CN105738185A - 一种萃取装置及其在萃取、油脂提取和测定微生物细胞油脂含量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于实验仪器及应用，特别是指一种萃取装置及其在萃取、油脂提取和测定微生物细胞油脂含量中的应用。萃取装置包括上端开口的斗体，开设于斗体下部的导管，设置于导管中部且上下两端与其连通的旋塞腔，以及与旋塞腔内表面转动密封配合且开设有通孔的旋塞；旋塞腔上方的导管及斗体呈透明状，还包括一顶端开设瓶口的离心瓶，该离心瓶采用具有自复位功能的弹性材质制作，导管下部外侧设有可与离心瓶上端瓶口密封连通的接口。本发明解决了现有技术存在的萃取和测定方法所用设备复杂且操作繁琐等问题，具有设备结构简单、操作快速、测定误差小等优点。
Description
技术领域
本发明属于实验仪器及应用，特别是指一种萃取装置及其在萃取、油脂提取和测定微生物细胞油脂含量中的应用。
背景技术
近年来，单细胞油脂作为一种新兴的生物资源受到了广泛的关注，其应用范围涉及饲料、食品补充剂、药物和能源等领域。在大力开发微生物资源的过程中，人们发现很多种类的微生物能合成大量的油脂，具有高油含量特性，微生物油脂的开发和利用逐渐成为当今世界的研究热点。微生物油脂的用途广泛，例如，有的微生物油脂中含有大量中长链和长链的饱和脂肪酸酯，经过加工处理可以得到生物柴油；而有的微生物油脂中含有大量多不饱脂肪酸酯(如DHA、AA、EPA等)，可开发高附加值的产品用于食品和药品。
微生物油脂的生产过程主要包含培养、提取、纯化和油脂分析等。在发酵培养试验过程中，往往需要通过分析总脂的含量来调整发酵过程参数，以提高油脂含量和产量，而总脂的测定方法是准确获得油脂含量结果的关键。目前的研究报道中，总脂测定普遍采用一种传统的Bligh-Dyer法，该方法由Bligh和Dyer于1959年提出，其用甲醇/氯仿混合溶剂体系直接浸提和萃取微生物细胞油脂。由于微生物油脂主要存在于细胞内，部分油脂以与蛋白质或糖类结合的脂蛋白或脂多糖的形式存在，而微生物细胞又被坚韧的细胞壁所包裹，从而导致有机溶剂渗透性较差，较难直接将油脂提取出来，造成油脂提取不完全的问题，因此，在油脂提取前需要对细胞进行破壁预处理。人们在Bligh-Dyer法的基础上对总脂测定方法进行改进，结合细胞破壁处理来提高油脂提取率，细胞破壁方法包括机械研磨法，热裂解法、超声法、高压匀质法、化学水解法、生物酶水解法等。例如，Sudarat等采用改进的Bligh-Dyer法提取藻体细胞总脂，将80mg冻干藻粉与8ml甲醇/氯仿溶剂混合，辅助超声30分钟进行破壁，离心后收集上清提取总脂；AndrewKendrick在测定7株产EPA和DHA的海洋真菌的总脂时将菌体离心并清洗，冷冻干燥18小时后获得干菌体，称取一定量干菌体用研钵研磨破壁，再用甲醇/氯仿有机试剂浸泡15h，取有机相挥发得总油脂；Freddy等采用改进的Bligh-Dyer法，以2:1的甲醇/氯仿为提取溶剂，辅助人工碾磨和超声破壁提取Pavlovalutheri和Odontellaaurita藻体细胞总脂；公开号为CN104388178A的专利文献中采用了高压匀质的破壁方法提取DHA藻油。
在Bligh-Dyer法基础上衍生出的总脂含量测定方法一般要经过以下步骤：1、从发酵体系中取出样品，离心收集菌体并洗涤；2、放入低温下冷冻；3、放入冷冻干燥器中冻干得到固体藻粉；4、称取一定量的藻粉；5、根据需要选择破壁方法进行破壁；6、加入有机溶剂浸泡；7、转移至离心管内离心，使有机相分层；8、吸取有机相至新管中；9、向样品中再加有机溶剂反复浸泡、离心和转移多次后合并所有有机相；10、旋转蒸干有机相；11、称量油脂的重量，计算总脂的含量。