BE1023199B1 - Procede de dosage d'acides gras a chaînes courtes volatils - Google Patents

Abstract

Procédé de dosage comprenant: - amenée d'un échantillon comprenant des acides gras a chaînes courtes volatils et des contaminants constitutifs de l'échantillon biologique, - addition audit échantillon d'un étalon interne dans une quantité prédéterminée avec formation d'un mélange, - homogénéisation dudit mélange jusqu'a obtenir un mélange homogène, - chauffage d'au moins une partie dudit mélange homogene dans un récipient hermétique avec une volatilisation desdits acides gras dans un espace de tête dudit récipient, - injection, après ladite étape de chauffage, d'au moins une partie de ladite phase gazeuse dans une colonne capillaire, et - mesure de la quantité desdits acides gras et comparaison desdites quantités mesurées desdits acides gras avec des valeurs prédéterminées de quantités d'acides gras correspondant, et comprenant en outre une étape d'addition audit échantillon biologique d'une solution saline saturée pour former ledit mélange.

Description

“PROCEDE DE DOSAGE D’ACIDES GRAS A CHAÎNES COURTES VOLATILS”

La présente invention se rapporte à un procédé de dosage d’acides gras à chaînes courtes volatils (AGCCV) provenant d’un échantillon biologique humain, de préférence de selle humain. Généralement, les AGCCV peuvent regrouper des acides monocarboxyliques de C1 à C6. Ils constituent l’essentiel des anions organiques présents dans le côlon et sont absorbés par la muqueuse colique. Le butyrate, base conjuguée de l’acide butyrique (C4), est la source d’énergie principale des colonocytes, situées sur la paroi du côlon transverse.

Les colonocytes sont les cellules épithéliales du côlon et absorbent véritablement cette source de butyrate par une réaction chimique d’oxydation du butyrate. Pour cette raison, le butyrate est le principal apporteur d’énergie des colonocytes.

Le métabolisme du butyrate par les colonocytes se déroule dans le compartiment mitochondrial correspondant à une usine énergétique où se déroulent des réactions indispensables au bon fonctionnement de l’organisme. Le butyrate est donc dégradé par la voie couramment appelée ß-oxydation qui produit du butyryl-CoA qui va ensuite rejoindre les dernières étapes de la voie susdite afin de finalement produire de l’acétyl-CoA. Ce dernier est utilisé dans le cycle de Krebs ou dans la voie de la cétogenèse. Le cycle de Krebs permet de fournir de l’énergie sous forme d’ATP aux cellules de tout l’organisme. La voie de cétogenèse consiste également à utiliser l’acétyl-CoA. Cette voie a lieu lorsque les acides gras ne peuvent être transformés sous forme de citrate et ne pourront donc pas entrer dans le cycle de Krebs mais seront utilisés en tant que substrat dans la voie de la cétogenèse. La formation de corps cétonique constitue également un apport énergétique qui pourra être utilisé dans tout l’organisme. L’apport énergétique utilisé ensuite par les cellules de tout l’organisme dépend donc fortement de cette source de butyrate.

Il a ainsi été constaté qu’un des effets bénéfiques du butyrate serait la prévention et l’inhibition des cancers colorectaux.

Le butyrate pourrait également intervenir dans la pathologie du syndrome de Crohn. En effet, il module l’expression de HLA-DR et des molécules HLA de classe I sur les cellules épithéliales coliques ce qui permet d’augmenter des antigènes contenus dans la lumière colique.

De plus, il a été observé que le butyrate inhibe la prolifération de cellules tumorales, permet d’agir comme agent différenciant et permet de moduler l’immunité anti-tumorale.

De plus, le butyrate pourrait présenter un effet prophylactique ou thérapeutique, notamment comme antidiarrhétique, dans le traitement des colites de diversion, de la rectocolite ulcéro-hémorragique, des pochites, des rectites radiques. A ce jour, le mécanisme du butyrate n’est pas encore bien maîtrisé.

De manière plus générale, les AGCCV agissent comme facteurs de signalisation dans diverses voies métaboliques connues, par exemple celle de la régulation de la synthèse du cholestérol et du glucose.

Des déficiences en AGCCV ont été observées dans le cadre de cancers colorectaux, de l’obésité, d’allergies ou du diabète de type II.

Il est donc avantageux de pouvoir identifier et doser les AGCCV afin de pouvoir mettre en évidence un déficit ou un surplus en AGCCV, ce qui pourrait conduire à contribuer au diagnostic de nombreuses pathologies.

