CN115469040A - 一种短链脂肪酸高通量靶标测试方法及其应用 - Google Patents
一种短链脂肪酸高通量靶标测试方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及G01N，更具体地，本发明涉及一种短链脂肪酸高通量靶标测试方法及其应用。样品前处理：将样品加入酸溶液、内标溶液，混合、离心，得到上清液；通过使用本发明提供的测试方法，可用于短链脂肪酸高通量靶标测试，在测试过程中，首先将样品通过酸溶液将短链脂肪酸质子化，和内标溶液混合，来促进脂肪酸稳定提取到内标溶液中，得到低水和硫酸残留的上清液，用于GC‑MS测试，可用于不同样本中宽范围脂肪酸浓度的检测，且具有好的准确性和回收率，得到的各脂肪酸的峰集中，且峰形对称无拖尾等问题，可适应大批量样品的测试。
Description
技术领域
本发明涉及G01N，更具体地，本发明涉及一种短链脂肪酸高通量靶标测试方法及其应用。
背景技术
短链脂肪酸(简称SCFA)，也称挥发性脂肪酸(简称VFA)，可来自各种碳水化合物，主要通过膳食纤维得到，对维持肠道酸性环境，改善人体内菌群生长等具有重要作用。
研究短链脂肪酸在人体中的变化具有重要作用，但是因为不同样品中短链脂肪酸的相对丰度不同，如肠道内容物中乙酸丰度明显大于丁酸，但粪便中乙酸和丁酸的相对风度相似，目前的检测方法一般只能适用特定样品检测，如CN112881580A用于粪便短链脂肪酸含量检测，而难以满足不同样品检测的需求。
此外，在短链脂肪酸检测过程中，需对样品通过酸进行处理，使得进入GC-MS检测的处理试样可能存在水、酸等影响色谱柱的使用寿命，且会对测试精度产生影响，目前通常会进行除水处理，如CN105651908A提供的一种基于GC-MS定量肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法中在离心后得到的上清需经硫酸镁干燥两次,但是又会引入除水剂，提高处理难度以及后续的测试准确性和峰形稳定。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种短链脂肪酸高通量靶标测试方法，包括：
样品前处理：将样品加入酸溶液、内标溶液，混合、离心，得到上清液；
短链脂肪酸标准曲线建立；
上清液进行GC-MS测试，得到样品中短链脂肪酸含量。
作为本发明一种优选的技术方案，所述酸溶液中酸的体积百分数为40～60％，如40％、43％、45％、48％、50％、52％、55％、58％、60％，所述酸为硫酸或盐酸，优选为硫酸。
作为本发明一种优选的技术方案，所述酸溶液和内标溶液的体积比为1：3～9，如1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9。
在前处理过程中一般通过添加酸溶液使得样品中的脂肪酸质子化，以及蛋白质沉淀，并通过含有内标的溶液来提取样品中脂肪酸，但发明人发现，其较小分子的乙酸、丙酸等难以完全从酸溶液中提取出来，会影响低浓度乙酸的检测，而较长脂肪酸链虽然有利于从酸溶液分离出来，但是其也会影响小分子乙酸、丙酸等的提取，而发明人发现，通过使用高浓度酸溶液，如硫酸溶液，并通过控制酸溶液和内标溶液中的体积比，一方面保持酸溶液高的酸浓度来促进脂肪酸向内标溶液中移动，另一方面，采用合适内标溶液体积比来促进对脂肪酸的稀释浓度，从而维持合适的浓度差，有利于小分子脂肪酸向内标溶液的迁移，促进对广范围浓度脂肪酸的检测和可靠性，但发明人同样也发现内标溶液添加剂不宜较大，否则因为其对水以及酸的溶解会相应增加。
作为本发明一种优选的技术方案，当样品为血清或尿液时，样品和无机酸体积比为1～2：1，如1：1、1.2：1、1.5：1、1.8：1、2：1。
作为本发明一种优选的技术方案，当样品为动物及临床组织标本、血浆、细胞、微生物、粪便或肠道内容物时，样品加入水中，经过研磨、离心处理，得到样品上清液进行样品前处理，样品上清液和酸溶液的体积比为5～9：1，如5：1、6：1、7：1、8：1、9：1。
且发明人发现，当为血清等样品时，可直接将样品进行前处理，而当为肠道内容物、微生物等时，可以先进行研磨、离心处理，其中本发明不对研磨、离心处理做具体限定，为本领域熟知操作方法，作为一种实例，可将样品加入水中，混合后，加入钢珠，在30～50Hz研磨2～6min，超声4～6min，重复1～2后，再2～6℃、3000～6000rpm下离心15～30min，得到样品上清液。其中因为样品已经经过一次离心，故加酸溶液的量相比于不进行研磨、离心的样品可相对减少。
作为本发明一种优选的技术方案，所述内标溶液中内标的质量浓度为20～30mg/L，如20mg/L、22mg/L、25mg/L、28mg/L、30mg/L，内标为2-甲基戊酸或2-甲基丁酸。
