CN103528914B - 一种花生总脂的提取及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生总脂的提取及测定方法，包括以下步骤：新鲜的花生组织经冷冻干燥获得干组织；称取花生干组织，放入研钵中，加入液氮研磨；加入有机试剂提取，超声混匀，离心分离，保留上层有机相；转移有机相提取液，加入有机试剂和盐溶液，混匀，静置分层，回收下层，置于提脂瓶中，挥干溶剂至恒重，于天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量；采用重量法计算总脂的含量。本发明方法利用相对较少的设备和较为简单的步骤，提取的材料范围广（根、茎、叶和种子），提取耗时短、提取率高，成本低，是一种实验室中方便快捷的花生脂肪提取和测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及花生总脂的提取及测定方法，属于花生油脂提取技术领域。
背景技术
花生是我国重要的油料作物、经济作物和出口创汇作物。我国花生常年种植面积500万hm2左右，总产近1500万t，约占国内油料作物总产的50%。花生总产约55%-60%用于榨油，花生油常年产量230万t左右，占国产食用植物油产量的25%，仅次于菜籽油产量，是国产植物油的第二大来源。
目前实验室中测定花生脂肪含量的方法很多，有传统的有机溶剂提取法和索氏提取法，也有当前广泛使用的荧光染料测定法、傅立叶变换近红外漫反射光谱法和磷酸香草醛法，还有其他的一些方法如：铜试剂法、苏丹黑染色法、核磁共振法、超临界CO2提取法、离子液体提取法等。有机溶剂提取法和索氏提取法操作简单、成本低，但存在所需试剂和样品量大、提取效率低、耗时费力的缺点。荧光染料测定法、傅立叶变换近红外漫反射光谱法、磷酸香草醛法、铜试剂法、 苏丹黑染色法以及核磁共振法所需样品量少、所用时间短，但测定的总脂含量均为相对值。超临界CO2提取法和离子液体提取法提取效率高，所得总脂含量较高，但测定成本较高。因此，传统的有机溶剂提取法和索氏提取法是使用较为普遍的实验室规模的总脂绝对含量的测定方法。
索氏提取法只能提取游离态的脂肪，而对脂蛋白“磷脂”等结合态的脂类则不能完全提取出来。极性的甲醇和非极性的氯仿混合物却能有效地提取结合态脂类，同时也能将磷脂等极性脂质提取出来，从而有效地提取出全部脂类。由于有机溶剂渗透性较差，测定的组织内总脂含量并不是十分准确。因此，可将有机溶剂提取法与细胞破碎方法结合起来以达到更理想的提取效果。目前，细胞破碎的方法主要有研磨破碎法、酸热法和超声波辅助提取法等。研磨破碎法对细胞的破碎率高，但处理时间长。酸热法是向样品中加入一定量的适宜浓度的盐酸，振荡均匀后在室温下放置30min，再沸水浴3min后迅速放置到℃冷冻，该法简单方便、破碎效果好。超声波辅助提取法基本原理是应用超声波强化提取待提取物有效成分，是一种物理破碎过程，具有较高的破碎率。
目前对于花生种子中脂肪提取技术研究较多，而对于花生根、茎和叶等组织的脂肪提取技术的研究还未见报道。本研究发明的花生总脂的提取及测定方法将有机溶剂提取法与研磨破碎法及超声波辅助提取法相结合，提取的材料范围广（根、茎、叶和种子），提取耗时短、提取率高，成本低，是一种实验室中方便快捷的花生脂肪提取和测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供适合实验室操作的方便快捷的花生脂肪提取和测定的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下步骤：
新鲜的花生组织经冷冻干燥获得干组织；称取花生干组织，放入研钵中，加入液氮研磨；加入有机试剂提取，超声混匀，离心分离，保留上层有机相；转移有机相提取液，加入有机试剂和盐溶液，混匀，静置分层，回收下层，置于提脂瓶中，挥干溶剂至恒重，于天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量；采用重量法计算总脂的含量。
具体来说，所述的方法如下：
（1）新鲜的花生组织经冷冻干燥获得干组织；
（2）称取花生干组织，放入研钵中，加入液氮研磨；
（3）加入有机试剂提取，超声混匀，离心分离，保留上层有机相；残渣加入有机试剂，超声混匀，离心分离，保留上层有机相，一共重复3次；
（4）合并有机相提取液转移到分液漏斗中，加入有机试剂和盐溶液，混匀，静置分层，回收下层；
（5）加有机溶剂于原上、中层溶液中再萃取一次，再加有机溶剂于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，置于提脂瓶中，挥干溶剂至恒重，于天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量；
（6）采用重量法计算总脂的含量。
优选地，步骤（1）所述的样品制备是取新鲜的花生根、茎或者叶片，用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织。取新鲜的花生种子，清洗后采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥。
优选地，步骤（2）中采用万用天平准确称取花生根、茎或者叶片干组织0.2g（m），放入研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁。对于花生种子，直接称取0.2g（m）干粉末，进行后续的实验。
优选地，步骤（3）所述的有机试剂为体积比2:1的甲醇-氯仿混合物，第一次提取加入体积为7ml，第二、三、四次加入体积分别为3ml，2ml，1ml；超声波辅助提取的条件为超声波功率300w，超声波频率28kHz，第一次超声时间为10min，第二、三、四次超声时间均为5min；离心条件为20℃，6000r/min转速离心15min。
优选地，步骤（4）所述的有机试剂为氯仿，加入体积为2.5ml；盐溶液为氯化钠溶液，浓度为1%，加入体积为3ml。
优选地，步骤（5）所述的有机试剂为氯仿，加入体积为2.5ml；提脂瓶使用前应在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量（m1）；采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量（m2）。
优选地，步骤（6）所述的采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω = (m2－m1) / m × 100%。
利用本发明提供的花生总脂的提取及测定方法，提取的材料范围广（根、茎、叶和种子），提取耗时短、提取率高，成本低，是一种实验室中方便快捷的花生脂肪提取和测定方法，社会效益和科研价值显著。
具体实施方式
实施例
1
在花生品种花育19种子发育的不同时期取样，从果针下地后10天开始，每隔10天取一次样，共取6次样品。剥掉果壳，保留种子，采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥。采用万用天平称取0.2g（m）干粉末，放入15ml玻璃管中，加入7.0ml甲醇-氯仿（2:1，V:V）提取液，超声（300w，28kHz）10min混匀。6000r/min转速离心15min，采用胶头滴管吸取上层有机相到新的15ml玻璃管中，残渣先后加3ml、2ml、1ml甲醇-氯仿（2:1，V:V），超声5min混匀，6000r/min转速离心15min，保留上层有机相。合并有机相提取液转移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0 ml 1%氯化钠溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层。加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量（m1）。采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量（m2）。采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω = (m2－m1) / m × 100%。得到的花育19种子发育6个阶段的总脂含量分别为17.77%，29.42%，37.25%，48.27%，49.75%和47.97%。
