CN104502475B - 一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，包括以下步骤：新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织；称取干样品，放入研钵中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入钳口顶空瓶中，采用玻璃棒碾碎；加入试剂I和II，超声混匀，然后加入试剂III，或再加入内标物，进行水浴反应；反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶液吸出转入离心管中，静置；离心分离，吸取上清液，用于上机测定；采用归一化法或内标法计算脂肪酸组分的含量。本发明简化了样品前处理过程，操作简便、快捷，极大的缩短了试验时间，成本低，需要的样品量少，具有很好的通用性，是一种实验室中简便、准确的花生脂肪酸提取和测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及提取和测定花生脂肪酸的简便方法，属于脂肪酸提取技术领域。
背景技术
花生是我国重要的油料作物、经济作物和出口创汇作物。花生籽粒油脂的品质是由脂肪酸的组成决定的。花生脂肪酸主要由棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生烯酸、山俞酸和二十四碳烷酸等八种成分组成，其中油酸和亚油酸为主，约占80％，为人体健康所必需，如油酸在人体脂类代谢中具有降低有害胆固醇，但保持有益胆固醇水平的功能，从而减缓动脉粥样硬化，有效预防冠心病等心脑血管疾病的发生。另外，油酸含量高，抗氧化能力强，产品不易氧化酸败，货架寿命较长，耐储能力也强。因此，对花生品种进行脂肪酸组成及含量的分析是非常必要的。
传统的脂肪酸分析方法主要分为三个部分：脂肪提取，脂肪酸的衍生化处理以及脂肪酸的气相色谱上机分离鉴定。首先用索氏提取法或浸提法从样品中提取粗脂肪，提取出的粗脂肪还要经过多个步骤的甲酯化处理，抽提分层后才能进行气相色谱分析，整个过程需要进行几个小时。传统方法工序繁琐、用时长，并且样品用量大。
脂肪酸甲酯化是气相色谱法测定脂肪酸必不可少的步骤之一，其方法较多，如酸催化酯化、碱催化酯化、有机碱催化酯化等。酸催化酯化催化效果较好并具有普遍的适用性，该方法适合所有的酯交换反应和游离脂肪酸的甲酯化。比较常使用的酸主要有BF3，HC1和H2S04的甲醇溶液，其中的BF3的甲醇溶液(12％-14％)应用最广泛是非常有效的试剂。但是三氟化硼有毒，对人体毒害较大。酸催化酯化可以应用于无水和含水样品的甲酯化。但是，所有酸催化酯化反应都需要进行加热(50-l00℃)，且甲酯化时间较长，一般需40-60min。
在样品中没有相当量的游离脂肪酸存在的情况下，可以用碱催化酯化。油脂酸值在碱催化反应过程中一定要尽可能的低(酸值<1)，否则游离脂肪酸易和催化剂中碱反应导致生成较多脂肪酸钠和水而降低酯化率；反应原料(包括催化剂)都必须保证无水，水会消耗催化剂而降低催化效率，还会使甘油三酯水解。经常使用的的催化溶液有NaOH、KOH和NaOCH3的甲醇溶液。
一些强的有机碱(如各种羟基季铵、三甲基锍羟基化物和四甲基胍)也可使类脂酯交换和游离脂肪酸成盐。有机碱的脂肪酸盐在GC的进样口处更易分解成脂肪酸甲酯，使得酯化的和游离脂肪酸的分析一步完成。此外，重氮甲烷是一种高效、快速的酯交换催化剂，也可用于游离脂肪酸和磷酸酯的酯化，但因操作条件苛刻、使用寿命短而不被广泛采用。
最早的脂肪酸的甲酯化方法是先用碱性溶液皂化分离，然后再加BF3-CH3OH或者酸化的醇等进行酯化。由于皂化反应速度慢，整个皂化-酯化消耗的时间长，所以后来发展了直接酯交换法。直接酯交换反应速度比皂化反应快，水解和酯化反应一步进行，只需要一种试剂，反应速度不仅快而且操作也简单。但是要获得精确的定量结果，必须要优化酯交换条件。
本发明通过对花生脂肪酸的提取和甲酯化过程进行条件优化，大大简化了样品前处理过程。具有操作简便、快捷的优点，极大的缩短了试验时间，节约了大量的人力、物力，使繁琐的工作变得简单；需要的样品量很少，可达到微量检测；改进后的方法还可用于大样本的脂肪酸检测；具有很好的通用性，也可应用于酵母、藻类、其它植物等材料的脂肪酸检测，同样取得了满意的结果。
发明内容
本发明的目的是提供适合实验室操作的简便、准确的花生脂肪酸提取和测定的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下步骤：
新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织；称取干样品，放入研钵中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入钳口顶空瓶中，采用玻璃棒碾碎；加入试剂I和II，超声混匀，然后加入试剂III，或再加入内标物，进行水浴反应；反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶液吸出转入离心管中，静置；离心分离，吸取上清液，用于上机测定；采用归一化法或内标法计算脂肪酸组分的含量。
具体来说，所述的方法如下：
(1)取新鲜的花生根、茎、叶或花，用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织。称取0.01g(m)干样品，放入研钵中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入钳口顶空瓶中，采用玻璃棒碾碎。取新鲜的花生种子，清洗后采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥。称取0.01g(m)干样品，放入钳口顶空瓶中。