Pour ce faire, il est ainsi nécessaire de pouvoir isoler et doser correctement les AGCCV d’intérêts provenant d’un échantillon biologique issu de l’organisme humain comme le sang, l’urine ou les selles.

Il existe actuellement plusieurs procédés qui permettent d’isoler les AGCCV. Les procédés actuels peuvent avoir recours à une série de colonnes chromatographiques pour tenter d’isoler les AGCCV de leur milieu. Il est indispensable d’avoir ainsi recours à une première colonne chromatographique pour d’abord séparer les AGCCV entre eux. Malheureusement, cette première étape chromatographique entraîne les AGCCV d’intérêt mais également de nombreux contaminants biologiques issus de l’échantillon biologique.

Ensuite, il est alors nécessaire de faire appel à une deuxième colonne chromatographique pour séparer chaque acide gras d’intérêt des contaminants présents dans l’échantillon biologique. Cette deuxième séparation nécessite l’utilisation de divers types de solvants organiques afin de filtrer et ainsi tenter de séparer les AGCCV dudit échantillon biologique de départ.

Malheureusement, les procédés actuels ne sont pas suffisamment sélectifs et nécessitent l’utilisation de plusieurs colonnes qui rendent la séparation complexe et coûteuse. De plus, il a été observé que l’utilisation d’autant d’étapes ne permettent pas d’isoler efficacement et de manière fiable les AGCCV des contaminants présents dans l’échantillon biologique. En effet, l’ajout de solvant pour séparer chaque AGCCV des contaminants issus de l’échantillon biologique conduit à l’obtention d’un mélange qui comprend à la fois les AGCCV et des contaminants polluant le mélange. De plus, l’utilisation d’autant d’étapes et de solvants peut conduire à une perte d’acide gras en cours de traitement ce qui est à éviter dès lors que ceci affecte la précision du dosage et le rendement de la purification. L’utilisation de solvants organiques rend par ailleurs ces types de procédé peu attrayant sur le marché.

De plus, les méthodes de dosage actuelles nécessitent l’utilisation de plusieurs prétraitements de l’échantillon dont l’objectif est d’éviter autant que possible la présence de contaminants qui perturbent la mesure ou encrassent le dispositif utilisé. L’accumulation de résidus dans un dispositif de dosage constitue une réelle limitation pour l’utilisateur qui est contraint de stopper le dosage afin de remplacer la pièce défectueuse ou de nettoyer la pièce encrassée ou bouchée. Ceci n’est pas acceptable lorsque le dispositif doit doser une série d’échantillons humains en continu.

Il existe un réel besoin de fournir un procédé de dosage aisé et fiable qui permette d’isoler et de doser de manière reproductible et efficacement les AGCCV provenant d’un échantillon biologique humain, en particulier de selle humain, tout en facilitant la mise en œuvre du procédé. L’invention a pour but de pallier les inconvénients de l’état de la technique en procurant un procédé de dosage plus simple et économique qui permette de séparer sélectivement, efficacement et de manière reproductible et fiable les AGCCV présents dans un échantillon biologique, en particulier de selle humain.

Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant l’invention un procédé qui comprend les étapes suivantes : - amenée d’un échantillon biologique humain, en particulier de selle humain, comprenant des acides gras à chaînes courtes volatils et des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique, - addition audit échantillon d’un étalon interne dans une quantité prédéterminée avec formation d’un mélange, - homogénéisation dudit mélange jusqu’à obtenir un mélange homogène, - chauffage d’au moins une partie dudit mélange homogène dans un récipient hermétique avec une volatilisation desdits acides gras à chaînes courtes volatils en phase gazeuse dans un espace de tête dudit récipient pour séparer ceux-ci desdits contaminants constitutifs de l’échantillon biologique, - injection, après ladite étape de chauffage, d’au moins une partie de ladite phase gazeuse comprenant lesdits acides gras à chaînes courtes volatils et ledit étalon interne dans une colonne capillaire d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse, - mesure de la quantité desdits acides gras à chaînes courtes volatils dans ladite au moins une partie dudit mélange homogène et comparaison desdites quantités mesurées desdits acides gras à chaînes courtes avec des valeurs prédéterminées de quantités d’acides gras à chaînes courtes correspondant pour doser lesdits acides gras à chaînes courtes, - caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape d’addition audit échantillon biologique d’une solution saline saturée pour former ledit mélange.

