CN107727776A - 一种南极磷虾β‑蜕皮激素的提取及高效液相检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种南极磷虾β‑蜕皮激素的提取及高效液相检测方法，以新鲜冷冻南极磷虾为材料，进行解冻和组织剪碎处理，用甲醇超声提取，正己烷去脂，并在‑20℃条件下冷冻去掉其他杂质，得到含β‑蜕皮激素的提取物，南极磷虾β‑蜕皮激素的检测采用高效液相的检测方法，条件为UV/Visible检测器，YMC‑PACK ODS‑A250×4.6mml.D.S色谱柱，流动相甲醇‑水，等度洗脱，检测波长248nm，并用Breeze软件跟踪并积分峰面积，得到南极磷虾中β‑蜕皮激素的含量，该操作方法简单、快速，结果准确、可靠。

Description

一种南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相检测方法
技术领域
本发明涉及一种南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相检测方法，属于食品和化工技术领域。
背景技术
β-蜕皮激素，又名β-蜕皮甾酮、20-羟基蜕皮甾酮；分子式为C27H44O7，分子量为480.63道尔顿，是一种淡黄色结晶粉末。在动植物体内，β-蜕皮激素参与蜕皮、生殖、寿命、滞育及免疫应答等众多方面的调节，对维持基本的生理功能具有重要作用。β-蜕皮激素作用于人体可以促进细胞的生长分裂，加速胶原蛋白的合成，刺激真皮细胞分裂，促进皮肤再生。同时大量的动物实验证明，β-蜕皮激素能够排除体内胆固醇，促进蛋白质、碳水化合物、脂质代谢，具有显著的降血脂和降血糖的功效，能够保护神经系统、肝脏和心血管系统，是一种重要的天然抗癌制剂。
南极磷虾(Euphausia superba)，主要生活在南极洲的南冰洋水域，是南极洲生态系统的重点物种，为鲸鱼、海豹、企鹅等提供了重要的食物来源。南极磷虾储量巨大，并多以群居方式生活，易采集捕捞。南极磷虾含有丰富的脂类和高质量的蛋白质，具有巨大的应用价值。目前，对于南极磷虾的应用主要集中于作为鱼类饵料以及加工磷虾油保健产品。因此，若以南极磷虾为原料，开发天然激素类药物，对于增加利用价值，具有广阔的应用前景。
β-蜕皮激素系在露水草中首次发现，因其在植物中含量丰富，目前对于β-蜕皮激素的研究植物中较多，对于植物中β-蜕皮激素的提取多采用水煮联合乙醇提取，并经柱层析或石油醚脱脂提纯，提取步骤复杂，耗时长；而对于植物中β-蜕皮激素的检测，目前有薄层扫描法、放射免疫测定法、液相色谱法等，如CN103837615A公开了一种应用高效液相色谱法同时测定植物蜕皮激素类物质的方法，许栗榕公开了露水草β-蜕皮甾酮的提取、纯化工艺及其质量标准研究，王强等公开了19种资源植物中β-蜕皮激素的含量测定(薄层层析和高效液相)，但所述方法仍存在前处理较为繁琐、样品用量大、结果准确性低等缺点。动物中的β-蜕皮激素在昆虫和甲壳动物十足目的报道较多，多采用取动物血清或淋巴液，再经多次提取，纯化，并用配置的溶解液溶解，进行酶联免疫检测或高效液相、液相色谱-串联质谱法检测，如赵鹏等公开了高效液相色谱-三重四级杆质谱分析海洋甲壳动物淋巴和肌肉中的20-羟基蜕皮酮的研究，但其操作较为复杂，现有检测中酶联免疫价格昂贵，耗时较长。
目前尚未有关于从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及分析检测的报道。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种操作简单、提取充分、除杂良好的南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法。
本发明的另一目的在于提供一种简单、快速、准确、可靠的南极磷虾β-蜕皮激素的检测方法。
为实现上述目的，具体的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法，步骤如下：
(1)取冷冻南极磷虾解冻，并将其进行组织剪碎处理；
(2)取剪碎的南极磷虾和甲醇混合进行超声提取，过滤提取液，收集滤液；
(3)将滤液旋转蒸发，得到β-蜕皮激素的粗提物；
(4)将粗提物用甲醇完全溶解，加入等体积的正己烷，混匀，离心，弃去上清；
(5)将步骤(4)离心后的下层液体进行冷冻处理，析出白色沉淀后，吸取上清，弃去沉淀，将上清液旋转蒸发后有机滤膜过滤，获得南极磷虾β-蜕皮激素提取物。
本发明利用甲醇提取β-蜕皮激素，通过超声的方式可以充分提取，且耗时短，提取的得率高，比采用其他提取试剂(如乙醇)提取杂质少；用正己烷离心去脂，可以脱出南极磷虾中大量的脂类物质和虾青素酯等；此外，采取冷冻的南极磷虾进行预处理提取β-蜕皮激素结合正己烷离心去脂后进行冷冻处理的操作，不仅减少了甲醇提取时干扰杂质的进入，而且冷冻处理辅助正己烷离心，排除了南极磷虾中脂含量高且虾青素酯具有鲜亮的红色的影响，冷冻可以进一步除去未除净的杂质，避免对高效液相检测的干扰。
