CN101907562B - 一种除虫菊酯的快速测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种除虫菊酯含量测定的速测方法，该方法能快速有效地测定干花中除虫菊酯含量。本发明方法为：除虫菊管状花开放50％～99％时，采摘10～20朵的头状花序，置40～80℃烘箱中烘干36～72h，粉碎后称取50～200mg粉末于玻璃离心管中，加2～10mL正己烷，盖好后旋涡混合器上震荡20～40s，转入超声波中水浴5～15min，取出继续震荡20～40s，然后1500～3000转/分、室温20～25℃下离心3～8min，之后吸取0.1～0.5mL上清液，按体积计用无水乙醇稀释40～80倍作为待测液，紫外可见分光光度计在225nm波长下测定其吸光值，并计算除虫菊酯含量。本发明前处理简单、测试费用低；速度快，准确性好，可提高田间育种测定效率和优良基因型的选择效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于除虫菊干花中除虫菊酯含量测定的方法。该方法能快速有效地大量测定除虫菊酯含量，提高除虫菊田间育种效率，为加快除虫菊良种选育和推广应用进程奠定基础。
背景技术
除虫菊(Tanacetum cinerariifolium，syn.Chrysanthemum cinerariifolium，Pyrethrumcinerariifolium)为菊科多年生宿根草本植物，从其头状花序中分离萃取的具有杀虫活性的除虫菊酯为六种化学成分的总称。除虫菊酯对昆虫和蚊蝇等动物能迅速击倒，对哺乳动物及植物无毒无害，同时在自然环境中会慢慢分解成水和C02，因而被国际公认为迄今发现的不污染环境、安全无公害植物源杀虫剂。目前，我国卫生杀虫剂市场中大量应用的是人工合成的拟除虫菊酯，它对人类自身健康和环境均有较大的影响，因此，高效环保的植物源生物杀虫剂——除虫菊酯是确保农业安全生产，提高无公害农产品生产技术水平的首选物质之一，具有广阔的发展前景。
除虫菊作为世界上唯一集约化种植的天然杀虫植物，至今已有150年以上的栽培使用历史。全球市场每年可提供约12000吨的除虫菊干花，而全球每年市场的需求达到了20000吨以上(Hitmi，2000)，因此除虫菊市场一直呈现供不应求的局面，而肯尼亚、澳大利亚、印度、欧洲等国家和地区也很早就积极开展了以提高除虫菊酯含量和产量为目的的相关育种研究(Parlevliet，1974；Bhat et al，1985；Singh et al，1989)。目前全球除虫菊酯的平均含量为1.5％～1.8％，澳大利亚的平均含量则达到了2.4％，甚至获得了含量为4.0％的基因型，而我国除虫菊大量种植的地区在云南，虽然其产品远销韩国、日本、欧洲、北美等国家和地区，但国内除虫菊酯含量仅处于世界平均水平，育种工作也刚刚起步。因此，不断培育具有自主知识产权的高含量除虫菊新优品种培是目前除虫菊育种的首要目标之一，也是今后发展的主要方向。然而，要发展高含量除虫菊品种，不管是分子育种、传统育种(包括杂交育种、群体改良、田间优良单株的大量选择等手段)，甚至无性系繁育与推广，都有大量的样品需要在开花期进行含量测定。
在生产上，有关除虫菊酯加工萃取技术方面的报道很多，多采用超临界二氧化碳萃取(Kiriamiti，2003)，或在有机溶剂萃取的基础上加超声波或微波强化萃取过程(张于弛等，2007；陈寿宏，2003)，但这些方法仅仅只是萃取除虫菊酯，不能测定其含量，而且只适用于工厂车间的大批量生产。在实验室条件下，美国AOAC标准是最早用于除虫菊酯检测的参考标准，但随着色谱技术的发展，出现了薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等检测分析手段(段伟等，2007)，但薄层色谱法只适用与粗定量，准确性较差，后两种方法不仅存在程序复杂，耗时长，净化和前处理步骤繁琐、溶剂消耗量大等问题，而且还需要借助昂贵的仪器设备来进行，这显然不适合于田间大量样品除虫菊酯含量的快速测定。因此，能否快速有效地进行除虫菊酯含量的测定是一项急需解决的配套措施，否则就无法快速将高含量除虫菊与普通除虫菊区分开来，从而影响育种进程和高含量除虫菊基因型的优先利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题旨在提供一种简单有效的除虫菊酯速测方法，以提高育种效率，促进高含量除虫菊良种的繁育和推广。
本发明的技术方案如下：
