CN106615233A - 一种复合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制备方法，依次经过如下步骤：配制复合酶；酶解反应；灭活；真空干燥；渗漉提取；回收乙醇，收油除杂质；真空干燥粉碎，收集水解蛋白：其中复合酶由纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶三者按1:1:2 的重量比配制。实验结果表明用复合酶能有效降解螺旋藻细胞壁，打破脂蛋白和脂多糖对油脂的包埋作用，消除蛋白果酸和磷脂等两性物质的乳化作用，提高油脂收率，油脂回收率达到90%以上；复合酶对螺旋藻蛋白也有显著的水解效果，水解率达到80%以上。

Description

一种复合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种复合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制备方法。

背景技术

螺旋藻含有大量蛋自质、甘油三酯、色素、多糖等活性物质。其蛋白质在食品、医药、饲料等领域具有重要应用价值；而其甘油三酯，不但可作为重要营养保健品，且可作为生物能源(生物柴油)重要油料来源。螺旋藻所含的优质蛋白质和多种活性营养成分，其营养价值和保健功能已被广泛认同。螺旋藻蛋白由18种氨基酸组成并含有8种必需氨基酸，除作为营养补充剂之外，还有提高免疫力和抗肿瘤功效。螺旋藻富含长链多不饱和脂肪酸如DHA、EPA等，这些物质有利于人类生理健康调理和维护，补充营养，防止疾病的发生。DHA是一种重要的生物活性物质，有利于智力开发，尤其对于婴幼儿，而EPA可降低血液低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯的含量。市场流通的螺旋藻商品主要以干粉形式直接应用于食品行业，针对当前流行的保健品螺旋藻片“包治百病”的不合理性，我们采用复合酶法将螺旋藻中的活性油脂和活性蛋白分离，制成具有不同的生物活性的保健品原料，便于不同功效保健品的后续开发。

国内外对于螺旋藻成分的功效研究和有效成分提取分离已经有大量的研究，但是大多还是在实验室研究阶段，不适合规模化生产，而且也只对其中的某一活性成分提取而舍弃其他有效成分，造成资源浪费，以保健品工业原料为目的的活性油脂及活性蛋白有效成分分离提取研究并同时利用未见报道。本发明采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶等生物酶按比例组成复合酶，用安全无毒的溶剂（乙醇）提取螺旋藻活性油脂，水解分离活性蛋白，在提取油脂的同时利用蛋白，使资源利用最大化，而且技术工艺条件温和、高效、低成本，适合产业化，这应该是螺旋藻资源充分利用的一个大趋势。

现有技术未有同步提取螺旋藻活性蛋白和活性油脂方法，对于螺旋藻有效成分提取大多只对其中的某一成分提取而舍弃其他成分，造成资源浪费。目前螺旋藻主要以干粉形式直接应用于保健食品行业，由于其溶解性的局限性，其应用受到一定的限制，同时利用螺旋藻活性蛋白质和活性油脂，充分利用资源是螺旋藻应用的一个关键问题。

由于螺旋藻细胞较小、且具细胞壁结构，油脂都包裹在微藻细胞内，因此采用细胞破壁后进行提取是目前利用油脂一个难点。现有技术对螺旋藻油脂提取的传统方法是通过破壁后用有机溶剂提取，主要有机械超微粉碎破壁、热化学破壁提取、超临界流体提取、亚临界流体提取、超声波、微波辅助提取法、脉冲电磁场法等技术。也有学者用水酶法对其他微藻油脂进行提取，但是未见螺旋藻油脂酶法提取的完整报道。

对于螺旋藻蛋白质的提取主要有用水作为溶剂控制温度和pH值进行提取，也有用胃蛋白酶、碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶等单一酶种进行提取。

国内外对于螺旋藻成分的功效研究和有效成分提取分离已经有大量的研究，但是大多还是在实验室研究阶段，不适合规模化生产，大多也只对其中的某一活性成分提取而舍弃其他有效成分，造成资源浪费，未见有以保健品工业原料为目的的活性油脂及活性蛋白有效成分分离提取并同时利用的研究。

