CN104297381A - 一种游离的中链脂肪酸的测定方法 - Google Patents
一种游离的中链脂肪酸的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种游离的中链脂肪酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品和混合脂肪酸标样分别经萃取，气相色谱分离，质谱检测，即可；所述的待测样品包括待测物和内标溶液；所述的待测物为原料乳、液体乳制品或固体乳制品；当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品还包括氯化钠；当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品还包括水；所述的混合脂肪酸标样包括外标溶液和内标溶液；所述的外标溶液为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种的乙醇水溶液；所述的内标溶液为庚酸的乙醇水溶液；所述的中链脂肪酸为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种。该方法操作简单、准确度高、精密度高和萃取效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种游离的中链脂肪酸的测定方法。
背景技术
原料乳和乳制品中的游离脂肪酸对其品质产生重要影响，尤其对乳制品风味的作用影响最大。游离脂肪酸作为乳及乳制品的风味物质及风味物质前体，一部分来自于原料固有成分，比如原料乳中的乳脂肪即三甘油酯混合物，就是由长链脂肪酸和中短链脂肪酸构成。还有一部分游离脂肪酸可能是在加工制造过程中产生，比如干酪的成熟过程中，乳脂肪会在脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，赋予干酪强烈的特征性风味；在被嗜冷菌污染的液态乳(特别是货架保质期较长的超高温灭菌乳)中，脂肪水解产生的游离脂肪酸含量增加，最终造成产品出现脂肪氧化、酸败等不良风味。
原料乳和乳制品中游离的中链脂肪酸主要有己酸(C6H12O2)、辛酸(C8H16O2)和癸酸(C10H20O2)。这三种脂肪酸都具有明显而强烈的风味特征：己酸的主体风味描述为汗臭味、腐臭味、山羊味等，风味阈值为0.093-10mg/L；辛酸的主体风味描述为辛辣味、山羊味，风味阈值为0.91-19mg/L；癸酸的主体风味描述为哈喇味、山羊味，风味阈值为2.2-102mg/L。这些中链脂肪酸对原料乳和乳制品的风味影响非常明显，因此，无论是从原料乳及液体乳制品的质量安全控制、还是干酪等发酵乳制品的风味形成角度，中链游离脂肪酸的含量都应在乳品生产制造过程中予以监测。
现行国家标准GB5413.27-2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》中对乳品中的脂肪酸测定方法进行了描述：①使用盐酸-甲醇(由乙酰氯与甲醇反应得到)使样品中的游离脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，经气相色谱仪分离检测，外标法定量。②游离脂肪酸在三氟化硼催化下进行甲酯化反应，经气相色谱柱分离，以氢火焰离子化检测器检测，外标法定量。这两种方法都是使用衍生化试剂将脂肪酸甲酯化，然后通过气相色谱分离，使用外标法定量。常用测定脂肪酸的衍生化方法虽然可以一次性检出多种脂肪酸(包括短链、中链和长链N端脂肪酸)，但步骤繁琐、重复性和回收率相对不高，在实验室和工业检测中具有一定局限性。
顶空固相微萃取-气相色谱质谱法联用(HS-SPME-GC/MS)技术以其快速、方便、高效的优点，成为原料乳和乳制品中游离的中链脂肪酸的常见定量检测方法。顶空固相微萃取(Headspace solid phase micro-extraction,HS-SPME)技术集采样、萃取、浓缩、进样为一体，结合气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)可以实现对原料乳和乳制品等复杂混合物中风味化合物的定量分析。游离的中链脂肪酸在固相微萃取装置的涂层(萃取头)中经过萃取、浓缩、解吸后，在气相色谱-质谱联用仪中分离并鉴定。但是由于游离的中链脂肪酸沸点低，在原料乳和乳制品中含量少，在极性萃取头上吸附能力相对较弱，需要对萃取头类型、萃取平衡条件、吸附时间、萃取温度、盐(氯化钠)浓度等萃取条件，以及色谱-质谱等分离条件进行优化，以增加中链脂肪酸在萃取头上的单位时间吸附量以及仪器对目标脂肪酸的分离度；而且SPME-GC/MS一般使用峰面积归一法进行半定量，得到的数据只是目的中链脂肪酸占所有风味物质的百分比，是一个比例数据。这些检测与定量方法都限制了现有方法的准确性与精密度。