虽然，经过改进后的测定方法的油脂提取效率得到一定提高，但仍然存在以下缺陷：一是上述步骤中冷冻、冻干、人工研磨、浸泡以及样品溶液和萃取液体的反复转移和离心使得操作非常繁琐，测定时间很长，测定一个样品的总脂含量大约需要1天，费时费力；二是很多方法中所使用的甲醇/氯仿有机溶剂都具有毒性，对人体健康不利；三是在破壁预处理的过程中，有些方法需要专门的设备，如高压匀质破壁法需要高压匀质机、超声辅助破壁需要超声仪器、藻体需要冷冻干燥机进行冻干等，而这些仪器大都属于大型设备，价格比较昂贵；四是有些方法的油脂萃取过程中破碎的细胞残渣在离心后容易再分散，使得固液两相分离比较困难；五是有些方法在进行液液两相分离时，需要将萃取相用吸管反复吸取和转移，操作非常繁琐，也容易在转移时洒落，样品损失严重，造成测定结果不准确；六是有些萃取混合液有乳化的情况，两相分层非常困难，需要用离心辅助分层，再使用分液漏斗进行两相分离，这样离心管与分液漏斗之间反复的液体转移造成样品损失，并且操作繁琐，费时费力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种萃取装置及其在萃取、油脂提取和测定微生物细胞油脂含量中的应用，能够有效避免样品在不同容器间的反复转移，减少样品损耗，简化了萃取流程，提高了测定结果的准确性。
本发明的整体技术构思是：
一种萃取装置，包括上端开口的斗体，开设于斗体下部的导管，设置于导管中部且上下两端与其连通的旋塞腔，以及与旋塞腔内表面转动密封配合且开设有通孔的旋塞；旋塞腔上方的导管及斗体呈透明状，还包括一顶端开设瓶口的离心瓶，该离心瓶采用具有自复位功能的弹性材质制作，导管下部外侧设有可与离心瓶上端瓶口密封连通的接口。
萃取装置在萃取中的应用。
萃取装置在油脂提取中的应用。
萃取装置在微生物油脂提取中的应用。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用。
本发明的具体技术构思还有：
为便于将斗体中的液体转移至其它容器中，优选的技术方案是，所述的斗体顶部侧壁开设有引流嘴。
为避免或减少液体对于离心瓶瓶体的腐蚀损伤，优选的技术方案是，所述的离心瓶采用惰性材质制作。
为实现离心瓶与接口的快速装配，优选的技术方案是，所述的接口采用与离心瓶上端瓶口适配的螺纹接口或速接密封接口。
为满足离心瓶在非萃取状态下(例如离心)的工作，优选的技术方案是，还包括一瓶塞，该瓶塞与离心瓶的瓶口采用密封配合。更为优选的技术方案是，所述的密封配合选用螺纹密封或胀紧密封。
为实现旋塞的轴向定位，优选的技术实现方式是，旋塞与旋塞腔之间通过定位带捆绑定位。
为保证离心瓶在离心过程中的平稳，优选的技术实现方式是，离心瓶的外形与离心机的离心管适配。
萃取装置在萃取中的应用，包括如下步骤：
A、取样：量取样品溶液于萃取装置的离心瓶中；
B、萃取：向离心瓶中加入萃取剂，盖紧瓶塞并振荡，置于离心机中离心至两相分层，或静置至两相分层后取下瓶塞；
C、分离：将斗体与离心瓶通过接口密封连通，转动旋塞至通孔与导管导通，挤压离心瓶侧壁，使上层萃取液通过导管进入斗体，当下层样品溶液液面接近旋塞上部时转动旋塞至导管处于封闭状态，使下层样品溶液截留在离心瓶中，而大部分萃取液都进入斗体。
常用且显而易见的技术方案是，步骤C中当萃取液处于离心瓶下层时，将萃取装置倒置释放出萃取液。
为保证将离心瓶中的样品溶液全部萃取，优选的技术实现方式是，步骤C后还包括一步骤D，该步骤的工艺条件如下：
D、多次萃取：针对所截留在离心瓶中的样品溶液重复步骤B及步骤C。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用，包括如下步骤：
A、取样：量取0.5-5ml发酵液样品于已知干重的离心管中，离心和洗涤微生物细胞，烘干称重得到细胞干重浓度；同时量取2-10ml发酵液样品于萃取装置的离心瓶中，加入2-15ml质量百分比浓度为37％的浓盐酸，振荡混匀，将离心瓶瓶口用瓶塞密封；置于40-100℃水浴中保持10-100分钟，取出离心瓶冷却至25℃；
B、破乳：向离心瓶中加入2-20ml油脂萃取剂，盖紧瓶塞并振荡，离心至两相分层；
C、萃取：取下瓶塞，将斗体与离心瓶通过接口密封连通，转动旋塞至通孔与导管导通，挤压离心瓶侧壁，使上层有机相通过导管进入斗体，当下层水相液面接近旋塞上部时转动旋塞至导管处于封闭状态，使下层样品溶液截留在离心瓶中，而大部分萃取有机相都进入斗体，针对所截留在离心瓶中的样品溶液重复步骤B及步骤C；