实施例
2
花生品种花育19在16小时光照/8小时黑暗（28°C/22°C）的光照培养箱中生长，待花生幼苗生长到三叶期后进行ABA处理实验。将花生幼苗从土中拔出，将根部小心冲洗干净后直接浸泡到100μM ABA溶液中。在处理的0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h取新鲜叶片，用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织。采用万用天平准确称取花生叶片干组织0.2g（m），放入研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁。加入7.0ml甲醇-氯仿（2:1，V:V）提取液到研钵中，充分转移组织提取液和残渣到15ml玻璃管中，超声（300w，28kHz）10min混匀。6000r/min转速离心15min，采用胶头滴管吸取上层有机相到新的15ml玻璃管中，残渣先后加3ml、2ml、1ml甲醇-氯仿（2:1，V:V），超声5min混匀，6000r/min转速离心15min，保留上层有机相。合并有机相提取液转移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0 ml 1%氯化钠溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层。加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量（m1）。采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量（m2）。采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω = (m2－m1) / m × 100%。得到的花育19叶片ABA处理不同时间段（0h－72h）的总脂含量分别为9.63%，9.90%，10.26%，9.44%，9.22%，9.11%，10.11%，9.13%。
实施例
3
花生品种花育19在16小时光照/8小时黑暗（28°C/22°C）的光照培养箱中生长，待花生幼苗生长到三叶期后进行氯化钠处理实验。将花生幼苗从土中拔出，将根部小心冲洗干净后直接浸泡到200mM 氯化钠溶液中。在处理的0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h取新鲜根，用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织。采用万用天平准确称取花生根干组织0.2g（m），放入研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁。加入7.0ml甲醇-氯仿（2:1，V:V）提取液到研钵中，充分转移组织提取液和残渣到15ml玻璃管中，超声（300w，28kHz）10min混匀。6000r/min转速离心15min，采用胶头滴管吸取上层有机相到新的15ml玻璃管中，残渣先后加3ml、2ml、1ml甲醇-氯仿（2:1，V:V），超声5min混匀，6000r/min转速离心15min，保留上层有机相。合并有机相提取液转移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0 ml 1%氯化钠溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层。加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量（m1）。采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量（m2）。采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω = (m2－m1) / m × 100%。得到的花育19根氯化钠处理不同时间段（0h－72h）的总脂含量分别为 7.38%，7.50%，9.60%，4.81%，4.47%，4.81%，5.13%和7.44%。
Claims (3)
1.一种花生总脂的提取及测定方法，包括以下步骤：
（1）新鲜的花生组织经冷冻干燥获得干组织；
（2）称取花生干组织，放入研钵中，加入液氮研磨；
（3）加入有机试剂提取，超声混匀，离心分离，保留上层有机相；残渣加入有机试剂，超声混匀，离心分离，保留上层有机相，一共重复3次；所述有机试剂为体积比2:1的甲醇-氯仿混合物，第一次提取加入体积为7ml，第二、三、四次加入体积分别为3ml，2ml，1ml；
（4）合并有机相提取液转移到分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和盐溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层，并将回收的下层置于提脂瓶中；
（5）加氯仿于原上、中层溶液中进行第二次萃取，静置后溶液分三层，回收下层；再加氯仿于第二次萃取后的原上、中层溶液中再萃取一次，静置后溶液分三层，回收下层；合并下层液，置于提脂瓶中，挥干溶剂至恒重，于天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量；
（6）采用重量法计算总脂的含量；
步骤（1）的具体步骤是取新鲜的花生根、茎或者叶片，用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织；取新鲜的花生种子，清洗后采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥；
步骤（2）中采用万用天平准确称取花生根、茎或者叶片干组织m，且m=0.2g，放入研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁，对于花生种子，直接称取干粉末m，且m=0.2g，进行步骤（3）及其后续的实验；
步骤（3）所述的超声混匀的条件为超声波功率300w，超声波频率28kHz，第一次超声时间为10min，第二、三、四次超声时间均为5min，离心条件为20℃，6000r/min转速离心15min；
步骤（4）所述的盐溶液为氯化钠溶液，浓度为1%，加入体积为3ml。
2.根据权利要求1所述的一种花生总脂的提取及测定方法，其特征在于，步骤（5）所述的氯仿加入体积为2.5ml；提脂瓶使用前应在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量m1；采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重，把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量m2。
3.根据权利要求2所述的一种花生总脂的提取及测定方法，其特征在于，步骤（6）所述的采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω = (m2－m1) / m × 100%。
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