Dans le cadre de la présente invention, il a été constaté que le procédé de dosage fourni permet d’efficacement séparer les AGCCV des contaminants provenant de l’échantillon biologique humain de départ ce qui contribue à faciliter le dosage de chaque AGCCV.

Le procédé de dosage proposé dans la présente invention nécessite la formation d’un mélange homogène qui contient, de préférence en milieu aqueux, à la fois les AGCCV d’intérêts et les contaminants constitutifs de l’échantillon biologique ainsi que l’étalon interne. Le mélange ainsi obtenu est prêt à être chauffé pour séparer les AGCCV d’intérêts dudit mélange homogène.

Pour cette raison, le procédé selon l’invention est rendu aisé puisqu’il ne nécessite pas d’étapes additionnelles et complexes de prétraitements. En effet, ce mélange homogène peut déjà être utilisé pour séparer principalement les AGCCV dudit mélange homogène par l’application de l’étape de chauffage.

Ainsi, le mélange homogène est contenu dans un récipient fermé hermétiquement qui est chauffé à une température prédéterminée ce qui permet de volatiliser principalement les AGCCV d’intérêt en phase gazeuse dans un espace de tête du récipient.

Deux phases sont ainsi formées, une phase solide-liquide contenant des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique humain et éventuellement des résidus solides et une phase gazeuse comprenant les AGCCV volatilisés ainsi que l’étalon interne dans une quantité prédéterminée.

Ainsi, les espèces non volatiles restent dans le fond du récipient ce qui permet d’isoler les AGCCV d’intérêts desdits contaminants constitutifs de l’échantillon biologique.

De cette façon, le passage des AGCCV dans l’espace de tête en phase gazeuse dans le récipient fermé hermétiquement permet de les isoler efficacement et de manière reproductible des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique qui ne sont pas ou fort peu entraînés dans la phase gazeuse.

Ainsi, le procédé selon l’invention est rendu aisé car i fournit un mélange homogène dont les AGCCV peuvent aisément être séparés des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique humain. Le procédé proposé selon l’invention est également sélectif en ce qu’il permet de réduire considérablement la présence d’espèces non volatiles ou de contaminants dans la phase gazeuse obtenue après l’étape de chauffage.

Lorsque la phase gazeuse est chargée en AGCCV et en étalon interne, une partie de cette phase gazeuse est prélevée et injectée, par exemple au moyen d’une seringue, directement dans une colonne capillaire chromatographique afin de séparer chacun des AGCCV en fonction de leur affinité pour la phase mobile.

Le procédé selon l’invention a donc recours à un dispositif de chromatographie en phase gazeuse pourvue d’un espace de tête afin de doser les AGCCV provenant d’un échantillon biologique humain. Le couplage entre un dispositif de chromatographie en phase gazeuse et un injecteur de type « espace de tête » permet d’extraire et d’injecter une partie de la phase gazeuse comprenant principalement et essentiellement les AGCCV d’intérêts à doser ainsi que l’étalon interne.

Ainsi, le Chromatogramme obtenu permet d’aisément doser les AGCCV d’intérêt grâce à l’obtention de pics lisibles qui sont suffisamment séparés les uns des autres.

Il a ainsi été constaté que le procédé selon l’invention permet de diminuer la présence de contaminants dans la partie du mélange homogène à doser tout en ne nécessitant pas d’un prétraitement conséquent avant dosage. En effet, il n’est plus nécessaire de conditionner l’échantillon avant le dosage ou de réaliser plusieurs prétraitements afin de pouvoir doser les AGCCV d’intérêts, ce qui rend le procédé simple, pratique, efficace, attractif et peu coûteux. La formation de ce mélange ne nécessite plus de devoir séparer au préalable les AGCCV entre eux.

Il a également été constaté de manière surprenante que la combinaison entre le passage principalement des AGCCV dans l’espace de tête du récipient fermé hermétiquement et la colonne capillaire permet d’isoler et de doser efficacement, rapidement, de manière fiable et reproductible les AGCCV provenant d’un échantillon biologique humain en diminuant considérablement le risque d’encrassement de la colonne capillaire suite au passage non souhaité d’espèce résiduelles solides ou non volatiles à l’intérieur de celle-ci.

Le procédé suivant l’invention propose ainsi une méthode qui implique des conditions chromatographiques particulièrement adaptées au dosage des AGCCV provenant d’un échantillon biologique humain, de préférence de selle humain.

