5min 95％A等度洗脱，5～15min 87％A等度洗脱，15～25min40％A等度洗脱，25～35min 30％A等度洗脱，35～45min 25％A等度洗脱，45～55min100％B等度洗脱，收集47‑48min洗脱液，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，适合工业化大生产。

Description

两头尖提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种两头尖提取物的制备方法，以及该得到的两头尖提取物在制备抗肺癌药物或抗肺癌保健品中的应用。

背景技术

两头尖又名竹节香附，为毛莨科银莲花属多被银莲花(AnemoneraddeanaRege1)的干燥根茎。主要分布于东北三省及山东、河北、山西等地，以吉林省产量最多。药材多夏季采挖，除去残茎及须根，晒干。此药首载于明朝刘文泰所著《本草品汇精要》。具有“祛风除湿，消痈肿”之功效。早在清代，王旭高的“定癌散”曾以两头尖治疗乳癌。现在临床用于风寒湿痹，手足拘挛，骨节疼痛，痈疽肿痛。多与其它药物配伍，不单方入药，是著名中成药“活络丹”和“再造丸”的主要原料。据文献报道，两头尖中含有大量的皂苷类成分，还含有内酯类、挥发油类、油脂类、生物碱、氨基酸、微量元素及糖类等成分。研究表明两头尖还具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静和抗惊厥作用。

授权公告号为CN1210289C的发明专利公开了一种两头尖提取物的制备工艺，该工艺主要采用乙醇提取+硅胶干柱层析的方法进行分离，得到无色粉末状结晶两头尖皂甙D。授权公告号为CN1312170C的发明专利公开了一种两头尖提取物的制备工艺，它主要是通过采用碱提取+乙醇提取的方法来提高目的提取物中银莲花素A的收率和纯度。授权公告号为CN102584927B的发明专利公开了一种从两头尖中分离提取一类三萜类化合物的方法，该方法先乙醇提取，接着依次用石油醚萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取，再经柱层析，高效液相制备，得到目的产物。该提取方法步骤繁琐，耗时，重复性差，稳定性差，不适用工业化大生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种两头尖提取物的制备方法，该方法对样品初步处理后，主要采用高效液相色谱进行分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，适合工业化大生产。

本发明所采用的技术方案为：

一种两头尖提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)以两头尖为原料，室温阴干处理后，在40～60℃温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉；

(2)将步骤(1)所得的超微粉按1g︰(4～12)mL的料液比加入乙酸乙酯，提取1～6h，每0.5～1h搅拌一次，室温静止1～5h后取上清液过滤除去杂质，收集滤渣重复1～3次；将被乙酸乙酯提取过的滤渣置阴凉处晾干，称重后，换成乙醇继续按上述方法提取；合并乙醇提取的上清液，减压浓缩至膏状，获得两头尖小分子提取物；

(3)按质量体积比(g/mL)加入5～10倍的甲醇-水溶液，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到两头尖小分子提取物的样品溶液；

(4)将步骤(3)获得的样品溶液在填料为C18的反相分离色谱柱上进行分离纯化，采用A为超纯水、B为甲醇的二元流动相体系，分离纯化的条件为：0～5min 95％A-5％B(即按体积百分比95％A、5％B配比而成，下同理)等度洗脱，5～15min 87％A-13％B等度洗脱，15～25min 40％A-60％B等度洗脱，25～35min 30％A-70％B等度洗脱；35～45min 25％A-75％B等度洗脱，45～55min 100％B等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集47-48min洗脱液(LTJ-ET-17峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。

作为优选，所述步骤(1)中超微粉碎在-20～4℃温度下进行，时间为5～20min。

作为优选，所述步骤(2)中乙酸乙酯的提取温度为30～70℃温度，乙醇的提取温度为40～70℃温度，进一步优选为65℃。

作为优选，所述步骤(3)中甲醇-水溶液的甲醇与水的体积比为4︰1。

作为优选，所述步骤(3)中有机滤膜的孔径为0.22～0.45μm

作为优选，所述步骤(4)中反相分离色谱柱的直径为50mm、柱长为250mm，C18的粒径为8～10μm。

作为优选，所述步骤(4)中分离纯化时的检测波长为210nm，进样量为1g，流速为80mL/min。

作为优选，所述步骤(2)、(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为温度70℃、真空度0.08Mpa。

本发明进一步提供上述提取得到的两头尖提取物在制备抗肺癌药物或抗肺癌保健食品中的应用。该两头尖提取物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。

按照本领域普通技术人员的理解，两头尖提取物的给药剂量应根据治疗对象的年龄、体重、疾病严重程度等因素而定，一般可以是15-50mg/天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和显著效果：

1、先采用乙酸乙酯对两头尖超微粉进行提取，将其中的小极性物质提取出，达到一次初步分离，再用乙醇提取，有利于目的组分的提取，并且乙酸乙酯和乙醇均可回收再利用，既节约了提取成本，又低毒无污染。