作为本发明一种优选的技术方案，所述内标溶液的溶剂选自酯类溶剂、醚类溶剂中的一种，优选为醚类溶剂。作为醚类溶剂的实例，可列举的有，基叔丁基醚、乙醚、丙醚、正丙醚、正丁醚、二丙二醇二丙醚等。
作为本发明一种优选的技术方案，所述样品前处理中，混合、离心后，在-30～-15℃静置20～30min后，取上清液，优选地，所属静置的温度为-30～-15℃，如-30℃、-25℃、-20℃、-15℃，静置的时间为20～30min，如20min、22min、25min、28min、30min。
发明人发现，虽然本发明通过避免使用较多内标溶液，来减少进入色谱柱检测的水和酸，但发明人同样也发现，通过控制内标溶液中内标浓度，并在离心后控制静置时间和温度，其中其离心后内标溶液中残留的酸和水虽然难以完全沉积到下层，但通过控制在-30～-15℃静置，可使得内标溶液中残留酸水发生一定的结冰，来进一步促进酸水下沉，而又因为下层中酸的浓度较大，冰点低，使得下层的酸溶液可保持液态，溶解下沉的酸水，促进内标溶液中酸和水的去除，且发明人还发现，当控制内标的浓度时，更有利于减少残留的酸和水，促进高通量检测过程中检测的准确性和回收率稳定，保证峰形高大，无拖尾，对称性和分离性好，且发明人也发现，若内标浓度较大，反而不利于色谱柱长期使用和检测精度提高。
作为本发明一种优选的技术方案，所述样品前处理中，离心的温度为1～6℃离心，离心速率为8000～20000rpm。而本发明前处理的混合中，为常规的混合处理，如通过涡旋、振荡、超声来充分混合，且在超声过程中，避免温度较高，如可在冰水浴中进行。
作为本发明一种优选的技术方案，所述GC-MS测试中，柱流速为0.5～1.5mL/min，如0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.2mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min。
作为本发明一种优选的技术方案，所述GC-MS测试中，柱箱升温程序为70～85℃保持1～2分钟；以8～15℃/min的速率升至190～210℃，保持3～6分钟；以30～45℃/min的速率升至235～245℃，保持0.5～2分钟；优选为所述GC-MS测试中，柱箱升温程序为80℃保持1分钟；以10℃/min的速率升至200℃，保持5分钟；以40℃/min的速率升至240℃/，保持1分钟。
作为本发明一种优选的技术方案，所述GC-MS测试中，溶剂延迟为3～4min。
此外，发明人还发现，测试中色谱柱的升温程序和流速等也有利于本发明对不同样品中脂肪酸的检测，提高其检测的浓度范围，尤其是含有高浓度的戊酸、己酸，甚至更长链酸来，其难以在色谱图中和其他乙酸、丙酸等一起出峰，难以在较高浓度下检测，而本发明通过控制3段升温速率和温度，以及柱流速等，可促进较高沸点的脂肪酸分离的同时，促进集中出峰的同时，得到较尖锐的峰，提高脂肪酸检测范围。
作为本发明一种优选的技术方案，所述GC-MS测试中，前进样口温度为230～245℃，传输线温度为230～245℃，离子源温度为220～235℃，四级杆温度为140～155℃。
作为本发明一种优选的技术方案，所述短链脂肪酸标准曲线建立，将所有待测的短链脂肪酸加入内标溶液中，稀释成不同的质量浓度，进行GC-MS测试，并以待测的短链脂肪酸的峰面积和内标的封面积的比值作为Y轴，对应质量浓度作为X轴，得到线性回归方程，作为标准曲线。
本发明第二个方面提供了一种所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法的应用，用于检测动物及临床组织标本、血液、血浆、细胞、微生物、尿液、粪便、肠道内容物中的短链脂肪酸。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
通过使用本发明提供的测试方法，可用于短链脂肪酸高通量靶标测试，在测试过程中，首先将样品通过酸溶液将短链脂肪酸质子化，和内标溶液混合，来促进脂肪酸稳定提取到内标溶液中，得到低水和硫酸残留的上清液，用于GC-MS测试，可用于不同样本中宽范围脂肪酸浓度的检测，且具有好的准确性和回收率，得到的各脂肪酸的峰集中，且峰形对称无拖尾等问题，可适应大批量样品的测试。
具体实施方式
实施例
本例中原料均为市售，其中甲基叔丁基醚为HPLC级，50％H2SO4为浓硫酸(≥95wt％(AR))和水混合得到，2-甲基戊酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸纯度≥99.5wt％，水为ddH2O。
实施例1提供一种21例人血清样本中短链脂肪酸的检测方法，包括：
(1)样本预处理
1.取0.05mL样本于1.5mLEP管中；
2.加入0.05mL 50％H2SO4，加入0.2mL内标溶液(2-甲基戊酸，25mg/L，甲基叔丁基醚)，涡旋30s振荡10min超声10min(冰水浴)；