Avantageusement, le procédé suivant l’invention comprend une étape d’addition audit échantillon biologique d’une solution saline saturée pour former ledit mélange. L’addition de cette solution saline saturée permet d’augmenter la volatilité des espèces volatiles présentes dans le mélange homogène, plus particulièrement des AGCCV.

De préférence, ladite solution saline est de l’hydrogénosulfate de sodium.

De préférence, ladite étape de chauffage de ladite au moins une partie dudit mélange homogène est réalisé à une température comprise entre 50 et 110 °C, de préférence entre 70 et 95 °C.

De manière avantageuse, ladite étape de chauffage est réalisée dans un four, de préférence un four d’un dispositif de chromatographie.

Selon un mode préféré, ladite étape de chauffage est réalisée durant une période de temps comprise entre 15-30 minutes, de préférence 15-25 minutes.

Avantageusement, ladite étape de chauffage est réalisée jusqu’à ce que ledit mélange homogène atteigne une température comprise entre 50 et 110 °C, de préférence entre 70 et 95 °C, plus préférentiellement encore entre 75 et 86 °C pour réaliser ladite volatilisation.

De préférence, ledit étalon interne est une solution d’acide 2-éthyle-butyrique.

Avantageusement, l’étape d’injection est réalisée est réalisée à une première température comprise entre 50 et 70 °C, de préférence entre 55 et 65 °C. L’étape d’injection est avantageusement réalisée à l’aide d’une aiguille ou d’une seringue prévue à cet effet.

Avantageusement encore, ladite étape d’injection est réalisée en augmentant progressivement ladite première température comprise entre 50 et 70 °C, de préférence entre 55 et 65 °C jusqu’à une deuxième température comprise entre 170-210 °C, de préférence entre 180-195 °C.

Préférentiellement, ladite augmentation progressive de température est réalisée dans un espace de temps compris entre 5 et 25 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes, plus préférentiellement encore entre 10 et 17 minutes.

Plus préférentiellement encore, ladite colonne présente une longueur comprise entre 20 et 40 m, de préférence entre 25 et 35 m.

Selon un mode préféré, ladite colonne capillaire présente un diamètre compris entre 0,2-0,5 mm, de préférence égal à 0,25 mm.

Avantageusement, ladite colonne capillaire présente une épaisseur de film comprise entre 0,1-0,35 pm, de préférence allant de 0,20-0,25 pm.

De manière préférée, le procédé suivant l’invention comprend le dosage des acides gras à chaînes courtes qui regroupent les acides monocarboxyliques choisis dans le groupe constitué de l’acide lactique, de l’acide pyruvique, de l’acide caprique, de l’acide caproïque, de l’acide caprylique, de l’acide levulinique, de l’acide laurique, de l’acide acétique, de l’acide propionique, de l’acide iso-butyrique, de l’acide n-butyrique, de l’acide iso-valérique et de l’acide n-valérique. D’autres formes de réalisation du procédé suivant l’invention sont indiquées dans les revendications annexées. L’invention a aussi pour objet une utilisation d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse en espace de tête pour doser des acides gras à chaînes courtes volatils à l’état gazeux et provenant d’un échantillon biologique humain, en particulier de selle humain. D’autres formes de réalisation de l’utilisation suivant l’invention sont indiquées dans les revendications annexées. D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins annexés.

Ainsi, selon le procédé suivant la présente invention, un échantillon biologique humain, de préférence de selle humain, qui comprend des AGCCV tels que l’acide acétique, l’acide propionique, l’acide iso-butyrique, l’acide n-butyrique, l’acide iso-valérique et l’acide n-valérique, ainsi que des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique est mélangé à un étalon interne.

Cet étalon interne présente des comportements physicochimiques semblables à ceux des AGCCV à doser ce qui permet de réaliser une mesure fiable et comparable. En effet, les perturbations subies par les AGCCV le seront également pour l’étalon interne. Ainsi, chaque pic obtenu sur le Chromatogramme pourra être comparé au pic correspondant à l’étalon interne qui aura subit les mêmes perturbations lors du dosage.

Le dosage des AGCCV provenant de l’échantillon biologique humain peut être rendu aisé par l’addition audit échantillon biologique humain de départ contenant également l’étalon interne d’une solution saline saturée afin de former un mélange dont les AGCCV passeront plus aisément en phase gazeuse lors de l’étape de chauffage.