D、测定：合并萃取液蒸干得到油脂并测定油脂含量。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用中所述的步骤A中浓盐酸与发酵液样品混合后酸的质量浓度为15-30％。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用中所述的步骤B中油脂萃取剂选用正己烷、石油醚中的一种或其结合。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用中所述的步骤C中采用少量油脂萃取剂清洗斗体并将清洗后的萃取液合并。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明中的萃取装置巧妙采用了具有可实现自复位的弹性离心瓶作为关键结构设计，既满足了离心操作的需要，又可与斗体速接实现萃取分离的快捷操作，结构设计简单实用且便于量产，同时有效避免了因液体转移过程中滴漏所造成的测定误差。
2、本发明中的萃取装置因单次萃取效率高，减少了萃取次数，离心瓶可直接离心，加速两相分离，简化了操作步骤，缩短测定时间。
3、在测定微生物细胞油脂含量中的应用中采用浓酸催化裂解细胞壁的方法，强烈的催化条件使破壁速度快且更加充分，提高了破壁效率及油脂提取率，缩短了测定时间。
4、与索氏抽提、高压匀质、超声辅助等方法相比，本申请所用设备简单，总脂测定成本低。
5、本发明所用有机溶剂为正己烷或石油醚，比传统方法用的甲醇或三氯甲烷的毒性低，对身体伤害较小。
附图说明
本发明的附图有：
图1是本发明中萃取设备的整体结构示意图。
附图中的附图标记如下：
1、引流嘴；2、斗体；3、旋塞腔；4、通孔；5、旋塞；6、瓶塞；7、离心瓶；8、接口；9、导管。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中的萃取装置结构如图示，其中包括上端开口的斗体2，开设于斗体2下部的导管9，设置于导管9中部且上下两端与其连通的旋塞腔3，以及与旋塞腔3内表面转动密封配合且开设有通孔4的旋塞5；旋塞腔3上方的导管9及斗体2呈透明状，还包括一顶端开设瓶口的离心瓶7，该离心瓶7采用具有自复位功能的弹性材质制作，导管9下部外侧设有可与离心瓶7上端瓶口密封连通的接口8。
所述的斗体2顶部侧壁开设有引流嘴1。
所述的离心瓶7采用惰性材质制作。
所述的接口8采用与离心瓶7上端瓶口适配的螺纹接口或速接密封接口。
还包括一瓶塞6，该瓶塞6与离心瓶7的瓶口采用密封配合。所述的密封配合选用螺纹密封或胀紧密封。
旋塞5与旋塞腔3之间通过定位带捆绑定位。
离心瓶7的外形与离心机的离心管适配。
萃取装置在萃取中的应用，包括如下步骤：
A、取样：量取样品溶液于萃取装置的离心瓶7中；
B、萃取：向离心瓶7中加入萃取剂，盖紧瓶塞6并振荡，置于离心机中离心至两相分层，或静置至两相分层后取下瓶塞6；
C、分离：将斗体2与离心瓶7通过接口8密封连通，转动旋塞5至通孔4与导管9导通，挤压离心瓶7侧壁，使上层萃取液通过导管9进入斗体2，当下层样品溶液液面接近旋塞5上部时转动旋塞5至导管9处于封闭状态，使下层样品溶液截留在离心瓶7中，而大部分萃取液都进入斗体2。
步骤C中当萃取液处于离心瓶下层时，将萃取装置倒置释放出萃取液。
为保证将离心瓶中的样品溶液全部萃取，优选的技术实现方式是，步骤C后还包括一步骤D，该步骤的工艺条件如下：
D、多次萃取：针对所截留在离心瓶7中的样品溶液重复步骤B及步骤C。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用，包括如下步骤：
A、取样：量取0.5-5ml发酵液样品于已知干重的离心管中，离心和洗涤微生物细胞，烘干称重得到细胞干重浓度；同时量取2-10ml发酵液样品于萃取装置的离心瓶7中，加入2-15ml质量百分比浓度为37％的浓盐酸，振荡混匀，将离心瓶7瓶口用瓶塞6密封；置于40-100℃水浴中保持10-100分钟，取出离心瓶7冷却至25℃；