综上所述，实验室和工业检测中急需一种操作简单、准确度高、精密度高和萃取效率高的游离的中链脂肪酸的测定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的甲酯化等衍生化方法和HS-SPME-GC/MS方法中操作繁琐、准确度低、精密度低和萃取效率低等缺陷而提供了一种原料乳和乳制品中游离的中链脂肪酸的测定方法，该方法操作简单、准确度高、精密度高和萃取效率高，适用于实验室检测和样品监控。
本发明提供了一种游离的中链脂肪酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品和混合脂肪酸标样分别经萃取，气相色谱分离，质谱检测，即可；
所述的待测样品包括待测物和内标溶液；所述的待测物为原料乳、液体乳制品或固体乳制品；当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品还包括氯化钠；当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品还包括水；所述的混合脂肪酸标样包括内标溶液和外标溶液；所述的外标溶液为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种的乙醇水溶液；所述的内标溶液为庚酸的乙醇水溶液；所述的中链脂肪酸为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种。
本发明中，所述的液体乳制品为本领域常规的各种液体乳制品，所述的液体乳制品优选为灭菌乳和/或发酵乳；所述的固体乳制品为本领域常规的各种固体乳制品，所述的固体乳制品优选为干酪和/或干酪制品。
本发明中，所述的水优选蒸馏水。
本发明中，如果所述的待测物为原料乳或液体乳制品，所述的待测物与所述的内标溶液的体积比优选10:1～103:1，进一步优选50:1～150:1，更进一步优选100:1；所述的待测物与所述的氯化钠的体积质量比优选1mL/g～10mL/g，进一步优选3mL/g～8mL/g，更进一步优选5mL/g；所述的待测样品的制备优选恒温振荡平衡，进一步优选60℃振荡平衡30分钟；所述的振荡优选在顶空瓶中进行。
本发明中，如果所述的待测物为固体乳制品，所述的待测物与所述的水的质量体积比优选0.01g/mL～1g/mL，进一步优选0.05g/mL～0.5g/mL，更进一步优选0.1g/mL；所述的水与所述的内标溶液的体积比优选10:1～103:1，进一步优选50:1～150:1，更进一步优选100:1；所述的固体乳制品优选预先处理成小块；所述的待测样品的制备优选恒温振荡平衡，进一步优选60℃振荡平衡45分钟；所述的振荡优选在顶空瓶中进行。
本发明中，所述的混合脂肪酸标样中所述的外标溶液和所述的内标溶液的体积比优选10:1～103:1，进一步优选50:1～150:1，更进一步优选100:1；所述的混合脂肪酸标样的制备优选在顶空瓶中进行。
本发明中，所述的外标溶液中所述的乙醇水溶液优选5％(v/v)乙醇水溶液。
本发明中，所述的外标溶液中所述的己酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选10mg/L～200mg/L，进一步优选45mg/L～60mg/L，更进一步优选51.6mg/L；所述的己酸的纯度优选为色谱级。
本发明中，所述的外标溶液中所述的辛酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选10mg/L～200mg/L，进一步优选45mg/L～60mg/L，更进一步优选51.2mg/L；所述的辛酸的纯度优选为色谱级。
本发明中，所述的外标溶液中所述的癸酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选10mg/L～200mg/L，进一步优选45mg/L～60mg/L，更进一步优选51.9mg/L；所述的癸酸的纯度优选为色谱级。
本发明中，所述的内标溶液中所述的庚酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选0.1mg/mL～20mg/mL，进一步优选0.5mg/mL～5mg/mL，更进一步优选1mg/mL；所述的庚酸的纯度优选为色谱级。
本发明一较佳实施例中，当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品由待测物、内标溶液和氯化钠组成。
本发明一较佳实施例中，当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品由待测物、内标溶液和水组成。
本发明一较佳实施例中，所述的混合脂肪酸标样由内标溶液和外标溶液组成。