Lorsque le mélange est obtenu, celui-ci est homogénéisé de façon à obtenir un mélange homogène. L’homogénéisation peut être obtenue en vortexant le mélange.

Le mélange homogène est introduit dans un récipient fermé hermétiquement de telle sorte à créer un espace de tête.

Dans le cadre de la présente invention, l’expression « espace de tête » doit être comprise comme étant l’espace créé entre le haut du récipient fermé hermétiquement et la surface du mélange. Cet espace peut ainsi être chargé en analytes lors d’un dégagement gazeux.

Ensuite, une étape de chauffage de ce mélange homogène contenus dans le récipient fermé hermétiquement permet de faire passer principalement les AGCCV dans l’espace de tête et donc en phase gazeuse.

Cette volatilisation vise principalement les AGCW plus particulièrement l’acide lactique, l’acide pyruvique, l’acide caprique, l’acide caproïque, l’acide caprylique, l’acide levulinique, l’acide laurique, l’acide acétique, l’acide propionique, l’acide iso-butyrique, l’acide n-butyrique, l’acide iso-valérique et l’acide n-valérique. L’étape de chauffage permet de faire passer principalement les AGCCV, espèces d’intérêts, en phase gazeuse ce qui a pour effet de les séparer de manière fiable et reproductible desdits contaminants constitutifs de l’échantillon biologique humain.

Le risque d’avoir des impuretés dans la phase gazeuse est considérablement réduit et permet de fournir ainsi un procédé efficace et peu coûteux par l’utilisation d’un seul et unique mélange sans avoir réellement besoin d’étapes spécifiques de prétraitement de l’échantillon de départ. L’étape de chauffage susvisée peut être réalisée dans un four qui présente une température comprise entre 50 et 110°C, de préférence 70 et 95 °C.

Il a été constaté qu’il est nécessaire de chauffer le mélange jusqu’à ce que ce dernier atteigne une température comprise entre 50 et 110 °C, de préférence entre 70 et 95 °C, plus préférentiellement encore entre 75 et 86 °C afin d’obtenir la volatilisation des AGCCV.

Le procédé suivant l’invention permet de doser les AGCCV en ayant recours à une technique de chromatographie en phase gazeuse couplée à un espace de tête.

De façon générale, un dispositif de chromatographie en phase gazeuse comprend un gaz vecteur formant la phase mobile, un injecteur, un four, une colonne chromatographique, un détecteur, de préférence un détecteur à ionisation de flamme, et un dispositif de traitement de données.

Le principe de la chromatographie étant de pouvoir séparer plusieurs analytes en fonction de leur affinité pour la phase mobile. Chaque analyte présentera un temps de rétention qui lui est propre.

Le principe consiste à ajouter lors de l’analyse un étalon interne dans la colonne. Cet étalon présente un comportement physicochimique similaire aux analytes devant être dosés. De cette façon, toutes les perturbations observées pour l’étalon interne le seront également pour les analytes d’intérêts ce qui permet d’obtenir une mesure fiable.

De plus, cet étalon interne est ajouté en une quantité connue et permet ainsi de mesurer par comparaison la quantité de chaque analyte.

Un tel dispositif permet en finalité d’obtenir un Chromatogramme qui comprend plusieurs pics où chaque pic correspond à une réponse d’un analyte particulier, en l’espèce chaque AGCCV. L’analyse consiste à mesurer l’aire sous le pic ou la hauteur du pic de façon à comparer cette donnée avec celle de l’étalon interne.

Ensuite, la comparaison de ces données avec une courbe d’étalonnage qui comprend des valeurs prédéterminées d’AGCCV à différentes concentration permet de doser chaque analyte.

Dans le cadre de la présente invention, un dispositif de chromatographie en phase gazeuse en espace de tête est utilisé.

Ce dispositif comprend les éléments précités mais est caractérisé par un système d’injection spécifique en ce qu’il prévoit de récupérer le mélange contenant les analytes à doser dans un espace de tête d’un récipient hermétiquement fermé. Comme indiqué ci-avant, le chauffage à une température prédéterminé permet d’obtenir une volatilisation des AGCCV en phase gazeuse, en l’occurrence dans l’espace de tête.