细胞破壁后用有机溶剂提取油脂的方法，由于细胞内存在脂蛋白和脂多糖，不仅阻碍油脂的提取，而且这些复合物本身会对油分子起包埋作用，传统的热处理难以打破这种包埋，热处理也会降低油脂的生物活性。单一酶种提取油脂虽然能够降解部分包埋复合物，但是对于细胞中的多糖类物质降解不充分，出现一定的乳化现象，影响油脂提取率。用单一蛋白酶提取蛋白质也是由于对多糖类物质降解不完全，影响工具酶的作用力而降低小分子的高活性多肽和氨基酸生成。

发明内容

为了解决上述问题，本发明目的是提供一种能较完全的提取活性油脂类物质，油脂品质好，提取率高。酶解条件温和，蛋白质不变性，水解更加彻底，小分子蛋白质活性更高，更易被吸收。将活性物质分成油脂和水解蛋白两部分，其产品更具针对性和竞争力。使用食用乙醇作为油脂提取溶剂，避免了毒性溶剂残留的风险，产品更安全的复合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制备方法。

本发明包括以下步骤：

步骤1.配制复合酶：准确称取商品工业酶纤维素酶（80000～100000U/g）、果胶酶（80000～100000U/g）和木瓜蛋白酶（80000～100000U/g），按纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶=1:1:2的重量比例混合均匀作为复合酶备用；

步骤2.酶解反应：称取螺旋藻干粉，置于控温酶解反应罐中，按比例添加0.8-1.2%重量的复合酶，按螺旋藻干粉加10倍重量的水，用10%的氢氧化钠或10%的盐酸调节pH值至6.5-7.5之间，调节反应温度为35-45℃，保温酶解反应20-24小时；

步骤3.灭活：将控温酶解反应罐温度调升至80-90℃，保持15-20分钟，关闭加热器，打开出料盖，自然降温至室温，得到糊状的酶解物；

步骤4.真空干燥：将步骤3得到糊状的酶解物装于真空干燥盘中，放进真空干燥箱中开机干燥，调节温度为50-60℃、压力-80～-100KPa，待物料基本成为固体时关机翻动物料以提高干燥速度并使物料干燥均匀， 干燥3-5小时后关机取样测定物料水分含量，水分含量低于5%则视为干燥完成，取出物料装于密闭容器中备用；

步骤5、渗漉提取：把上述干料用破碎机打粉，过12目筛网，装于渗漉筒中，用95%食用乙醇渗漉提取，收集渗漉液，至漉出液接近无色为提取完全；

步骤6.回收乙醇，收油除杂质：渗漉液蒸馏回收乙醇至粘稠状，装于开口锅中用水浴搅拌挥去多余的乙醇，剩余液体装于不锈钢容器中，加等容量的2-3%盐水搅拌均匀，以洗除油脂中的水溶性杂质，静置60-72小时，吸取上层近透明的液体即为螺旋藻油脂成品，分装于密闭容器中；

步骤7.真空干燥粉碎，收集水解蛋白：取渗漉残渣于真空干燥箱中，调节温度为50-60℃、压力-80～-100KPa,干燥至水分含量低于3-5%，粉碎过100目筛，密闭分装即为螺旋藻水解蛋白粉。

本发明所述的百分比，除特别说明外，均为质（重）量百分比。

本发明的有益效果是，由于采用上述技术方案，本发明经过酶解和提油后得到螺旋藻活性油脂油和活性水解蛋白两大类物质，活性油脂经过进一步提取分离得到DHA和EPA等长链不饱和脂肪酸，可以作为食品添加剂或医药保健品原料直接销售，也可以把油脂直接制成保健品螺旋藻油软胶囊或其他功能制品。活性水解蛋白可以直接制成螺旋藻水解蛋白片或口服液等保健品制剂，也可以作为如婴幼儿奶粉、米粉等食品添加剂。螺旋藻活性油脂因含有长链不饱和脂肪酸而具有降血脂、抗氧化衰老、抗辐射等作用；活性水解蛋白能有效清除自由基对组织细胞的损害，提高免疫功能，预防疾病而促进人体健康。这两类活性物质因其营养价值和特有的功效作为食品添加剂和保健品原料具有广阔的应用前景。实验结果表明用复合酶能有效降解螺旋藻细胞壁，打破脂蛋白和脂多糖对油脂的包埋作用，消除蛋白果酸和磷脂等两性物质的乳化作用，提高油脂收率，油脂回收率达到90%以上；复合酶对螺旋藻蛋白也有显著的水解效果，水解率达到80%以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明