在除虫菊的开花期，当管状花开放50％～99％时，采摘除虫菊的新鲜头状花序10～20朵，立即置于40～80℃烘箱中烘干36～72h，将烘干后的除虫菊干花用粉碎机粉碎，得到除虫菊干花粉末；称取50～200mg除虫菊干花粉末于玻璃离心管中，立刻加入2～10mL的正己烷，拧紧离心管螺口盖，在旋涡混合器上振荡20～40s，得到除虫菊酯粗提液；粗提液转入数控超声波清洗器(40kHz，220V)中水浴5～15min，取出后继续在旋涡混合器上振荡20～40s，然后1500～3000转/分，室温20～25℃下离心3～8min，得到上清液；用玻璃滴管吸取0.1～0.5mL上清液，按体积计用无水乙醇将所述的上清液稀释40～80倍作为待测液备用，将待测液用紫外可见分光光度计于225nm波长下测定其吸光值(三次重复)，采用如下公式计算除虫菊酯的含量：
干花中除虫菊酯含量(％)＝[(Aextract-Asolvent)*MWavg/εavg*C]*100％。
式中：Aextrac-为提取液的吸光值；Asolvent-为溶剂的吸光值(参比)；MWavg-为平均分子量，值为348；εavg-平均吸光系数，值为37877；C-待测液中干花粉的浓度(质量/体积)
本发明测定除虫菊酯含量的机理是以正己烷为溶剂，结合超声波强化萃取除虫菊酯，并以除虫菊酯六种成分在萃取液中的构成比例为基础，采用分光光度法用特定波长的紫外光测定吸光值，根据平均吸光系数、平均分子量、吸光值以及干花粉的浓度来计算除虫菊酯含量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、仪器设备要求不高，药品用量少，测试费用低；
2、样品净化和前处理过程简单，测定方法简便；
3、样品测试速度快，准确性好，有效的节省了时间；
4、本发明可快速的测定大量除虫菊样品的除虫菊酯含量，并能作为田间除虫菊育种的配套措施，以提高测定效率和优良基因型的选择效率。
具体的发明效果见表1和图2所示。
附图说明
图1是本发明方法的技术流程图。
图2是本发明方法与现有气相色谱法对20个样品的除虫菊酯测定结果比较。
表1本发明与现有几种除虫菊酯测定方法的比较
| 比较项目 | 薄层色谱法 | 气相色谱法 | 高效液相色谱法 | 本发明方法 |
| 原料 | 除虫菊花头，需烘干粉碎 | 除虫菊花头，需烘干粉碎 | 除虫菊花头，需烘干粉碎 | 除虫菊花头，需烘干粉碎 |
| 溶剂 | 只在萃取过程中需要溶剂，消耗量大 | 只在萃取过程中需要溶剂，消耗量大 | 萃取过程和分析检测过程均需要溶剂，溶剂消耗量很大，流动相需达到色谱纯 | 只在萃取过程中需要溶剂，溶剂消耗量少 |
| 萃取时间 | 4～24h | 4～24h | 4～24h | 15～20min |
| 样品前处理 | 过程复杂 | 过程复杂，步骤繁琐 | 过程复杂，步骤繁琐 | 过程简单 |
| 对样品的要求 | 一般 | 样品净化要求高 | 样品净化要求高 | 一般 |
| 仪器设备 | 要求不高 | 要求高，价格昂贵 | 要求高，价格昂贵，需另配价格昂贵的色谱柱， | 要求不高，价格相对气相色谱和液相色谱来说要便宜很多 |
| 单个样品测定所需时间 | 20～40min | 30～60min | 30～60min | 1～2min |
| 测试费用 | 低 | 高 | 高 | 低 |
| 检测灵敏度或准确性 | 只适用于粗定量，准确性差 | 灵敏度高，准确度高 | 灵敏度高，准确度高 | 灵敏度低于气相和液相色谱，准确度与气相色谱相当 |
| 是否适用于大量样品的快速检测 | 否 | 否 | 否 | 是 |
具体实施方式
下面详细说明本发明的实施例。
实施例1
在一块除虫菊种植田中，按“S”形路线随机选取20棵除虫菊单株，做好标记。在除虫菊的开花期，当管状花开放50％～99％时，采摘除虫菊(编号013号)的新鲜头状花序15朵，放置于80℃烘箱中烘干36h，粉碎机粉碎后，称取100mg除虫菊干花粉末于玻璃离心管中，立刻加5mL正己烷，拧紧离心管螺口盖，在旋涡混合器上振荡20s，然后超声波(40KHz，220V；KQ-300DE型数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司生产)水浴8min，取出后继续在旋涡混合器上振荡20s，然后1800转/分、室温20～25℃下离心5min，得到上清液。用玻璃滴管吸取0.4mL的上清液，按体积计用无水乙醇将所述的上清液稀释40倍作为待测液备用，以等体积的正己烷用无水乙醇稀释40倍后作为参比液，利用752型紫外可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司生产)在225nm波长下三次重复测得的平均吸光值为0.642，干花样品中除虫菊酯含量与吸光值的大小、待测液中干花粉的浓度有关，根据它们的相关关系，采用上述发明内容中的计算公式计算除虫菊酯含量。经计算，该单株花头中的除虫菊酯含量为1.18％。
实施例2