3.在将样本4℃离心，10000rpm离心15min；
4.-20℃静置30min；
5.取出上清于进样瓶中，GC-MS检测。
(2)GC-MS检测参数
Agilent 7890气相色谱质谱联用仪配有Agilent HP-FFAP毛细管柱(30m×250μm×0.25μm，J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，GC-MS具体分析条件如表1所示：
表1
(2)短链脂肪酸标准曲线建立
1.将乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸混合物加入内标溶液中，稀释成一系列质量浓度为0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的标准溶液，其中标准溶液中内标的浓度均为25mg/L，得到线性回归方程，作为标准曲线，如表2所示。
表2
(4)将步骤(1)得到的上清液进行GC-MS检测，其中样本前后各一个QC，计算QC回收率，用于质量控制，发现测试过程中QC回收率均满足80％～120％，其中第21个样前后的回收率如表3所示，可发现连续测试21个样仍可保证测试稳定。
表3
| 编号 | 组分 | QC1(mg/L) | 回收率(％) | QC4(mg/L) | 回收率(％) |
| 1 | 乙酸 | 1.03 | 103 | 0.95 | 95 |
| 2 | 丙酸 | 1.07 | 107 | 1.04 | 104 |
| 3 | 异丁酸 | 0.82 | 82 | 1.18 | 118 |
| 4 | 丁酸 | 0.99 | 99 | 0.98 | 98 |
| 5 | 异戊酸 | 1.05 | 105 | 0.96 | 96 |
| 6 | 戊酸 | 1.05 | 105 | 1.07 | 107 |
| 7 | 己酸 | 1.17 | 117 | 1.11 | 111 |
(5)定量结果
通过公式计算样品中各脂肪酸的浓度，其中计算公式：
C(con)：样本中目标化合物的含量，μg/mL；Cs：提取液中目标化合物浓度，mg/L；V1：加入内标溶液体积，mL；V0：取样量，mL。
其中第21个样品的脂肪酸浓度如表4所示。
表4
实施例2提供一种24例猪结肠内容物样本中短链脂肪酸的检测方法，包括：
(1)样本预处理
1.取样本于2mLEP管中，加入1mL纯水，涡旋10s；
2.加入钢珠，40Hz研磨仪处理4min，超声5min(冰水浴)，重复3次；
3.将样本4℃离心，5000rpm离心20min；
4.移取0.8mL上清液于2mL EP管中；
5.加入0.1mL 50％H2SO4，加入0.8mL提取液(含内标2-甲基戊酸，25mg/L，甲基叔丁基醚)，涡旋10s，振荡10min，超声10min(冰水浴)
6.在将样本4℃离心，10000rpm离心15min；
7.-20℃静置30min；
(2)GC-MS检测参数
Agilent 7890气相色谱质谱联用仪配有Agilent HP-FFAP毛细管柱(30m×250μm×0.25μm，J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，GC-MS具体分析条件如表1所示：
表5
(2)短链脂肪酸标准曲线建立
1.将乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸加入内标溶液中，稀释成一系列质量浓度为0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的标准溶液，其中标准溶液中内标的浓度均为25mg/L，得到线性回归方程，作为标准曲线，如表6所示。
表6
(4)将步骤(1)得到的上清液进行GC-MS检测，其中样本前后各一个QC，计算QC回收率，用于质量控制，发现测试过程中QC回收率均满足80％～120％，其中第24个样前后的回收率如表7所示，可发现连续测试24个样仍可保证测试稳定。
表7
| 编号 | 组分 | QC1(mg/L) | 回收率(％) | QC4(mg/L) | 回收率(％) |
| 1 | 乙酸 | 1.15 | 115 | 1.13 | 113 |
| 2 | 丙酸 | 1.12 | 112 | 1.14 | 114 |
| 3 | 异丁酸 | 1.13 | 113 | 0.98 | 98 |
| 4 | 丁酸 | 1.09 | 109 | 1.13 | 113 |
| 5 | 异戊酸 | 1.13 | 113 | 1.15 | 115 |
| 6 | 戊酸 | 1.15 | 115 | 1.15 | 115 |
| 7 | 己酸 | 1.09 | 109 | 1.10 | 110 |