B、破乳：向离心瓶7中加入2-20ml油脂萃取剂，盖紧瓶塞6并振荡，离心至两相分层；
C、萃取：取下瓶塞6，将斗体2与离心瓶7通过接口8密封连通，转动旋塞5至通孔4与导管9导通，挤压离心瓶7侧壁，使上层有机相通过导管9进入斗体2，当下层水相液面接近旋塞5上部时转动旋塞5至导管9处于封闭状态，使下层样品溶液截留在离心瓶7中，而大部分萃取有机相都进入斗体2，针对所截留在离心瓶7中的样品溶液重复步骤B及步骤C；
D、测定：合并萃取液蒸干得到油脂并测定油脂含量。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用中所述的步骤A中浓盐酸与发酵液样品混合后酸的质量浓度为15-30％。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用中所述的步骤B中油脂萃取剂选用正己烷、石油醚中的一种或其结合。
萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用中所述的步骤C中采用少量油脂萃取剂清洗斗体2并将清洗后的萃取液合并。
实施例2
萃取装置在大豆油脂提取中的应用
在萃取装置的离心瓶7中加入10ml蒸馏水，准确称取0.5g大豆油加入离心瓶7中，盖紧瓶塞6并振荡混匀，静置片刻后加入10ml石油醚，盖紧瓶塞6并振荡混匀，在5000rpm下离心10秒，取下瓶塞6，将斗体2与离心瓶7通过接口8密封连通，将旋塞5插入旋塞腔3并转动，使通孔4与导管9导通，用手缓慢挤压离心瓶7侧壁，使上层有机相通过导管9进入斗体2中，观察旋塞5部位，当下层水相液面贴近通孔4上部时转动旋塞隔断两相，使全部的下层样品溶液截留在离心瓶7中，而几乎全部的萃取有机相都进入斗体2，将斗体2中的萃取液倾倒至已知干重的管中，用少量石油醚清洗斗体并合并管中，用氮气吹干至恒重，测定重量并记录。正置萃取装置，向斗体2中加入10ml石油醚，打开旋塞使溶剂进入离心瓶7中，取下离心瓶7并将其用瓶塞6盖紧，再次振摇混合，重复上述萃取过程完成第二次萃取，用氮气吹干至恒重，测定重量并记录。重复萃取第三次和第四次，并分别记录油脂重量。计算油脂累加回收效率，结果如下：
| 萃取次数 | 油脂累加回收率 |
| 第一次 | 96.91％±0.58％ |
| 第二次 | 99.48％±0.27％ |
| 第三次 | 99.85％±0.40％ |
| 第四次 | 100.23±0.31％ |
实施例3
萃取装置在测定微生物油脂含量中的应用
本实施例所用藻种为裂殖壶菌Schizochytriumsp.CGMCC11382。
种子液培养：以20g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、15g/L海盐为种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以80g/L葡萄糖、5g/L玉米浆粉、15g/L海盐为发酵培养基，于5L发酵罐中进行发酵培养，发酵温度25℃、搅拌转速500rpm，通气量2.5L/min。发酵过程中，每隔一定时间取样测定总脂含量。
具体为从发酵罐中取出10ml的发酵液，于50ml离心管中，用移液器吸打混匀，准确量取2ml于已称重的2ml离心管中，1000-8000rpm转速离心20秒-120秒，弃掉上清获得菌体，加入蒸馏水洗涤两次，于105℃下烘干2h至恒重。再准确量取5ml发酵液于离心瓶7中，加入10ml的质量百分比浓度为37％的浓盐酸溶液，盖紧瓶塞6并振荡混匀，在80℃温度下温浴30分钟，取出放入冷水中冷却至25℃，向其中加入10ml石油醚萃取，振荡混匀，5000rpm下离心10秒至两相分层，取下瓶塞6，将斗体2与离心瓶7通过接口8密封连通，将旋塞5插入旋塞腔3并转动使其通孔4与导管9导通，用手缓慢挤压离心瓶7侧壁，使上层有机相通过导管9进入斗体2中，观察旋塞5部位，当下层水相液面贴近旋塞5上部时旋转旋塞5使通孔4与导管9处于非导通状态，使全部的下层样品溶液截留在离心瓶7中，而几乎全部的萃取有机相都进入斗体2，将斗体2中的萃取液倾倒至已知干重的管中，用少量石油醚清洗斗体2并合并管中，用氮气吹干。