本发明中，所述的萃取优选固相微萃取；所述的固相微萃取优选顶空固相微萃取；所述的固相微萃取的萃取头优选聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取头，进一步优选Supelco公司生产的65μm的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取头；所述的固相微萃取的萃取头优选在250℃下老化0.5h；所述的固相微萃取的恒温振荡平衡时间优选15分钟～60分钟，进一步优选30分钟。
本发明中，所述的气相色谱的条件优选如下：毛细管柱采用Varian公司生产的VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；载气为He，流速为1mL/min；色谱柱起始柱温为40℃(保持4min)，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min；进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
本发明中，所述的质谱条件优选如下：电子轰击离子源(EI电离)，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z20～200。
本发明中，较佳的定性方法如下：将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的质谱与Nist谱库中的质谱对比；或者，将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的保留时间和质谱，与混合脂肪酸标样在相同的GC-MS条件下测得的保留时间和质谱对比。
本发明中，较佳的定量方法如式(1)所示：
式中：
mi：待测样品中目标脂肪酸的含量，单位为毫克每升(mg/L)或毫克每百克(mg/100g)；
As：混合脂肪酸标样中内标物的峰面积；
Ai：待测样品中目标脂肪酸的峰面积；
Asi：待测样品中内标物的峰面积；
Ar：混合脂肪酸标样中目标脂肪酸的峰面积；
mr：混合脂肪酸标样中目标脂肪酸含量，单位为毫克每升(mg/L)。
其中，所述的目标脂肪酸为己酸、辛酸或癸酸；所述的内标物为庚酸。毫克每升(mg/L)与毫克每百克(mg/100g)可根据溶液的密度近似于水的密度1g/ml进行换算。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：操作简单、准确度高、精密度高和萃取效率高，适用于实验室检测和样品监控。
附图说明
图1为己酸标准曲线(外标法)。
图2为辛酸标准曲线(外标法)。
图3为癸酸标准曲线(外标法)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
(1)标准溶液的配制
目标脂肪酸标准溶液：准确称取1g的三种目标脂肪酸(纯度为色谱级)，分别配制成1L的母液贮存于4℃冰箱备用。混合标准溶液即以该母液稀释适当梯度混合而成，使用前新鲜配制。
内标溶液：准确称取1g庚酸(纯度为色谱级)，配制成1L的溶液贮存于4℃冰箱备用。
(2)样品处理
取5mL巴氏灭菌乳样品A置于15mL顶空瓶中，加入1g氯化钠和50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
混合脂肪酸标样：分别取己酸、辛酸、癸酸标准溶液配制成混合标准溶液，混标中己酸、辛酸、癸酸浓度分别为51.6mg/L、51.2mg/L、51.9mg/L。取该混合标准溶液5ml置于15mL顶空瓶中，加入50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
(3)固相微萃取
待已装入样品的顶空瓶在60℃振荡平衡30分钟后，将已经老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取头装入固相微萃取装置，然后插入顶空瓶顶空处萃取，萃取时间30分钟。
(4)气相色谱质谱法
气相色谱条件：毛细管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；载气为He，流速为1ml/min。色谱柱起始柱温为40℃(保持4min)，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
质谱条件：电子轰击离子源(EI电离)，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z20～200。
(5)定性及定量方法
定性：将目标化合物的质谱与Nist谱库中的质谱对比，同时目标脂肪酸在与待测样品相同的GC-MS条件下分析标准样品得到的保留时间和质谱对比定性。