本发明步骤(1)中，经冷冻处理的南极磷虾冷冻处理的温度为-45℃～-80℃。冷冻处理的南极磷虾中，一方面β-蜕皮激素代谢损失少能增加本就痕量的β-蜕皮激素的提取量；另一方面减少了甲醇提取时干扰杂质的引入。优选的，步骤(1)为：取冷冻南极磷虾，在5％生理盐水中解冻，解冻时间2-4h，将解冻处理的南极磷虾吸干水分，并将其进行组织剪碎处理。步骤(1)所述，将南极磷虾组织剪碎，组织剪碎有助于增大接触面积，解决南极磷虾体型小，不利于提取淋巴液的特征，显著增加提取率。
具体的实施方式中，步骤(2)中取剪碎的南极磷虾(W)和甲醇(V)以1：10-15的比例混合进行超声提取；优选的，超声提取的条件为:30℃-38℃、250-350W、30-50kHz的条件下超声提取1-2h；更为优选，超声提取的条件为：35℃、300W、40kHz的条件下超声提取1h。通过超声提取，使得甲醇提取溶剂充分的浸入南极磷虾粉碎组织中，最大化的发挥甲醇的提取效率。
步骤(3)中将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为45-55℃，得到β-蜕皮激素的粗提物；更为优选的，旋蒸温度为50℃。
步骤(4)中，将粗提物用甲醇完全溶解，加入等体积的正己烷，超声混匀，2800-3200rpm，4℃条件下离心25-35min，弃去上清，重复三次。本发明步骤(4)用正己烷去脂，不仅排除南极磷虾中含量高的脂，且排除了高含量的鲜红色虾青素的干扰。利用超声空化效应，提高溶液混匀效率，以便更为有效的进行脱脂除杂。重复三次以上，脱脂除杂率可达98％以上。步骤(4)中超声混匀条件为，25-35℃，250-350w，40kHz；优选的条件为35℃，300w，40kHz。
步骤(5)中，将下层液体放入-20℃冰箱，析出白色沉淀后，吸取上清，弃去沉淀，将上清液旋转蒸发至一定体积，用0.22μm的有机滤膜过滤，作为样品液备用。
本发明的第二方面，提供一种南极磷虾中β-蜕皮激素的检测方法，
采用上述方法步骤(1)-(5)提取南极磷虾β-蜕皮激素；此外还包括如下步骤：
(6)以步骤(5)获得的南极磷虾β-蜕皮激素提取物作为样品液，称取β-蜕皮激素标准品溶于甲醇制备标准液；
(7)采用高效液相色谱检测标准液和样品液，高效液相色谱的检测条件为：紫外/可见光检测器，YMC-PACK ODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱，流动相为甲醇-水，检测波长248nm；
(8)通过软件进行高效液相峰面积定量，得到样品中β-蜕皮激素的浓度。
本发明中通过对色谱柱-检测器以及流动相和检测波长的组合优化，实现了β-蜕皮激素标准品和样品的检测峰的有效分离，通过峰面积定量可以在低检测限下实现南极磷虾中β-蜕皮激素的含量检测。优选的，高效液相色谱的检测条件为：Waters1525BianaryHPLC泵，Waters 2489UV/Visible检测器，YMC-PACKODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱。
具体的实施方式中，本发明步骤(6)中，精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1.0ml甲醇，得浓度为1.0mg/ml的标准液。
优选的，步骤(7)中，流动相为甲醇：水＝40:60，流速：1ml/min，等度洗脱。本发明检测方法，使得样品在标准品出峰的时间有一明显的小峰，对于南极磷虾中痕量的β-蜕皮激素有较好的检测效果，且采用简单的等度洗脱，操作简单，峰面积定量准确可靠。
优选的一个实施例中，步骤(7)中，用进样针吸取20ul标准液或样品液，通过Waters手动进样阀进行单进样，洗脱时间30min，用Breeze软件进行监视；标准品的保留时间为23.698min，样品中在23.267min处有一小峰。
本发明取得了以下有益效果：
本发明以南极磷虾为材料提取β-蜕皮激素，甲壳动物中蜕皮激素为痕量，南极磷虾的生物储量巨大，以其开发天然药物，对于痕量的物质可以通过增大其基数量进行提取研究。
南极磷虾体型小，无法采取取血清或淋巴液的检测方法，且体内脂含量及虾青素含量十分高，提取物呈鲜艳红色，极大的影响了痕量β-蜕皮激素的检测。利用甲醇提取β-蜕皮激素，通过超声的方式可以充分提取，且耗时短，提取的得率高，比用乙醇提取杂质少，用正己烷离心去脂，排除了南极磷虾中脂含量高，且虾青素酯具有鲜亮的红色的影响，冷冻可以除去未除净的杂质。整个提取过程操作简单，耗时短，且可以充分的去除影响β-蜕皮激素检测的杂质，是一种简易可行，耗时短，提取率高，且可充分除杂的南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法。