正置萃取装置，向斗体2中加入8ml石油醚，打开旋塞5使溶剂进入离心瓶7，取下离心瓶7并将其瓶口用瓶塞6盖紧，再次振摇混合，如此重复萃取。反应液用石油醚萃取3次，合并至同一离心管中，氮气吹干至恒重，即得到5ml发酵液中油脂的重量。计算每毫升发酵液中油脂的重量与每毫升发酵液中细胞干重的比值即得微生物细胞中总脂的含量。本实施例同时采用本领域公知的Bligh-Dyer法，超声辅助萃取法、高压匀质法和索氏抽提法测定总脂含量作为比较，分别测定了48h、60h和96h的发酵液样品，具体方法均参照本领域已知的方法步骤。
结果如下表：
实施例4
萃取装置在提取泔水中油脂的应用
准确称取泔水样品2g于离心瓶7中，加入3ml蒸馏水振荡混匀，加入15ml质量百分比浓度为37％的浓盐酸，盖紧瓶塞6，振荡混匀后在40℃温度下温浴100分钟，取出放入冷水中冷却5分钟，加入10ml正己烷，涡旋振荡5分钟，于4000rpm下离心2min，将离心瓶7与接口8装配，按实施例1所述的步骤收集上层有机相。向斗体2中再加入10ml正己烷，旋转旋塞5使正己烷进入离心瓶中，重复上述的萃取步骤，多次萃取后合并有机相，蒸干有机相得到泔水中的油脂，用于后续的分析。
实施例5
萃取装置在油水分离中的应用
石油采出液为油水混合物，内含固体杂质、高盐水和油相，在实验室中分离油相进行定量或定性分析测试时，取混匀的石油采出液20ml于离心瓶7内，在10000rpm下离心5分钟，按实施例1所述的方法组装离心瓶7与斗体2，分离上层油相，收集油相进行分析测试。
使用比重大于水的氯仿等有机溶剂萃取石油中的组分进行分析时，向装入石油采出液样品的离心瓶7中加入氯仿，盖紧瓶塞6并振荡，置于离心机中离心至两相分层，或静置至两相分层后取下瓶塞6，将斗体2与离心瓶7通过接口8密封连通，缓慢将萃取装置倒置并倾斜，转动旋塞5至通孔4与导管9导通，挤压离心瓶7侧壁，使下层萃取液通过导管9进入斗体2，并沿着斗体内壁流入储存容器，当上层样品溶液液面接近旋塞5上部时转动旋塞5至导管9处于封闭状态，使上层样品溶液截留在离心瓶7中，再正置萃取装置，从斗体加入氯仿，使其通过导管流入离心瓶中，重复萃取操作。最后合并萃取液用于分析。
实施例6
萃取装置在花生油脂提取中的应用
将花生洗净烘干，冷却后脱皮，用高速万能粉碎机粉碎，粉碎后过40目筛。称取5g花生粉于离心瓶中，加入热水，盖紧瓶塞，在100℃的水浴摇床中震荡60分钟，取出冷却至室温。加入5ml的石油醚涡旋震荡10分钟，在3000rpm下离心5分钟，按实施例1所述的方法组装离心瓶与斗体，分离获得上层油相，反复萃取3次后合并油相，用氮气吹干石油醚即得到花生油脂。
实施例7
萃取装置在葵花籽油脂提取中的应用
将待处理的葵花籽进行筛选、分拣、清理以去除杂质，除杂后在100℃-130℃的温度下热炒30分钟，使其含水率在5％以下。用研钵将葵花籽研碎，过40目筛。称取3g葵花籽粉于离心瓶中，加入5ml沸水，盖紧瓶塞，在100℃的水浴摇床中震荡30分钟，冷却后加入复合纤维素酶，调节pH至4.8,在50℃水浴锅中保温1小时，之后将温度升高至90℃保温30分钟。冷却至室温，向离心瓶中加入5ml正己烷漩涡震荡10分钟，在3000rpm下离心5分钟，按实施例1所述的方法组装离心瓶与斗体，分离获得上层油相，反复萃取3次后合并油相，用氮气吹干正己烷即得到葵花籽油脂。
实施例8
萃取装置在肉类油脂提取中的应用
将待测肉类样品用绞肉机绞碎，称取3g的试样于离心瓶中，加入10ml浓度为2M的盐酸溶液于100℃下加热90分钟，冷却至室温，加入10ml石油醚，漩涡震荡3分钟，按实施例1所述的方法组装离心瓶与斗体，分离获得上层油相，反复萃取3次后合并油相，用氮气吹干石油醚即得到肉类样品中的油脂。
实施例9
萃取装置在测定微生物油脂含量中的应用