定量：以庚酸为内标物，定量方法为内标法。
样品中目标脂肪酸的含量按式(1)计算：本实施例中，通过计算得到巴氏灭菌乳样品A中己酸含量为13.35mg/L，辛酸含量为2.60mg/L，癸酸含量为2.13mg/L。
实施例2
(1)标准溶液的配制
目标脂肪酸标准溶液：准确称取1g的三种目标脂肪酸(纯度为色谱级)，分别配制成1L的母液贮存于4℃冰箱备用。混合标准溶液即以该母液稀释适当梯度混合而成，使用前新鲜配制。
内标溶液：准确称取1g庚酸(纯度为色谱级)，配制成1L的溶液贮存于4℃冰箱备用。
(2)样品处理
取5mLUHT灭菌乳样品B置于15mL顶空瓶中，加入1g氯化钠和50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
混合脂肪酸标样：分别取己酸、辛酸、癸酸标准溶液配制成混合标准溶液，混标中己酸、辛酸、癸酸浓度分别为51.6mg/L、51.2mg/L、51.9mg/L。取该混合标准溶液5ml置于15mL顶空瓶中，加入50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
(3)固相微萃取
待已装入样品的顶空瓶在60℃振荡平衡30分钟后，将已经老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取头装入固相微萃取装置，然后插入顶空瓶顶空处萃取，萃取时间30分钟。
(4)气相色谱质谱法
气相色谱条件：毛细管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；载气为He，流速为1ml/min。色谱柱起始柱温为40℃(保持4min)，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
质谱条件：电子轰击离子源(EI电离)，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z20～200。
(5)定性及定量方法
定性：将目标化合物的质谱与Nist谱库中的质谱对比，同时目标脂肪酸在与待测样品相同的GC-MS条件下分析标准样品得到的保留时间和质谱对比定性。
定量：以庚酸为内标物，定量方法为内标法。
样品中目标脂肪酸的含量按式(1)计算：本实施例中，通过计算得到UHT灭菌乳样品B中己酸含量为10.41mg/L，辛酸含量为2.33mg/L，癸酸含量为1.78mg/L。
实施例3
(1)标准溶液的配制
目标脂肪酸标准溶液：准确称取1g的三种目标脂肪酸(纯度为色谱级)，分别配制成1L的母液贮存于4℃冰箱备用。混合标准溶液即以该母液稀释适当梯度混合而成，使用前新鲜配制。
内标溶液：准确称取1g庚酸(纯度为色谱级)，配制成1L的溶液贮存于4℃冰箱备用。
(2)样品处理
取5mL原料乳样品C置于15mL顶空瓶中，加入1g氯化钠和50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
混合脂肪酸标样：分别取己酸、辛酸、癸酸标准溶液配制成混合标准溶液，混标中己酸、辛酸、癸酸浓度分别为51.6mg/L、51.2mg/L、51.9mg/L。取该混合标准溶液5ml置于15mL顶空瓶中，加入50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
(3)固相微萃取
待已装入样品的顶空瓶在60℃振荡平衡30分钟后，将已经老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取头装入固相微萃取装置，然后插入顶空瓶顶空处萃取，萃取时间30分钟。
(4)气相色谱质谱法
气相色谱条件：毛细管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；载气为He，流速为1ml/min。色谱柱起始柱温为40℃(保持4min)，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
质谱条件：电子轰击离子源(EI电离)，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z20～200。
(5)定性及定量方法
定性：将目标化合物的质谱与Nist谱库中的质谱对比，同时目标脂肪酸在与待测样品相同的GC-MS条件下分析标准样品得到的保留时间和质谱对比定性。
定量：以庚酸为内标物，定量方法为内标法。
样品中目标脂肪酸的含量按式(1)计算：本实施例中，通过计算得到原料乳样品C中己酸含量为16.16mg/L，辛酸含量为4.07mg/L，癸酸含量为1.54mg/L。
实施例4
(1)标准溶液的配制
目标脂肪酸标准溶液：准确称取1g的三种目标脂肪酸(纯度为色谱级)，分别配制成1L的母液贮存于4℃冰箱备用。混合标准溶液即以该母液稀释适当梯度混合而成，使用前新鲜配制。