(2)向5ml钳口顶空瓶中加入甲醇850μl和盐酸100μl浸泡样品，超声混匀。超声波功率300w，超声波频率28kHz，超声时间为10min。然后加入2,2-二甲氧丙烷50μl，或再加入内标物储备液1mg/ml十九碳酸，85℃水浴反应1h。甲酯化过程中每隔10min振荡一次。
(3)反应完成冷却后，加入正己烷0.5ml和1％氯化钠溶液1ml，混匀，将溶液吸出转入离心管中，静置10min。25℃，4000r/min转速离心5min。吸取上清液，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul正己烷溶解定容，涡旋2～3s，滤膜过滤后转入进样瓶中，上机测定。计算脂肪酸组分的含量。
优选地，步骤(3)中，采用归一化法计算脂肪酸组分的相对含量，即对各组分色谱峰面积积分，以各组分的峰面积总和为100％，脂肪酸组分的百分含量以占峰面积总和的百分比表示。
优选地，步骤(3)中，采用内标法计算脂肪酸组分的绝对含量。准确称取样品试样，加入十九碳酸作为内标物，根据试样和内标物的质量比及相应的色谱峰面积之比，按下式可求组分的质量分数：Wi＝Ai×Ms/(As×M×RRF)。i为待测定样品中组分，Wi为组分i的质量分数，Ms为内标使用量，M为样品质量，Ai和As分别为组分i和内标物的峰面积，RRF为相对影响因子。
具体实施方式
实施例1
在花生品种花育19种子发育的不同时期取样，从果针下地后(DAP)25天开始，每隔7天取一次样，共取6次样品。剥掉果壳，保留种子，采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥获得干组织。采用万用天平准确称取花生干组织0.01g(m)，放入已经被酒精清洗并烘干的5ml钳口顶空瓶中，加入850μl的甲醇和100μl的盐酸，超声(300w，28kHz)10min混匀。然后向瓶中加入50μl 2,2-二甲氧丙烷。用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，85℃水浴反应1h。甲酯化过程中每隔10min振荡一次。反应结束后，取出冷却至室温。用启盖器启盖后，向瓶中加入1ml 1％的NaCl溶液和0.5ml正己烷，混匀，将上层溶液吸出转入10ml烘干的离心管中，静置10分钟。25℃，4000r/min转速离心5分钟，吸取上清液，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中。如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul正己烷溶解定容，涡旋2～3s，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。采用归一化法计算脂肪酸组分的相对含量，即对各组分色谱峰面积积分，以各组分的峰面积总和为100％，脂肪酸组分的百分含量以占峰面积总和的百分比表示。发现(表1)，在花生种子发育过程中，果针下地39天之前，花育19棕榈酸和硬脂酸含量变化不大，39天之后，硬脂酸含量逐渐升高，棕榈酸含量逐渐降低。油酸含量的变化规律与亚油酸相反，说明油酸含量的增加可能由于生成亚油酸脂肪酸的减少。
表1花育1 9种子不同发育时期的脂肪酸组成
实施例2
花生品种花育19在16小时光照/8小时黑暗(28℃/22℃)的光照培养箱中生长。3种花生组织包括根、茎和叶取自萌发后生长两周的三叶期幼苗，花取自萌发后生长约60d的花生植株。样品用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织。采用万用天平准确称取花生干组织0.01g(m)，放入研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁。加入850μl的甲醇到研钵中，充分转移组织提取液和残渣到5ml钳口顶空瓶中。再加入100μl的盐酸到瓶中，超声(300w，28kHz)10min混匀。然后向瓶中加入50μl 2,2-二甲氧丙烷，用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，85℃水浴反应1h。甲酯化过程中每隔10min振荡一次。反应结束后，取出冷却至室温。用启盖器启盖后，向瓶中加入1ml 1％的NaCl溶液和0.5ml正己烷，混匀，将上层溶液吸出转入10ml烘干的离心管中，静置10分钟。25℃，4000r/min转速离心5分钟，吸取上清液，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中。如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul正己烷溶解定容，涡旋2～3s，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。采用归一化法计算脂肪酸组分的相对含量，即对各组分色谱峰面积积分，以各组分的峰面积总和为100％，脂肪酸组分的百分含量以占峰面积总和的百分比表示。发现(表2)，棕榈酸(C16:0)，硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1Δ9)和亚油酸(C18:2Δ9,12)为主要的脂肪酸成分。其中，油酸和亚油酸占种子总脂肪酸含量的80％左右，占其它组织的60％左右。在根和茎中亚油酸含量较高，在叶片、种子和花中油酸含量较高。
表2花育1 9不同组织的脂肪酸组成
实施例3