本实施例所用菌种为高山被孢霉MortierellaalpinaATCC16266。
种子液培养：以30g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、0.1g/L磷酸二氢钾、0.1g/L硫酸镁、3g/L硝酸钠为种子液培养基，pH6.5-7.0，在28℃、120rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵培养：以60g/L葡萄糖、20g/L酵母膏、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、3g/L硝酸钠为发酵培养基，于500ml摇瓶中进行发酵培养，发酵温度28℃、转速150rpm培养5-6天。
发酵结束后吸取5ml的发酵液用滤纸过滤，并用去离子水洗涤3次，于60℃下烘干至恒重后称重。另取10ml发酵液于离心瓶中，加入15ml质量百分比浓度为37％的浓盐酸，盖紧瓶塞并震荡混匀。在60℃温度下温浴70分钟，取出放入冷水中冷却至25℃，向其中加入20ml石油醚萃取，振荡混匀，5000rpm下离心10秒至两相分层，取下瓶塞6，将斗体2与离心瓶7通过接口8密封连通，将旋塞5插入旋塞腔3并转动使其通孔4与导管9导通，用手缓慢挤压离心瓶7侧壁，使上层有机相通过导管9进入斗体2中，观察旋塞5部位，当下层水相液面贴近旋塞5上部时旋转旋塞5使通孔4与导管9处于非导通状态，使全部的下层样品溶液截留在离心瓶7中，而几乎全部的萃取有机相都进入斗体2，将斗体2中的萃取液倾倒至已知干重的管中，用少量石油醚清洗斗体2并合并管中，用氮气吹干。正置萃取装置，向斗体2中加入15ml石油醚，打开旋塞5使溶剂进入离心瓶7，取下离心瓶7并将其瓶口用瓶塞6盖紧，再次振摇混合，如此重复萃取。反应液用石油醚萃取3次，合并至同一离心管中，氮气吹干至恒重。计算每毫升发酵液中油脂的重量与每毫升发酵液中细胞干重的比值即得微生物细胞中总脂的含量为40.1％±0.3％。
实施例10
萃取装置在测定微生物油脂含量中的应用
本实施例所用藻种为裂殖壶菌Schizochytriumsp.CGMCC11382。
种子液培养：以20g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、15g/L海盐为种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以60g/L葡萄糖、5g/L玉米浆粉、5g/L谷氨酸钠、15g/L海盐为发酵培养基，于500ml摇瓶中进行发酵培养，发酵温度25℃、摇床转速200rpm，当糖浓度降至5g/L时向摇瓶中补糖。
发酵结束后准确量取0.5ml发酵液于已称重的2ml离心管中，4000rpm转速离心40秒，弃掉上清获得菌体，加入蒸馏水洗涤两次，于105℃下烘干2h至恒重。再准确量取2ml发酵液于离心瓶7中，加入2ml的质量百分比浓度为37％的浓盐酸溶液，盖紧瓶塞6并振荡混匀，在100℃温度下温浴10分钟，取出放入冷水中冷却至25℃，向其中加入2ml石油醚萃取，振荡混匀，5000rpm下离心10秒至两相分层，组装所述的萃取设备进行萃取，方法同实施例3，反应液用石油醚萃取3次，合并至同一离心管中，氮气吹干至恒重。计算每毫升发酵液中油脂的重量与每毫升发酵液中细胞干重的比值即得微生物细胞中总脂的含量为68.3％±0.7％。
实施例11
萃取装置在测定微生物油脂含量中的应用
本实施例所用藻种为裂殖壶菌Schizochytriumsp.CGMCC11382。
种子液培养：以20g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、15g/L海盐为种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以60g/L葡萄糖、5g/L玉米浆粉、5g/L谷氨酸钠、15g/L海盐为发酵培养基，于500ml摇瓶中进行发酵培养，发酵温度25℃、摇床转速200rpm。