内标溶液：准确称取1g庚酸(纯度为色谱级)，配制成1L的溶液贮存于4℃冰箱备用。
(2)样品处理
取5mL发酵乳样品D置于15mL顶空瓶中，加入1g氯化钠和50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
混合脂肪酸标样：分别取己酸、辛酸、癸酸标准溶液配制成混合标准溶液，混标中己酸、辛酸、癸酸浓度分别为51.6mg/L、51.2mg/L、51.9mg/L。取该混合标准溶液5ml置于15mL顶空瓶中，加入50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
(3)固相微萃取
待已装入样品的顶空瓶在60℃振荡平衡30分钟后，将已经老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取头装入固相微萃取装置，然后插入顶空瓶顶空处萃取，萃取时间30分钟。
(4)气相色谱质谱法
气相色谱条件：毛细管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；载气为He，流速为1ml/min。色谱柱起始柱温为40℃(保持4min)，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
质谱条件：电子轰击离子源(EI电离)，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z20～200。
(5)定性及定量方法
定性：将目标化合物的质谱与Nist谱库中的质谱对比，同时目标脂肪酸在与待测样品相同的GC-MS条件下分析标准样品得到的保留时间和质谱对比定性。
定量：以庚酸为内标物，定量方法为内标法。
样品中目标脂肪酸的含量按式(1)计算：本实施例中，通过计算得到发酵乳样品D中己酸含量为7.55mg/L，辛酸含量为3.46mg/L，癸酸含量为0.50mg/L。
实施例5
(1)标准溶液的配制
目标脂肪酸标准溶液：准确称取1g的三种目标脂肪酸(纯度为色谱级)，分别配制成1L的母液贮存于4℃冰箱备用。混合标准溶液即以该母液稀释适当梯度混合而成，使用前新鲜配制。
内标溶液：准确称取1g庚酸(纯度为色谱级)，配制成1L的溶液贮存于4℃冰箱备用。
(2)样品处理
取0.5g预先处理成小块的干酪样品E置于15mL顶空瓶中，加入5ml蒸馏水和50μL内标溶液浸没样品，立即旋紧瓶盖。
混合脂肪酸标样：分别取己酸、辛酸、癸酸标准溶液配制成混合标准溶液，混标中己酸、辛酸、癸酸浓度分别为51.6mg/L、51.2mg/L、51.9mg/L。取该混合标准溶液5ml置于15mL顶空瓶中，加入50μL内标溶液，立即旋紧瓶盖。
(3)固相微萃取
待已装入样品的顶空瓶在60℃振荡平衡45分钟后，将已经老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取头装入固相微萃取装置，然后插入顶空瓶顶空处萃取，萃取时间30分钟。
(4)气相色谱质谱法
气相色谱条件：毛细管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；载气为He，流速为1ml/min。色谱柱起始柱温为40℃(保持4min)，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
质谱条件：电子轰击离子源(EI电离)，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z20～200。
(5)定性及定量方法
定性：将目标化合物的质谱与Nist谱库中的质谱对比，同时目标脂肪酸在与待测样品相同的GC-MS条件下分析标准样品得到的保留时间和质谱对比定性。
定量：以庚酸为内标物，定量方法为内标法。
样品中目标脂肪酸的含量按式(1)计算：本实施例中，通过计算得到干酪样品E中己酸含量为17.47mg/100g，辛酸含量为4.22mg/100g，癸酸含量为6.79mg/100g。
效果实施例1
分别称取0.526g己酸、0.529g辛酸、0.518g癸酸，分别于1L容量瓶中用5％(v/v)乙醇水溶液定容后配制成526mg/L己酸溶液、529mg/L辛酸溶液和518mg/L癸酸溶液。
表1 脂肪酸溶液稀释倍数
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 | |
| 己酸 | 2 | 3.33 | 5 | 10 | 50 |
| 辛酸 | 2 | 3.33 | 5 | 10 | 50 |
| 癸酸 | 2 | 3.33 | 5 | 10 | 50 |
如表1所示，将上述溶液按一定稀释倍数配制成一系列梯度浓度样品，经固相微萃取，气相色谱分离，质谱检测，绘制外标法标准曲线。