本发明利用高效液相色谱进行检测，检测限低，所用样品量少，样品在标准品出峰的时间有一明显的小峰，对于南极磷虾中痕量的β-蜕皮激素有较好的检测效果，且采用简单的等度洗脱，操作简单，峰面积定量准确可靠，是一种准确、可靠的适用于南极磷虾β-蜕皮激素的检测方法。
附图说明
图1为设定检测波长为248nm时β-蜕皮激素标准品的洗脱峰及其保留时间。
图2为设定检测波长为248nm时样品的洗脱峰及其保留时间。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应当强调的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相色谱检测
1、南极磷虾β-蜕皮激素的提取，步骤如下:
(1)取冷冻南极磷虾，在5％生理盐水中解冻，解冻时间3h，将解冻处理的南极磷虾吸干水分，并将其进行组织剪碎处理；
(2)取剪碎的南极磷虾(w)和甲醇(v)以1:5-8的比例在35℃、300w、40kHz的条件下超声提取，每次30min，提取3次，过滤提取液，将3次提取液合并；
(3)将上述滤液置于旋转蒸发仪中蒸干，旋蒸温度为50℃，得到β-蜕皮激素粗提物；
(4)将粗提物用40ml甲醇完全溶解，加入等体积的正己烷，超声混匀，3000rpm，4℃条件下离心30min，弃去上清，重复三次；
(5)将下层液体放入-20℃冰箱，析出白色沉淀后，吸取上清，弃去沉淀，将上清液旋转蒸发至3ml，用0.22μm的有机滤膜过滤，作为样品液备用。
2、南极磷虾β-蜕皮激素的高效液相检测：
(1)精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品(Sigma公司)溶于1.0ml甲醇，得浓度为1.0mg/ml的标准液；
(2)高效液相色谱的检测条件为：Waters 1525BianaryHPLC泵，Waters 2489UV/Visible检测器，YMC-PACK ODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱；流动相：甲醇：水＝40:60，流速：1ml/min，等度洗脱，检测波长248nm。
(3)用进样针吸取20ul标准液，通过Waters手动进样阀进行单进样，洗脱时间30min，用Breeze软件进行监视；
(4)用进样针吸取20ul样品液，通过Waters手动进样阀进行单进样，洗脱时间30min，用Breeze软件进行监视；
(5)标准品的保留时间为23.698min，样品中在23.267min处有一小峰，通过Breeze软件进行峰面积定量，得到样品中β-蜕皮激素的浓度。标准品和样品的洗脱峰及其保留时间参见图1和图2所示。
实施例2：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相色谱检测
冷冻南极磷虾，于5％生理盐水中解冻，解冻时间3h，吸干水分，取100g解冻的南极磷虾进行组织剪碎，放入1000ml烧杯，加入甲醇500ml，在25℃、250w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，每次提取30min，重复3次，合并提取液，并过滤，将滤液在旋转蒸发仪中蒸干，蒸发温度50℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。
将粗提物用40ml甲醇完全溶解，加入等体积正己烷，超声混匀，4℃条件下3000rpm离心30min，弃去上清，重复三次，将下层溶液放置于-20℃冰箱，取上清，去除杂质，将上清液在旋转蒸发仪中蒸至3ml，蒸发温度50℃，用0.22μm有机滤膜过滤，得到样品液。
精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1ml甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。
取标准品液和样品液20μL进行高效液相检测，高效液相条件：Waters1525Bianary HPLC泵，Waters 2489UV/Visible检测器，YMC-PACK ODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱。流动相：甲醇：水＝40:60，流速：1ml/min，等度洗脱，检测波长248nm，用Breeze软件积分峰面积定量，得到南极磷虾中β-蜕皮激素的含量6.31μg/g。
实施例3：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相色谱检测
冷冻南极磷虾，于5％生理盐水中解冻，解冻时间3h，吸干水分，取100g解冻的南极磷虾组织剪碎，放入1000ml烧杯，加入甲醇800ml，在30℃、300w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，每次提取30min，重复3次，合并提取液，并过滤，将滤液在旋转蒸发仪中蒸干，蒸发温度50℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。