发酵结束后准确量取1ml发酵液于已称重的2ml离心管中，4000rpm转速离心40秒，弃掉上清获得菌体，加入蒸馏水洗涤两次，于105℃下烘干2h至恒重。再准确量取2ml发酵液于离心瓶7中，加入8ml的质量百分比浓度为37％的浓盐酸溶液，盖紧瓶塞6并振荡混匀，在40℃温度下温浴100分钟，取出放入冷水中冷却至25℃，向其中加入5ml石油醚萃取，振荡混匀，5000rpm下离心10秒至两相分层，组装所述的萃取设备进行萃取，反应液用石油醚萃取3次，合并至同一离心管中，氮气吹干至恒重。计算每毫升发酵液中油脂的重量与每毫升发酵液中细胞干重的比值即得微生物细胞中总脂的含量为60.1％±0.5％。
实施例12
萃取装置在测定微生物油脂含量中的应用
本实施例所用藻种为裂殖壶菌Schizochytriumsp.CGMCC11382。
种子液培养：以20g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、15g/L海盐为种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以60g/L葡萄糖、5g/L玉米浆粉、5g/L谷氨酸钠、15g/L海盐为发酵培养基，于500ml摇瓶中进行发酵培养，发酵温度25℃、摇床转速200rpm。
发酵结束后准确量取3ml发酵液于已称重的5ml离心管中，4000rpm转速离心40秒，弃掉上清获得菌体，加入蒸馏水洗涤两次，于105℃下烘干2h至恒重。再准确量取7ml发酵液于离心瓶7中，加入13ml的质量百分比浓度为37％的浓盐酸溶液，盖紧瓶塞6并振荡混匀，在90℃温度下温浴50分钟，取出放入冷水中冷却至25℃，向其中加入15ml石油醚萃取，振荡混匀，5000rpm下离心10秒至两相分层，组装所述的萃取设备进行萃取，反应液用石油醚萃取3次，合并至同一离心管中，氮气吹干至恒重。计算每毫升发酵液中油脂的重量与每毫升发酵液中细胞干重的比值即得微生物细胞中总脂的含量为61.0％±0.7％。
实施例13
萃取装置在测定微生物油脂含量中的应用
本实施例所用藻种为裂殖壶菌Schizochytriumsp.CGMCC11382。
种子液培养：以20g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、15g/L海盐为种子液培养基，在25℃、200rpm的摇床中培养，制备种子液。
发酵罐培养：以60g/L葡萄糖、5g/L玉米浆粉、5g/L谷氨酸钠、15g/L海盐为发酵培养基，于500ml摇瓶中进行发酵培养，发酵温度25℃、摇床转速200rpm。
发酵结束后准确量取4ml发酵液于已称重的5ml离心管中，4000rpm转速离心40秒，弃掉上清获得菌体，加入蒸馏水洗涤两次，于105℃下烘干2h至恒重。再准确量取6ml发酵液于离心瓶7中，加入4ml的质量百分比浓度为37％的浓盐酸溶液，盖紧瓶塞6并振荡混匀，在100℃温度下温浴100分钟，取出放入冷水中冷却至25℃，向其中加入15ml石油醚萃取，振荡混匀，5000rpm下离心10秒至两相分层，组装所述的萃取设备进行萃取，反应液用石油醚萃取2次，合并至同一离心管中，氮气吹干至恒重。计算每毫升发酵液中油脂的重量与每毫升发酵液中细胞干重的比值即得微生物细胞中总脂的含量为60.3％±0.4％。
Claims (19)
1.一种萃取装置，包括上端开口的斗体(2)，开设于斗体(2)下部的导管(9)，设置于导管(9)中部且上下两端与其连通的旋塞腔(3)，以及与旋塞腔(3)内表面转动密封配合且开设有通孔(4)的旋塞(5)；其特征在于旋塞腔(3)上方的导管(9)及斗体(2)呈透明状，还包括一顶端开设瓶口的离心瓶(7)，该离心瓶(7)采用具有自复位功能的弹性材质制作，导管(9)下部外侧设有可与离心瓶(7)上端瓶口密封连通的接口(8)。
2.根据权利要求1所述的萃取装置，其特征在于所述的斗体(2)顶部侧壁开设有引流嘴(1)。
3.根据权利要求1所述的萃取装置，其特征在于所述的离心瓶(7)采用惰性材质制作。