外标法如式(2)所示的方法定量：
式中：
mi：待测样品中目标脂肪酸的含量，单位为毫克每升(mg/L)或毫克每百克(mg/100g)；
Ai：待测样品中目标脂肪酸的峰面积；
Ar：混合脂肪酸标样中目标脂肪酸的峰面积；
mr：混合脂肪酸标样中目标脂肪酸含量，单位为毫克每升(mg/L)。
其中，所述的目标脂肪酸为己酸、辛酸或癸酸。所述的内标物为庚酸。毫克每升(mg/L)与毫克每百克(mg/100g)可根据溶液的密度近似于水的密度1g/ml进行换算。
表2 外标法的浓度梯度及峰面积数据(峰面积单位：108Mcounts×min；浓度单位：mg/L)
| 物质 | 峰面积 | 浓度 | 物质 | 峰面积 | 浓度① | 物质 | 峰面积 | 浓度② |
| 己酸 | 0 | 0 | 己酸 | 0.81 | 10.52 | 己酸 | 2.53 | 52.6 |
| 辛酸 | 0 | 0 | 辛酸 | 1.08 | 10.58 | 辛酸 | 3.67 | 52.9 |
| 癸酸 | 0 | 0 | 癸酸 | 0.93 | 10.38 | 癸酸 | 1.84 | 51.9 |
| 物质 | 峰面积 | 浓度③ | 物质 | 峰面积 | 浓度④ | 物质 | 峰面积 | 浓度⑤ |
| 己酸 | 5.93 | 105.2 | 己酸 | 8.22 | 157.8 | 己酸 | 10.90 | 263 |
| 辛酸 | 6.11 | 105.8 | 辛酸 | 8.65 | 158.7 | 辛酸 | 12.21 | 264.5 |
| 癸酸 | 3.86 | 103.8 | 癸酸 | 6.11 | 155.7 | 癸酸 | 11.7 | 259.5 |
据上表数据拟合标准曲线，己酸标准曲线y＝0.042x+0.54；辛酸标准曲线y＝0.045x+0.768；癸酸标准曲线y＝0.043x-0.142。其中，y为峰面积，x为浓度。
表3 不同定量方法的精密度数据(峰面积单位：108Mcounts×min；浓度单位：mg/L)
a外标法
| 样品6 | 峰面积 | 浓度 | 样品7 | 峰面积 | 浓度 | 样品8 | 峰面积 | 浓度 |
| 己酸 | 3.33 | 66.52 | 己酸 | 3.06 | 59.90 | 己酸 | 2.82 | 54.24 |
| 辛酸 | 3.10 | 51.78 | 辛酸 | 2.86 | 46.55 | 辛酸 | 2.73 | 43.67 |
| 癸酸 | 1.99 | 49.58 | 癸酸 | 2.07 | 51.55 | 癸酸 | 1.72 | 43.34 |
b内标法
| 样品6 | 峰面积 | 浓度 | 样品7 | 峰面积 | 浓度 | 样品8 | 峰面积 | 浓度 |
| 己酸 | 3.04 | 56.15 | 己酸 | 3.13 | 60.35 | 己酸 | 2.82 | 53.43 |
| 辛酸 | 2.98 | 44.28 | 辛酸 | 3.18 | 49.33 | 辛酸 | 3.09 | 47.10 |
| 癸酸 | 2.80 | 46.54 | 癸酸 | 2.98 | 50.71 | 癸酸 | 2.77 | 47.23 |
| 庚酸 | 1.19 | 9.96 | 庚酸 | 1.14 | 9.96 | 庚酸 | 1.16 | 9.96 |
| 混合标准样品 | 峰面积 | 浓度 | ||||||
| 己酸 | 2.80 | 52.6 | ||||||
| 辛酸 | 3.50 | 52.9 | ||||||
| 癸酸 | 3.07 | 51.9 | ||||||
| 庚酸 | 1.17 | 9.96 |
上述样品6、7、8为浓度未知的待测样品。
计算示例：样品6的己酸浓度
按外标法，代入己酸标准曲线(图1)，计算得到浓度为66.52mg/L；
按内标法，代入式(1)，计算得到对应浓度为56.15mg/L。
表4 不同定量方法的精密度比较(表内数据为相对标准偏差)
| 己酸 | 辛酸 | 癸酸 | |
| 外标法 | 10.19％ | 8.68％ | 8.90％ |
| 内标法 | 6.15％ | 5.39％ | 5.78％ |
| 精密度提高值 | 4.04％ | 3.20％ | 3.12％ |
从表3和表4可见，本发明可明显提高HS-SPME-GC/MS方法定量的精密度，对准确检测实验室和工业样品具有积极意义。
表5 不同定量方法的加标回收率数据(峰面积单位：108Mcounts×min；浓度单位：mg/L)
a外标法
| 加标样品 | 峰面积 | 浓度 | 未加标样品 | 峰面积 | 浓度 |
| 己酸 | 1.12 | 13.88 | 己酸 | 0.90 | 10.86 |
| 辛酸 | 1.41 | 14.34 | 辛酸 | 1.20 | 10.14 |
| 癸酸 | 0.61 | 17.56 | 癸酸 | 1.07 | 10.30 |