实施例1：准确称取纤维素酶0.5克（80000～100000U/g），果胶酶0.5克（80000～100000U/g），木瓜蛋白酶1.0克（80000～100000U/g），置于具塞玻璃三角瓶中，摇晃混合均匀，配制为复合酶。另称取螺旋藻干粉200克，与复合酶一起置于2500毫升烧杯中，量取2000毫升（或称重2000克）蒸馏水缓慢加入烧杯中，边加边用玻璃棒搅拌均匀，用pH试纸测试pH值，如果不在6.5-7.5范围内，则必须滴加10%的氢氧化钠或10%的盐酸试剂调节pH值至7.0，开口封盖牛皮纸，将烧杯移进恒温箱中，开启恒温箱电源，把温度表刻度调至35℃，恒温保持酶解反应20小时。酶解时间到达终点后，把恒温箱温度调节至80℃保持15分钟将酶活性灭失。关闭电源，取出烧杯，打开纸封，自然降温至室温，得到糊状酶解物。将上述糊状的酶解物装于真空干燥盘中，放进真空干燥箱中开机干燥，调节温度为50℃、压力-80KPa，待物料基本成为固体时关机翻动物料以提高干燥速度并使物料干燥均匀，约3-5小时关机取样测定物料水分含量，如水分含量低于5%则视为干燥完成。干料破碎，过12目筛网，装于渗漉筒中，用95%食用乙醇渗漉提取，收集渗漉液，至漉出液接近无色为提取完全；渗滤液蒸馏回收乙醇，渗漉液回收乙醇至粘稠状，装于烧杯中用水浴搅拌挥去多余的乙醇，加等容量的2%盐水（重量比）搅拌均匀，以洗除油脂中的水溶性杂质，静置60小时，吸取上层近透明的液体即为螺旋藻油脂成品，分装于密闭容器中。取渗漉残渣于真空干燥箱中，调节温度为50℃、压力-100KPa,干燥至水分含量低于3%，粉碎过100目筛，密闭分装即为螺旋藻水解蛋白粉。

实施例2：准确称取纤维素酶2.5克（80000～100000U/g），果胶酶2.5克（80000～100000U/g），木瓜蛋白酶5.0克（80000～100000U/g），置于具塞玻璃三角瓶中，摇晃混合均匀，配制为10克的复合酶。另称取螺旋藻干粉1000克，与复合酶一起置于15升不锈钢桶中，称重10公斤蒸馏水缓慢倒入桶中，边加边搅拌均匀，用pH试纸测试pH值，如果不在6.5-7.5范围内，则必须添加10%的氢氧化钠或10%的盐酸试剂调节pH值至7.0，叠加桶盖，将桶移进恒温箱中，开启恒温箱电源，把温度表刻度调至45℃，恒温保持酶解反应24小时。酶解时间到达终点后，把恒温箱温度调节至90℃保持20分钟将酶活性灭失。关闭电源，取出烧杯，打开纸封，自然降温至室温，得到糊状酶解物。将上述糊状的酶解物装于真空干燥盘中，放进真空干燥箱中开机干燥，调节温度为60℃、压力-100KPa，待物料基本成为固体时关机翻动物料以提高干燥速度并使物料干燥均匀， 5小时关机取样测定物料水分含量，如水分含量低于5%则视为干燥完成。干料破碎，过12目筛网，装于渗漉筒中，用95%食用乙醇渗漉提取，收集渗漉液，至漉出液接近无色为提取完全；渗滤液蒸馏回收乙醇，渗漉液回收乙醇至粘稠状，装于烧杯中用水浴搅拌挥去多余的乙醇，加等容量的3%盐水（重量比）搅拌均匀，以洗除油脂中的水溶性杂质，静置72小时，吸取上层近透明的液体即为螺旋藻油脂成品，分装于密闭容器中。取渗漉残渣于真空干燥箱中，调节温度为60℃、压力-80KPa,干燥至水分含量低于3%，粉碎过100目筛，密闭分装即为螺旋藻水解蛋白粉。