4.根据权利要求1所述的萃取装置，其特征在于所述的接口(8)采用与离心瓶(7)上端瓶口适配的螺纹接口或速接密封接口。
5.根据权利要求1所述的萃取装置，其特征在于还包括一瓶塞(6)，该瓶塞(6)与离心瓶(7)的瓶口采用密封配合。
6.根据权利要求5所述的萃取装置，其特征在于所述的密封配合选用螺纹密封或胀紧密封。
7.根据权利要求1所述的萃取装置，其特征在于所述的旋塞(5)与旋塞腔(3)之间通过定位带捆绑定位。
8.根据权利要求1所述的萃取装置，其特征在于离心瓶(7)的外形与离心机的离心管适配。
9.根据权利要求1所述的萃取装置在萃取中的应用。
10.根据权利要求9所述的萃取装置在萃取中的应用，其特征在于包括如下步骤：
A、取样：量取样品溶液于萃取装置的离心瓶(7)中；
B、萃取：向离心瓶(7)中加入萃取剂，盖紧瓶塞(6)并振荡，置于离心机中离心至两相分层，或静置至两相分层后取下瓶塞(6)；
C、分离：将斗体(2)与离心瓶(7)通过接口(8)密封连通，转动旋塞(5)至通孔(4)与导管(9)导通，挤压离心瓶(7)侧壁，使上层萃取液通过导管(9)进入斗体(2)，当下层样品溶液液面接近旋塞(5)上部时转动旋塞(5)至导管(9)处于封闭状态，使下层样品溶液截留在离心瓶(7)中，而大部分萃取液都进入斗体(2)。
11.根据权利要求10所述的萃取装置在萃取中的应用，其特征在于步骤C中当萃取液处于离心瓶下层时，将萃取装置倒置释放出萃取液。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的萃取装置在萃取中的应用，其特征在于在步骤C后还包括一步骤D，该步骤的工艺条件如下：
D、多次萃取：针对所截留在离心瓶(7)中的样品溶液重复步骤B及步骤C。
13.根据权利要求1所述的萃取装置在油脂提取中的应用。
14.根据权利要求1所述的萃取装置在微生物油脂提取中的应用。
15.根据权利要求1所述的萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用。
16.根据权利要求15所述的萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用，其特征在于包括如下步骤：
A、取样：量取0.5-5ml发酵液样品于已知干重的离心管中，离心和洗涤微生物细胞，烘干称重得到细胞干重浓度；同时量取2-10ml发酵液样品于萃取装置的离心瓶(7)中，加入2-15ml质量百分比浓度为37％的浓盐酸，振荡混匀，将离心瓶(7)瓶口用瓶塞(6)密封；置于40-100℃水浴中保持10-100分钟，取出离心瓶(7)冷却至25℃；
B、破乳：向离心瓶(7)中加入2-20ml油脂萃取剂，盖紧瓶塞(6)并振荡，离心至两相分层；
C、萃取：取下瓶塞，将斗体(2)与离心瓶(7)通过接口(8)密封连通，转动旋塞(5)至通孔(4)与导管(9)导通，挤压离心瓶(7)侧壁，使上层有机相通过导管(9)进入斗体(2)，当下层水相液面接近旋塞(5)上部时转动旋塞(5)至导管(9)处于封闭状态，使下层样品溶液截留在离心瓶(7)中，而大部分萃取有机相都进入斗体(2)，针对所截留在离心瓶(7)中的样品溶液重复步骤B及步骤C；
D、测定：合并萃取液蒸干得到油脂并测定油脂含量。
17.根据权利要求16所述的萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用，其特征在于所述的步骤A中浓盐酸与发酵液样品混合后酸的质量浓度为15-30％。
18.根据权利要求16所述的萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用，其特征在于所述的步骤B中油脂萃取剂选用正己烷、石油醚中的一种或其结合。
19.根据权利要求16所述的萃取装置在测定微生物细胞油脂含量中的应用，其特征在于所述的步骤C中采用少量油脂萃取剂清洗斗体(2)并将清洗后的萃取液合并。
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