b内标法
| 加标样品 | 峰面积 | 浓度 | 未加标样品 | 峰面积 | 浓度 |
| 己酸 | 1.20 | 14.73 | 己酸 | 0.90 | 10.86 |
| 辛酸 | 1.78 | 15.31 | 辛酸 | 1.20 | 10.14 |
| 癸酸 | 1.79 | 17.54 | 癸酸 | 1.07 | 10.30 |
| 庚酸 | 1.18 | 9.96 | 庚酸 | 1.20 | 9.96 |
| 混合标准样品 | 峰面积 | 浓度 | |||
| 己酸 | 0.85 | 10.26 | |||
| 辛酸 | 1.22 | 10.32 | |||
| 癸酸 | 1.05 | 10.12 | |||
| 庚酸 | 1.20 | 9.96 |
计算示例：己酸加标样品的浓度。
外标法，代入己酸标准曲线(图1)，计算得到浓度为13.88mg/L；
内标法，代入式(1)，计算得到浓度为14.73mg/L。
表6 不同定量方法的加标回收率比较
| 己酸 | 辛酸 | 癸酸 | |
| 原样品浓度(mg/L) | 10.86 | 10.14 | 10.30 |
| 加标浓度(mg/L) | 5 | 5 | 5 |
| 外标法 | 87.52％ | 94.72％ | 114.77％ |
| 内标法 | 93.06％ | 101.12％ | 97.38％ |
加标回收率＝(加标样品测定值-样品测定值)÷加标量×100％，表6中的百分数为加标回收率均值。
从表5和表6可见，本发明可明显提高HS-SPME-GC/MS方法定量的准确度，对准确检测实验室和工业样品具有积极意义。
效果实施例2
表7 巴氏灭菌乳内标法的测量数据
| 混合标准样品 | 峰面积(108Mcounts×min) | 浓度(mg/L) | 待测样品 | 峰面积(108Mcounts×min) | 浓度(mg/L) |
| 己酸 | 0.85 | 10.26 | 己酸 | 0.90 | 10.41 |
| 辛酸 | 1.22 | 10.32 | 辛酸 | 0.29 | 2.33 |
| 癸酸 | 1.05 | 10.12 | 癸酸 | 0.19 | 1.78 |
| 庚酸 | 1.20 | 9.96 | 庚酸 | 1.25 | 9.96 |
计算示例(计算待测样品的浓度)：代入式(1)，计算得到浓度为10.41mg/L。
表8 巴氏灭菌乳归一化法的测量数据
| 待测样品 | 峰面积(108Mcounts×min) | 归一化法的峰面积百分比(％) |
| 己酸 | 0.90 | 5.47 |
| 辛酸 | 0.29 | 1.72 |
| 癸酸 | 0.19 | 1.12 |
| 所有出峰物质 | 16.55 | 100 |
表7和表8中所使用的待测样品为相同的巴氏灭菌乳。由结果可知，归一化法不能得到目标脂肪酸的具体浓度，只能得到目标物与总出峰面积的百分比，是半定量方法；而本发明的内标法可以得到目标脂肪酸的具体浓度，而且与外标法相比，是更为准确的定量方法，对准确检测实验室和工业样品具有积极意义。
Claims (10)
1.一种游离的中链脂肪酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品和混合脂肪酸标样分别经萃取，气相色谱分离，质谱检测，即可；
所述的待测样品包括待测物和内标溶液；所述的待测物为原料乳、液体乳制品或固体乳制品；当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品还包括氯化钠；当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品还包括水；所述的混合脂肪酸标样包括外标溶液和内标溶液；所述的外标溶液为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种的乙醇水溶液；所述的内标溶液为庚酸的乙醇水溶液；所述的中链脂肪酸为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体乳制品为灭菌乳和/或发酵乳；
和/或，所述的固体乳制品为干酪和/或干酪制品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测物与所述的内标溶液的体积比为10:1～103:1，所述的待测物与所述的氯化钠的体积质量比为1mL/g～10mL/g；
和/或，当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测物与所述的水的质量体积比为0.01g/mL～1g/mL，所述的水与所述的内标溶液的体积比为10:1～103:1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测物与所述的内标溶液的体积比为50:1～150:1，所述的待测物与所述的氯化钠的体积质量比为3mL/g～8mL/g；