| 8 | 庚酸 | 1.11 | 111 | 1.11 | 111 |
| 9 | 辛酸 | 1.12 | 112 | 1.10 | 110 |
| 10 | 壬酸 | 1.12 | 112 | 1.15 | 115 |
| 11 | 癸酸 | 1.15 | 115 | 1.14 | 114 |
(5)定量结果
通过公式计算样品中各脂肪酸的浓度，其中计算公式：
C(con)：样本中目标化合物的含量，μg/g；Cs：提取液中目标化合物浓度，mg/L；V1：加入提取液(含内标2-甲基戊酸)体积，mL；V2：取出纯水上清液体积，mL；V3：加入纯水体积，mL；M：称样量，mg.。
其中第24个样品的脂肪酸浓度如表8所示。
表8
实施例3提供一种76例人粪便样本中短链脂肪酸的检测方法，包括：
(1)样本预处理
1.取样本于2mLEP管中，加入1mL纯水，涡旋10s；
2.加入钢珠，40Hz研磨仪处理4min，超声5min(冰水浴)，重复3次；
3.将样本4℃离心，5000rpm离心20min；
4.移取0.8mL上清液于2mL EP管中；
5.加入0.1mL 50％H2SO4，加入0.8mL提取液(含内标2-甲基戊酸，25mg/L，甲基叔丁基醚)，涡旋10s，振荡10min，超声10min(冰水浴)
6.在将样本4℃离心，10000rpm离心15min；
7.-20℃静置30min；
(2)GC-MS检测参数
Agilent 7890气相色谱质谱联用仪配有Agilent HP-FFAP毛细管柱(30m×250μm×0.25μm，J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，GC-MS具体分析条件如表9所示：
表9
(2)短链脂肪酸标准曲线建立
1.将乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸加入内标溶液中，稀释成一系列质量浓度为0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的标准溶液，其中标准溶液中内标的浓度均为25mg/L，得到线性回归方程，作为标准曲线，如表10所示。
表10
(4)将步骤(1)得到的上清液进行GC-MS检测，其中样本前后各一个QC，计算QC回收率，用于质量控制，发现测试过程中QC回收率均满足80％～120％，其中第76个样前后的回收率如表11所示，可发现连续测试76个样仍可保证测试稳定。
表11
| 编号 | 组分 | QC1(mg/L) | 回收率(％) | QC4(mg/L) | 回收率(％) |
| 1 | 乙酸 | 0.91 | 91 | 0.91 | 91 |
| 2 | 丙酸 | 1.09 | 109 | 1.05 | 105 |
| 3 | 异丁酸 | 1.04 | 104 | 0.93 | 93 |
| 4 | 丁酸 | 1.05 | 105 | 1.10 | 110 |
| 5 | 异戊酸 | 1.05 | 105 | 1.04 | 104 |
| 6 | 戊酸 | 1.06 | 106 | 1.02 | 102 |
| 7 | 己酸 | 0.82 | 82 | 1.00 | 100 |
(5)定量结果
通过公式计算样品中各脂肪酸的浓度，其中计算公式：
C(con)：样本中目标化合物的含量，μg/g；Cs：提取液中目标化合物浓度，mg/L；V1：加入提取液(含内标2-甲基戊酸)体积，mL；V2：取出纯水上清液体积，mL；V3：加入纯水体积，mL；M：称样量，mg.。
其中第76个样品的脂肪酸浓度如表12所示。
表12
实施例4提供一种20例猪肠道样本中短链脂肪酸的检测方法，包括：
(1)样本预处理
1.取样本于2mLEP管中，加入1mL纯水，涡旋10s；
2.加入钢珠，40Hz研磨仪处理4min，超声5min(冰水浴)，重复3次；
3.将样本4℃离心，5000rpm离心20min；
4.移取0.8mL上清液于2mL EP管中；
5.加入0.1mL 50％H2SO4，加入0.8mL提取液(含内标2-甲基戊酸，25mg/L，甲基叔丁基醚)，涡旋10s，振荡10min，超声10min(冰水浴)
6.在将样本4℃离心，10000rpm离心15min；
7.-20℃静置30min；
(2)GC-MS检测参数
岛津GC2030-QP2020 NX气相色谱质谱联用仪配有Agilent HP-FFAP毛细管(30m×250μm×0.25μm，J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，GC-MS具体分析条件如表13所示：
表13
(2)短链脂肪酸标准曲线建立