2、采用制备色谱对含有活性组分的小分子提取物进行分离纯化，相对于传统的溶剂萃取法，该制备方法稳定性好，重复性好，制备量大，试剂消耗量小，得到的物质组分批次之间一致性高，分离纯化过程的时间周期短。

3、本方法经过超微粉碎、溶剂提取、过滤杂质、制备色谱分离纯化等一系列步骤后，从两头尖乙酸乙酯提取物中分离得到了五环三萜类物质组分，工艺简单，易于实施，具有制备量大、稳定可控、适用于工业化大规模生产等特点，所得活性组分可用于研发制备抗肺癌药物或抗肺癌保健食品。

4、本发明拓展了抗肺癌药物或抗肺癌保健食品的原料来源，扩大了两头尖的应用范围，使两头尖成为抗肺癌药物或抗肺癌保健食品的有效组分原料，显著提高了两头尖的附加值。

附图说明

图1所示的是本发明各实施例两头尖提取物的制备方法中的色谱分离图；

图2所示的是本发明实施例1得到的两头尖提取物各组分抗肺癌活性的实时监测图，其中(a)为LTJ-ET-1～LTJ-ET-8组分，(b)为LTJ-ET-9～LTJ-ET-15组分，(c)为LTJ-ET-16～LTJ-ET-19组分。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

1、原料、材料：

两头尖采摘自吉林省长春市并经过鉴定；A549细胞由中国医学科学院血液病医院提供。

2、试剂：

超纯水由密立博纯水仪生产；分析级乙醇购自天津市康科德科技有限公司；色谱级甲醇、乙酸乙酯购自Honeywell公司；DMSO购自北京索莱宝科技有限公司；F-12K培养基购自Gibco公司。

3、仪器设备：

超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；C18反相分离色谱柱购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；细胞实时监测仪购自ACEABiosciences Inc(艾森生物科学公司)；细胞培养箱购自英国RS Biotech公司。

实施例1：

本实施例两头尖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)两头尖室温阴干处理后，在60℃下烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎5min，即得两头尖超微粉。

(2)取上述两头尖超微粉1Kg，加入12L分析乙酸乙酯在60℃提取6h，每0.5h搅拌一次。室温静止5h后取上清液过滤除去杂质，收集滤过液，重复3次。将被乙酸乙酯提取过的粉末置阴凉处晾干，称重后，比例换成1Kg：10L，继续按上述方法提取。所得滤过液减压浓缩至膏状并于烘箱65℃干燥处理，即获得两头尖小分子提取物。

(3)加入10倍体积的超纯水、色谱级甲醇混合溶液，超纯水与甲醇的比例为1:4，将步骤(2)所得的小分子提取物进行超声溶解，溶解后过0.22μm有机滤膜，即得到两头尖小分子提取物的样品溶液。

(4)将获得的两头尖小分子提取物的样品溶液在以填料为反向分离材料C18(粒径8～10μm)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为超纯水、B为甲醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～5min，95％A，5％B；5～15min，87％A，13％B；15～25min，40％A，60％B，25～35min，30％A，70％B；35～45min，25％A，75％B；45～55min，0％A，100％B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长：210nm；进样量：1g；流速：80mL/min。按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1(a)所示，收集47-48min洗脱液(LTJ-ET-17峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。

将以上得到的两头尖提取物组分LTJ-ET-17经过制备液相色谱进一步分离纯化及NMR碳氢谱分析，判定主要是含有单糖或者双糖的五环三萜类物质。

实施例2：

本实施例两头尖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)两头尖室温阴干处理后，在40℃烘干脱水，然后在-10℃超微粉碎5min，即得两头尖超微粉。

(2)取上述两头尖超微粉1Kg，加入8.0L分析乙醇在50℃提取4h，每1h搅拌一次，室温静止3h后取上清液过滤除去杂质，收集滤过液，重复3次。将被乙酸乙酯提取过的粉末置阴凉处晾干，称重后，换成乙醇继续按上述方法提取。所得滤过液减压浓缩至膏状并于烘箱65℃干燥处理，即获得两头尖乙醇提取物。

(3)加入8倍体积的超纯水、色谱级甲醇将步骤(2)所得的小分子提取物进行超声溶解，超纯水与甲醇的比例为1:4。溶解后过0.22μm有机滤膜，即得到两头尖乙醇提取物的样品溶液。

(4)将获得的两头尖乙醇提取物的样品溶液在以填料为反向分离材料C18(粒径8～10μm)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为超纯水、B为甲醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～5min，95％A，5％B；5～15min，87％A，13％B；15～25min，40％A，60％B，25～35min，30％A，70％B；35～45min，25％A，75％B；45～55min，0％A，100％B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长：210nm；进样量：1g；流速：80mL/min。按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1(b)所示，收集47-48min洗脱液(LTJ-ET-17峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。

实施例3：

本实施例两头尖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)两头尖室温阴干处理后，在50℃烘干脱水，然后在-15℃超微粉碎10min，即得两头尖超微粉。