和/或，当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测物与所述的水的质量体积比为0.05g/mL～0.5g/mL，所述的水与所述的内标溶液的体积比为50:1～150:1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合脂肪酸标样中所述的外标溶液和所述的内标溶液的体积比为10:1～103:1；
和/或，所述的外标溶液中所述的乙醇水溶液为5％乙醇水溶液；
和/或，所述的外标溶液中所述的己酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为10mg/L～200mg/L；
和/或，所述的外标溶液中所述的辛酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为10mg/L～200mg/L；
和/或，所述的外标溶液中所述的癸酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为10mg/L～200mg/L；
和/或，所述的内标溶液中所述的庚酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为0.1mg/mL～20mg/mL。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的混合脂肪酸标样中所述的外标溶液和所述的内标溶液的体积比为50:1～150:1；
和/或，所述的外标溶液中所述的己酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为45mg/L～60mg/L；
和/或，所述的外标溶液中所述的辛酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为45mg/L～60mg/L；
和/或，所述的外标溶液中所述的癸酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为45mg/L～60mg/L；
和/或，所述的内标溶液中所述的庚酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为0.5mg/mL～5mg/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的萃取为固相微萃取；所述的固相微萃取的萃取头为聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取头；所述的固相微萃取的时间为15分钟～60分钟。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的气相色谱的条件如下：毛细管柱采用Varian公司生产的VF-5ms；载气为He，流速为1mL/min；色谱柱起始柱温为40℃，保持4min，以10℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min；进样口温度230℃，无分流进样，检测器电压800V。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件如下：电子轰击离子源，电子能量70eV；灯丝发射电流200μA，离子源温度200℃，传输线温度250℃；扫描模式Scan；自动扫描时间0.3s，扫描间隔时间0.2s；质量扫描范围m/z 20～200。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，定性方法如下：
将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的质谱与Nist谱库中的质谱对比；或者，将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的保留时间和质谱，与混合脂肪酸标样在相同的GC-MS条件下测得的保留时间和质谱对比；
和/或，定量方法如式(1)所示：
式中：
mi：待测样品中目标脂肪酸的含量，单位为毫克每升或毫克每百克；
As：混合脂肪酸标样中内标物的峰面积；
Ai：待测样品中目标脂肪酸的峰面积；
Asi：待测样品中内标物的峰面积；
Ar：混合脂肪酸标样中目标脂肪酸的峰面积；
mr：混合脂肪酸标样中目标脂肪酸含量，单位为毫克每升；
其中，所述的目标脂肪酸为己酸、辛酸或癸酸；所述的内标物为庚酸。
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