1.将乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸加入内标溶液中，稀释成一系列质量浓度为0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的标准溶液，其中标准溶液中内标的浓度均为25mg/L，得到线性回归方程，作为标准曲线，如表14所示。
表14
(4)将步骤(1)得到的上清液进行GC-MS检测，其中样本前后各一个QC，计算QC回收率，用于质量控制，发现测试过程中QC回收率均满足80％～120％，其中第76个样前后的回收率如表15所示，可发现连续测试76个样仍可保证测试稳定。
表15
| 编号 | 组分 | QC1(mg/L) | 回收率(％) | QC4(mg/L) | 回收率(％) |
| 1 | 乙酸 | 1.16 | 116 | 1.16 | 116 |
| 2 | 丙酸 | 1.00 | 100 | 0.99 | 99 |
| 3 | 异丁酸 | 1.03 | 103 | 1.00 | 100 |
| 4 | 丁酸 | 1.18 | 118 | 1.17 | 117 |
| 5 | 异戊酸 | 1.12 | 112 | 1.10 | 110 |
| 6 | 戊酸 | 1.10 | 110 | 1.07 | 107 |
| 7 | 己酸 | 1.10 | 110 | 1.06 | 106 |
(5)定量结果
通过公式计算样品中各脂肪酸的浓度，其中计算公式：
C(con)：样本中目标化合物的含量，μg/g；Cs：提取液中目标化合物浓度，mg/L；V1：加入提取液(含内标2-甲基戊酸)体积，mL；V2：取出纯水上清液体积，mL；V3：加入纯水体积，mL；M：称样量，mg。
其中第76个样品的脂肪酸浓度如表16所示。
表16
由测试结果可知，本发明提供的短链脂肪酸高通量靶标测试方法可用于多种脂肪酸的检索，且具有好的检测准确性和可靠性，是用于大批量测试。
Claims (10)
1.一种短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，包括：
样品前处理：将样品加入酸溶液、内标溶液，混合、离心，得到上清液；
短链脂肪酸标准曲线建立；
上清液进行GC-MS测试，得到样品中短链脂肪酸含量；
所述内标溶液中内标的质量浓度为20～30mg/L，酸溶液中酸的体积百分数为40～60％，酸溶液和内标溶液的体积比为1：3～9。
2.根据权利要求1所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，当样品为血清或尿液时，样品和酸溶液体积比为1～2：1。
3.根据权利要求1所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，当样品为动物及临床组织标本、血浆、细胞、微生物、粪便或肠道内容物时，样品加入水中，经过研磨、离心处理，得到样品上清液进行样品前处理，样品上清液和酸溶液的体积比为5～9：1。
4.根据权利要求1所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，所述酸为硫酸或盐酸，内标为2-甲基戊酸或2-甲基丁酸。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，所述样品前处理中，混合、离心后，在-30～-15℃静置20～30min后，取上清液。
6.根据权利要求5所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，所述样品前处理中，离心的温度为1～6℃离心，离心速率为8000～20000rpm。
7.根据权利要求5所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，所述GC-MS测试中，柱流速为0.5～1.5mL/min。
8.根据权利要求5所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，所述GC-MS测试中，柱箱升温程序为70～85℃保持1～2分钟；以8～15℃/min的速率升至190～210℃，保持3～6分钟；以30～45℃/min的速率升至235～245℃，保持0.5～2分钟。
9.根据权利要求5所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法，其特征在于，所述GC-MS测试中，溶剂延迟为3～4min。
10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的短链脂肪酸高通量靶标测试方法的应用，其特征在于，用于检测动物及临床组织标本、血液、血浆、细胞、微生物、尿液、粪便、肠道内容物中的短链脂肪酸。
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