Les contaminants constitutifs de l’échantillon biologique étant plus lourd que les AGCCV, ceux-ci sont maintenus dans le récipient au fond du mélange avec les espèces non volatiles. L’injection consiste ensuite à prélever à l’aide d’une aiguille une partie de cette phase gazeuse chargée en AGCCV dans la colonne capillaire chromatographique de façon à séparer chaque AGCCV entre eux dans le but de les doser. L’introduction d’une partie de la phase gazeuse chargée principalement en AGCCV dans la colonne capillaire chromatographique permet de réaliser une séparation sélective entre chaque analyte à doser sans risquer une contamination de la phase gazeuse par des espèces non-volatiles ou encore un encrassement de la colonne capillaire, ce qui serait préjudiciable pour le dosage.

Il a été constaté que l’utilisation d’une colonne capillaire permet de faciliter la séparation des AGCCV d’intérêts de manière reproductible.

Ainsi, il est possible d’analyser une série d’échantillons en continu sans perdre en qualité de mesure et sans risquer de stopper le fonctionnement du dispositif pour remplacer une pièce bouchée ou encrassée.

Un dispositif de chromatographie en espace de tête (ou « Headspace ») est connu sous la marque TurboMatrix de la société PerkinElmer ou la marque Agilent « Headpsace » de l’entreprise Agilent Technologies.

Dans le cadre de la présente invention, la colonne capillaire chromatographique peut être une colonne capillaire de type Elite-FFAP (0,25 mm x 30 m x 0,25 pm).

De manière avantageuse, le four présente une température comprise entre 60 et 100 °C.

La température de transfert est comprise est préférentiellement supérieure à la température du four afin d’éviter une condensation prématurée des analytes à doser. La température du four est comprise dans une plage allant de 100 à 180 °C , de préférence de 120 à 145°C, ou égale à 135 °C.

De manière avantageuse, l’aiguille utilisée pour injecter la phase gazeuse dans la colonne capillaire présente une température comprise entre 80 et 120 °C, de préférence égale à 105 °C.

Encore plus préférentiellement, la durée de l’analyse est comprise entre 10 et 30 minutes, de préférence égale à 20 minutes.

Le procédé suivant l’invention permet ainsi de doser des AGCCV dans un échantillon biologique, en particulier de selle humain.

Lorsqu’un écart (déficit ou excès d’AGCCV) est constaté, il est possible d’utiliser les résultats obtenus pour mettre en évidence une pathologie comme expliqué dans le préambule de la présente invention. EXEMPLE 1 0.25 g d’un échantillon biologique de selle humain comprenant de l’acide acétique, l’acide propionique, l’acide iso-butyrique, l’acide n-butyrique, l’acide iso-valérique et l’acide n-valérique et des contaminants constitutifs de l’échantillon de selle humain est mélangé avec 2,0 ml d’une solution d’hydrogénosulfate de sodium à 62 % et avec 30 pi d’une solution aqueuse d’acide 2-éthyle-butyrique (1,263x10'3 mol/l), étalon interne.

Le mélange obtenu est ensuite vortexé durant 10 minutes à 2500 tpm jusqu’à obtention d’un mélange homogénéisé.

Le mélangé homogénéisé est ensuite transféré dans un flacon fermé hermétiquement de sorte à créer un espace de tête au-dessus du mélange.

Chauffage de la solution à une température de 85°C jusqu’à ce que le mélange atteigne une température située entre 80 et 90°C pour obtenir une volatilisation des AGCCV qui seront ainsi séparés des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique.

Cette volatilisation permet de faire passer les analytes d’intérêts, en l’occurrence l’acide acétique, l’acide propionique, l’acide iso-butyrique, l’acide n-butyrique, l’acide iso-valérique et l’acide n-valérique en phase gazeuse, dans l’espace de tête du récipient fermé hermétiquement. EXEMPLE 2

Le mélange homogénéisé tel que repris à l’exemple 1 est obtenu et introduit dans un four d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse en espace de tête. Le four présente une température de 85 °C. L’aiguille du dispositif de chromatographie extrait alors une partie de la phase gazeuse contenant les AGCCV et l’injecte dans une colonne capillaire de chromatographie. L’aiguille présente une température de 105 °C. Lors du transfert de la phase gazeuse, la température est de 135 °C.

La colonne capillaire chromatographique étant de préférence une colonne capillaire de marque Elite-FFAP (0„25 mm x 30 m, 0,25 pm.

De cette façon, chaque AGCCV présentant une certaine affinité avec le gaz porteur sortira de la colonne capillaire avec un temps de rétention qui lui est propre.