实施例3：准确称取纤维素酶50克（80000～100000U/g），果胶酶50克（80000～100000U/g），木瓜蛋白酶100克（80000～100000U/g），置于具塞玻璃三角瓶中，摇晃混合均匀，配制为200克的复合酶。另称取螺旋藻干粉20公斤，与复合酶一起置于控温酶解反应罐中，称重200公斤蒸馏水缓慢倒入罐中，边加边搅拌均匀，用pH试纸测试pH值，如果不在6.5，则必须添加10%的氢氧化钠或10%的盐酸试剂调节pH值至7.0，把罐盖盖上，开启反应罐电源，把温度表刻度调至40℃，恒温保持酶解反应22小时。酶解时间到达终点后，把温度调节至85℃保持17分钟将酶活性灭失。关闭电源，使温度降至室温，得到糊状酶解物。将酶解物倒装于真空干燥盘中，放进真空干燥箱中开机干燥，调节温度为55℃、压力-85KPa，待物料基本成为固体时关机翻动物料以提高干燥速度并使物料干燥均匀，4小时关机取样测定物料水分含量，如水分含量低于5%则视为干燥完成。干料破碎，过12目筛网，装于渗漉筒中，用95%食用乙醇渗漉提取，收集渗漉液，至漉出液接近无色时为提取完全；渗滤液蒸馏回收乙醇，渗漉液回收乙醇至粘稠状，装于不锈钢桶中用水浴搅拌挥去多余的乙醇，加等容量的2.5%盐水（重量比）搅拌均匀，以洗除油脂中的水溶性杂质，静置66小时，吸取上层近透明的液体即为螺旋藻油脂成品，分装于密闭容器中。取渗漉残渣于真空干燥箱中，调节温度为55℃、压力-90KPa,干燥至水分含量低于4%，粉碎过100目筛，密闭分装即为螺旋藻水解蛋白粉。

本发明的原理是：应用复合酶降解螺旋藻细胞壁，打破脂蛋白和脂多糖对油脂的包埋作用，消除蛋白果酸和磷脂等两性物质的乳化作用，提高油脂收率，提高蛋白质水解度。本发明能较完全的提取活性油脂类物质，油脂透明无杂质，提油率达到90%以上。酶解条件温和，蛋白质不变性，水解更加彻底，水解蛋白为小分子的蛋白质、多肽和氨基酸的混合物质，更易被吸收。将活性物质分成油脂和蛋白两部分，其产品更具针对性和竞争力。使用乙醇作为油脂提取溶剂，避免了毒性溶剂残留的风险。

Claims (4)

1.一种复合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤1.配制复合酶：准确称取商品工业酶纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，混合均匀作为复合酶备用；

步骤2.酶解反应：称取螺旋藻干粉，置于控温酶解反应罐中，按比例添加0.8-1.2%重量的复合酶，按螺旋藻干粉加10倍重量的水，用浓度为10%的氢氧化钠或浓度为10%的盐酸调节pH值至6.5-7.5之间，调节反应温度为35-45℃，保温酶解反应20-24小时；

步骤3.灭活：将控温酶解反应罐温度调升至80-90℃，保持15-20分钟，关闭加热器，打开出料盖，自然降温至室温，得到糊状的酶解物；

步骤4.真空干燥：将步骤3得到糊状的酶解物装于真空干燥盘中，放进真空干燥箱中开机干燥，调节温度为50-60℃、压力-80～-100KPa，待物料基本成为固体时关机翻动物料以提高干燥速度并使物料干燥均匀，干燥3-5小时后关机取样测定物料水分含量，水分含量低于5%则视为干燥完成，取出物料装于密闭容器中备用；

步骤5、渗漉提取：把上述干料用破碎机打粉，过12目筛网，装于渗漉筒中，用95%食用乙醇渗漉提取，收集渗漉液，至漉出液接近无色为提取完成；

步骤6.回收乙醇，收油除杂质：渗漉液采用蒸馏方法回收乙醇至粘稠状，装于开口锅中用水浴搅拌挥去多余的乙醇，剩余液体装于不锈钢容器中，加等容量的2-3%盐水搅拌均匀，以洗除油脂中的水溶性杂质，静置60-72小时，吸取上层近透明的液体即为螺旋藻油脂成品，分装于密闭容器中；

步骤7.真空干燥粉碎，收集水解蛋白：取渗漉残渣于真空干燥箱中，调节温度为50-60℃、压力-80～-100KPa,干燥至水分含量低于3-5%，粉碎过100目筛，密闭分装即为螺旋藻水解蛋白粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤1中，所述纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶三者之间的重量比为1:1:2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤6中，所述螺旋藻油脂成品的提油率达到90%以上。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水解蛋白为小分子的蛋白质、多肽和氨基酸的混合物质。