先配制内标物储备液。称取10mg内标物十九碳酸(购自阿拉丁)，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入异戊醇至刻度，摇匀，转移至密封的螺口试管中，冷藏保存，即得内标物储备液。采用万用天平称取野生型拟南芥(Col-0)成熟风干种子0.01g(m)，放入已经被酒精清洗并烘干的5ml钳口顶空瓶中，用已经清洗的干净玻璃棒碾碎种子。加入850μl的甲醇和100μl的盐酸到瓶中，超声(300w，28kHz)10min混匀，并将玻璃棒冲洗干净。然后向瓶中加入50μl2,2-二甲氧丙烷，再加入36μl浓度为1mg/ml的十九碳酸内标物储备液。用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，85℃水浴反应1h。甲酯化过程中每隔10min振荡一次。反应结束后，取出冷却至室温。用启盖器启盖后，向瓶中加入1ml 1％的NaCl溶液和0.5ml正己烷，混匀，将上层溶液吸出转入10ml烘干的离心管中，静置10分钟。25℃，4000r/min转速离心5分钟，吸取上清液，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中。如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul正己烷溶解定容，涡旋2～3s，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。采用内标法进行绝对定量分析。准确称取样品试样，加入十九碳酸作为内标物，根据试样和内标物的质量比及相应的色谱峰面积之比，按下式可求组分的质量分数：Wi＝Ai×Ms/(As×M×RRF)。i为待测定样品中组分，Wi为组分i的质量分数，Ms为内标使用量，M为样品质量，Ai和As分别为组分i和内标物的峰面积，RRF为相对影响因子。研究发现，月桂酸(C12:0)的绝对含量为0.4ug/mg，肉豆蔻酸(C14:0)的绝对含量为0.55ug/mg，棕榈烯酸(C16:1Δ9)的绝对含量为2.38ug/mg，棕榈酸的绝对含量为20.17ug/mg，亚麻酸(C18:3Δ9,12,15)的绝对含量为0.24ug/mg，亚油酸的绝对含量为107.14ug/mg，油酸的绝对含量为70.02ug/mg，硬脂酸的绝对含量为6.18ug/mg，花生烯酸(C20:1Δ11)的绝对含量为43.22ug/mg，花生酸(C20:0)的绝对含量为3.52ug/mg，芥酸(C22:1Δ13)的绝对含量为2.59ug/mg。表明我们测定的样品中亚油酸绝对含量最高，其次为油酸，月桂酸、肉豆蔻酸和亚麻酸含量较低。
Claims (3)
1.一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，包括以下步骤：
（1）新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织；
（2）称取干样品，放入研钵中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入钳口顶空瓶中，采用玻璃棒碾碎；
（3）向钳口顶空瓶中加入试剂I和II浸泡样品，超声混匀；然后加入试剂III，或再加入内标物储备液，进行水浴反应；
（4）反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶液吸出转入离心管中，静置；
（5）离心，吸取上清液，用滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定；
（6）采用归一化法或内标法计算脂肪酸组分的含量；
步骤（1）所述的样品是新鲜的花生根、茎、叶、花或者种子；
取新鲜的花生根、茎、叶或花，用灭菌的蒸馏水清洗3 次，经冷冻干燥后获得干组织；
取新鲜的花生种子，清洗后采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥；
步骤（2）中采用万用天平称取的干样品量为0.01g；
所用的钳口顶空瓶大小为5 ml；
步骤（3）所述的试剂I为甲醇，加入体积为850μl；试剂II为盐酸，加入体积为100μl；
超声波辅助提取的条件为超声波功率300w，超声波频率28kHz，超声时间为10min；
试剂III为2,2-二甲氧丙烷，加入体积为50μl；
内标物储备液为1mg/ml的十九碳酸；
用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，水浴反应的温度为85℃，反应时间为1h；甲酯化过程中每隔10min振荡一次；
步骤（4）所述的有机试剂为正己烷，加入体积为0.5ml；盐溶液为氯化钠溶液，浓度为1%，加入体积为1ml；静置的时间为10 min。
2.根据权利要求1所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于，所述的内标物储备液配制方法为：称取10 mg内标物十九碳酸，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入异戊醇至刻度，摇匀，转移至密封的螺口试管中，冷藏保存。
3.根据权利要求1 所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于：步骤（5）所述的离心条件为25℃，4000r/min 转速离心5min ；
如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul正己烷溶解定容，涡旋 2~3 s，用0.22 um 滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS 上机测定。
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