Au bout de la colonne capillaire se situe un détecteur, de préférence un détecteur à ionisation de flamme, qui permet de détecter les analytes en sortie de colonne capillaire.

Une analyse quantitative et qualitative peut alors être réalisée pour doser chaque AGCCV présent dans l’échantillon de selle humain de départ.

Il est donc nécessaire de comparer les données mesurées avec des valeurs prédéterminées de quantité de AGCCV correspondant pour doser lesdits AGCCV.

Il est bien entendu que la présente invention n’est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé de dosage d’acides gras à chaînes courtes volatils, ledit procédé comprenant les étapes : - amenée d’un échantillon biologique de selle humain, comprenant des acides gras à chaînes courtes volatils et des contaminants constitutifs de l’échantillon biologique, - addition audit échantillon d’un étalon interne dans une quantité prédéterminée avec formation d’un mélange, - homogénéisation dudit mélange jusqu’à obtenir un mélange homogène, - chauffage d’au moins une partie dudit mélange homogène dans un récipient hermétique avec une volatilisation desdits acides gras à chaînes courtes volatils en phase gazeuse dans un espace de tête dudit récipient pour séparer ceux-ci desdits contaminants constitutifs de l’échantillon biologique, - injection, après ladite étape de chauffage, d’au moins une partie de ladite phase gazeuse comprenant lesdits acides gras à chaînes courtes volatils et ledit étalon interne dans une colonne capillaire d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse, - mesure de la quantité desdits acides gras à chaînes courtes volatils dans ladite au moins une partie dudit mélange homogène et comparaison desdites quantités mesurées desdits acides gras à chaînes courtes avec des valeurs prédéterminées de quantités d’acides gras à chaînes courtes correspondant pour doser lesdits acides gras à chaînes courtes, et - comprenant une étape d’addition audit échantillon biologique d’une solution saline saturée pour former ledit mélange, et - caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape d’addition audit échantillon biologique d’une solution saline saturée pour former ledit mélange.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite solution saline est une solution d’hydrogénosulfate de sodium.
3. 3. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite étape de chauffage de ladite au moins une partie dudit mélange homogène est réalisé à une température comprise entre 50 et 110 °C, de préférence entre 70 et 95 °C.
4. 4. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel ladite étape de chauffage est réalisée durant une période de temps comprise entre 15-30 minutes, de préférence 15-25 minutes.
5. 5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel ladite étape de chauffage est réalisée jusqu’à ce que ledit mélange homogène atteigne une température comprise entre 50 et 110 °C, de préférence entre 70 et 95 °C, plus préférentiellement encore entre 75 et 86 °C pour réaliser ladite volatilisation.
6. 6. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit étalon interne est une solution d’acide 2-éthyle-butyrique.
7. 7. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite étape d’injection est réalisée à une première température comprise entre 50 et 70 °C, de préférence entre 55 et 65 °C.
8. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite étape d’injection est réalisée en augmentant progressivement ladite première température comprise entre 50 et 70 °C, de préférence entre 55 et 65 °C jusqu’à une deuxième température comprise entre 170-210 °C, de préférence entre 180-195 °C.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel ladite augmentation progressive de température est réalisée dans un espace de temps compris entre 5 et 25 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes, plus préférentiellement encore entre 10 et 17 minutes.
10. 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel ladite colonne capillaire présente une longueur comprise entre 20 et 40 m, de préférence entre 25 et 35 m.
11. 11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel ladite colonne capillaire présente un diamètre compris entre 0,2-0,5 mm, de préférence égal à 0,25 mm.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ladite colonne capillaire présente une épaisseur de film comprise entre 0,1-0,35 pm, de préférence allant de 0,20-0,25 pm.
13. 13. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant le dosage des acides gras à chaînes courtes qui regroupent les acides monocarboxyliques choisis dans le groupe constitué de l’acide lactique, de l’acide pyruvique, de l’acide caprique, de l’acide caproïque, de l’acide caprylique, de l’acide levulinique, de l’acide laurique, de l’acide acétique, de l’acide propionique, de l’acide iso-butyrique, de l’acide n-butyrique, de l’acide iso-valérique et de l’acide n-valérique.
14. 14. Utilisation d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse en espace de tête pour doser des acides gras à chaînes courtes volatils à l’état gazeux et provenant d’un échantillon biologique humain, en particulier de selle humain.