(2)取上述两头尖超微粉1Kg，加入5L分析乙醇在40℃提取2h，每0.5h搅拌一次，室温静止4h后取上清液滤过除去杂质，收集滤过液，重复3次。将被乙酸乙酯提取过的粉末置阴凉处晾干，称重后，换成乙醇继续按上述方法提取。所得滤过液减压浓缩至膏状并于烘箱65℃干燥处理，即获得两头尖乙醇提取物。

(3)加入5倍体积的超纯水、色谱级甲醇将步骤(2)所得的小分子提取物进行超声溶解，超纯水与甲醇的比例为1:4。溶解后过0.22μm有机滤膜，即得到两头尖乙醇提取物的样品溶液。

(4)将获得的两头尖乙醇提取物的样品溶液在以填料为反向分离材料C18(粒径8～10μm)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为超纯水、B为甲醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～5min，95％A，5％B；5～15min，87％A，13％B；15～25min，40％A，60％B，25～35min，30％A，70％B；35～45min，25％A，75％B；45～55min，0％A，100％B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长：210nm；进样量：1g；流速：80mL/min。按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1(c)所示，收集47-48min洗脱液(LTJ-ET-17峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。

对比图1中(a)、(b)、(c)，可以得出，本发明两头尖提取物的制备方法重复性好，批次间一致性高，可操作程度强，适合工业化推广生产。

实施例4：抗肺癌活性实验

(1)在5％CO₂，37℃，饱和湿度下，用F-12K(10％FBS+1％PS)培养基培养人肺癌A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。

(2)将细胞实时监测仪放入5％CO₂，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μL F-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2万，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的样品，终浓度设置为50μg/ml。用含0.1％DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，得到在目的组分两头尖提取物作用下的肺癌A549细胞的实时增殖图，试验结果如图2。实验结果说明两头尖乙醇提取物中的组分LTJ-ET-17在浓度为50μg/ml时对肺癌A549细胞的增殖具有较好的抑制作用。因此，本发明目的组分两头尖提取物具有开发成抗肝癌药物的潜力。

两头尖乙醇提取物各试验组分：LTJ-ET-1、LTJ-ET-2、LTJ-ET-3、LTJ-ET-4、LTJ-ET-5、LTJ-ET-6、LTJ-ET-7、LTJ-ET-8、LTJ-ET-9、LTJ-ET-10、LTJ-ET-11、LTJ-ET-12、LTJ-ET-13、LTJ-ET-14、LTJ-ET-15、LTJ-ET-16、LTJ-ET-17、LTJ-ET-18、LTJ-ET-19分别是实施例1中根据图1(a)色谱分离收集的3-4min、4-5min、5.2-6.9min、7.7-9.2min、9.3-10.5min、10.7-12.5min、17.5-18.7min、19-20.5min、22-24.5min、26.5-27.7min、28.5-30.5min、31.5-33min、34-36min、37-38min、38.5-40min、40.2-42min、47-48min、48.1-50min、50.5-53min洗脱液。

本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行抗肝癌活性实验的监测。RTCA实时无标记细胞分析技术是一种基于新型的细胞分析仪而建立的具有实时监测、高信息量、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性等独特优点的检测技术。该细胞分析仪通过嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附和生长程度的改变。在细胞毒性检测中，可实时、直观的反应细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞生物学变化。该技术使得细胞实验变得更加省时高效。

本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行体外抗肺癌活性检测，具有实时监测、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性的优点，可实时、直观得呈现出肺癌细胞增殖、存活、凋亡等细胞生物学变化，使得该细胞实验变得更加省时高效。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种两头尖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)将步骤(1)所得的超微粉按1g︰(4～12)mL的料液比加入乙酸乙酯，提取1～6h，提取温度为30～70℃，每0.5～1h搅拌一次，室温静止1～5h后取上清液过滤，收集滤渣重复提取1～3次；将被乙酸乙酯提取过的滤渣置阴凉处晾干，称重后，换成乙醇继续按上述方法提取；合并乙醇提取的上清液，减压浓缩至膏状，获得两头尖小分子乙醇提取物；

(3)按质量体积比加入5～10倍的甲醇-水溶液，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到两头尖小分子提取物的样品溶液；

(4)将步骤(3)获得的样品溶液在填料为C18的反相分离色谱柱上进行分离纯化，采用A为超纯水、B为甲醇的二元流动相体系，分离纯化的条件为：0～5min95％A-5％B等度洗脱，5～15min87％A-13％B等度洗脱，15～25min40％A-60％B等度洗脱，25～35min30％A-70％B等度洗脱，35～45min25％A-75％B等度洗脱，45～55min100％B等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集47-48min洗脱液，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。

2.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中超微粉碎在-20～4℃温度下进行，时间为5～20min。

3.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中甲醇-水溶液的甲醇与水的体积比为4︰1。

4.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中有机滤膜的孔径为0.22～0.45μm。

5.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中反相分离色谱柱的直径为50mm、柱长为250mm，C18的粒径为8～10μm。

6.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中分离纯化时的检测波长为210nm，进样量为1g，流速为80mL/min。

7.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为温度70℃、真空度0.08Mpa。

8.权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法得到两头尖提取物在制备抗肺癌药物或抗肺癌保健食品中的应用。