根据实施例1的方法和步骤取样，将该样品编号为002号，采摘18朵，放置于60℃烘箱中烘干50h，粉碎机粉碎后，称取50mg除虫菊干花粉末于玻璃离心管中，立刻加5mL正己烷，拧紧离心管螺口盖，在旋涡混合器上振荡30s，然后超声波水浴12min，取出后继续在旋涡混合器上振荡30s，然后2500转/分、室温20～25℃下离心7min，得到上清液。用玻璃滴管吸取0.2mL的上清液，按体积计用无水乙醇将所述的上清液稀释40倍作为待测液备用，以等体积的正己烷用无水乙醇稀释40倍后作为参比液，利用752型紫外可见分光光度计在225nm波长下三次重复测得的平均吸光值为0.525，根据计算公式计算除虫菊酯含量。经计算，该单株花头中的除虫菊酯含量为1.93％。
实施例3
根据实施例1的方法和步骤取样，将该样品编号为006号，采摘20朵，放置于45℃烘箱中烘干40h，粉碎机粉碎后，称取100mg除虫菊干花粉末于玻璃离心管中，立刻加5mL正己烷，拧紧离心管螺口盖，在旋涡混合器上振荡40s，然后超声波水浴15min，取出后继续在旋涡混合器上振荡40s，然后2200转/分、室温20～25℃下离心6min，得到上清液。用玻璃滴管吸取0.3mL的上清液，按体积计用无水乙醇将所述的上清液稀释40倍作为待测液备用，以等体积的正己烷用无水乙醇稀释40倍后作为参比液，利用752型紫外可见分光光度计在225nm波长下进行测定，三次测得的OD值均大于1，则将待测液按体积计用无水乙醇再稀释2倍(即共计稀释80倍)作为新待测液重新测定(参比液同样稀释2倍)，该波长下三次重复测得的平均吸光值为0.629，根据计算公式计算除虫菊酯含量。经计算，该单株花头中的除虫菊酯含量为2.31％。
参考文献
1.陈寿宏.微波协助萃取技术应用于提取天然除虫菊素的工艺研究，农药科学与管理.2003：31-33.
2.段伟，李正国，夏玉先，胡应红，殷红莲.天然除虫菊酯检测方法的研究进展.植物保护.2007：12-16.
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5.Hitmi，A.，Coudret，A.，Barthomeuf，C..The Production of Pyrethrins by Plant Cell and Tissue Cultures ofChrysanthemum cinerariaefolium and Tagetes Species.Biochemistry and Molecular Biology.2000，35：317-337.
6.Kiriamiti H.K.，Camy S.，Gourdon C.，ondoret J.S.Pyrethrin exraction from pyrethrum flowers using carbondioxide.J.of Supercritical Fluids.2003：193-200.
7.Parlevliet，J.E.The genetic variability of the yield components in the Kenyan pyrethrum population.Euphytica..1974，23：377-384.
8.Singh，S.P.，Sharma，J.R..Genetic improvement of pyrethrum.Theor Appl Genet，1989，78：841-846.
Claims (1)
1.一种除虫菊酯的快速测定方法，其步骤如下：
1)在除虫菊的开花期，当管状花开放50％～99％时，采摘除虫菊的新鲜的头状花序10～20朵，立即置于40～80℃烘箱中烘干36～72h，将烘干后的除虫菊干花用粉碎机粉碎，得到除虫菊干花粉末；
2)称取50～200mg除虫菊干花粉末于玻璃离心管中，加入2～10mL的正己烷，拧紧离心管螺口盖，在旋涡混合器上震荡20～40s，得到除虫菊酯粗提液；
3)将步骤2)的除虫菊酯粗提液转入频率为40KHz，电压为220V的超声波清洗器中水浴5～15min，取出后继续在旋涡混合器上震荡20～40s，然后1500～3000转/分，室温20-25℃下离心3～8min，得到上清液；
4)用玻璃滴管吸取0.1～0.5mL上清液，按体积计用无水乙醇将所述的上清液稀释40～80倍作为待测液备用，将待测液置于紫外可见分光光度计中于225nm波长下测定其吸光值，并代入公式，计算得到除虫菊酯含量，公式如下所述：
干花中除虫菊酯含量(％)＝[(Aextract-Asolvent)*MWavg/εavg*C]*100％
式中：Aextract-为提取液的吸光值；
Asolvent-为溶剂的吸光值(参比)；
MWavg-为平均分子量，值为348；
εavg-平均吸光系数，值为37877；
C-待测液中干花粉的浓度(质量/体积)。
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