将粗提物用40ml甲醇完全溶解，加入等体积正己烷，超声混匀，4℃条件下3000rpm离心30min，弃去上清，重复三次，将下层溶液放置于-20℃冰箱，取上清，去除杂质，将上清液在旋转蒸发仪中蒸至3ml，蒸发温度50℃，用0.22μm有机滤膜过滤，得到样品液。
精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1ml甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。
取标准品液和样品液20μL进行高效液相进行检测，高效液相条件：Waters1525Bianary HPLC泵，Waters 2489UV/Visible检测器，YMC-PACK ODS-A250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱。流动相：甲醇：水＝40:60，流速：1ml/min，等度洗脱，检测波长248nm，用Breeze软件积分峰面积定量,得到南极磷虾中β-蜕皮激素的含量为6.35μg/g。
实施例4：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相色谱检测
冷冻南极磷虾，于5％生理盐水中解冻，解冻时间3h，吸干水分，取100g解冻的南极磷虾组织剪碎，放入1000ml烧杯，加入甲醇600ml，在35℃、350w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，每次提取30min，重复3次，合并提取液，并过滤，将滤液在旋转蒸发仪中蒸干，蒸发温度50℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。
将粗提物用40ml甲醇完全溶解，加入等体积正己烷，超声混匀，4℃条件下3000rpm离心30min，弃去上清，重复三次，将下层溶液放置于-20℃冰箱，取上清，去除杂质，将上清液在旋转蒸发仪中蒸至3ml，蒸发温度50℃，用0.22μm有机滤膜过滤，得到样品液。
精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1ml甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。
取标准品液和样品液20μL进行高效液相进行检测，高效液相条件：Waters1525Bianary HPLC泵，Waters 2489UV/Visible检测器，YMC-PACK ODS-A250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱。流动相：甲醇：水＝40:60，流速：1ml/min，等度洗脱，检测波长248nm。用Breeze软件积分峰面积定量。得到南极磷虾中β-蜕皮激素的含量为6.27μg/g。
试验例1：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效液相色谱检测
冷冻南极磷虾，于5％生理盐水中解冻，解冻时间3h，吸干水分，取100g解冻的南极磷虾组织剪碎，放入1000ml烧杯，加入甲醇600ml，在35℃、350w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，每次提取30min，重复3次，合并提取液，并过滤，将滤液在旋转蒸发仪中蒸干，蒸发温度50℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。
将粗提物用40ml甲醇完全溶解，加入等体积正己烷，超声混匀，4℃条件下3000rpm离心30min，弃去上清，重复三次，将下层溶液在旋转蒸发仪中蒸至3ml，蒸发温度50℃，用0.22μm有机滤膜过滤，得到样品液。
精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1ml甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。
取标准品液和样品液20μL进行高效液相进行检测，采用多种高效色谱条件进行检测，包括C18反相柱色谱分离、YMC-PACK ODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱分离，以及甲醇、乙腈、水等流动相的选择，均较难实现β-蜕皮激素有效峰的分离。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取冷冻南极磷虾解冻，并将其进行组织剪碎处理；
(2)取剪碎的南极磷虾和甲醇混合进行超声提取，过滤提取液，收集滤液；
(3)将滤液旋转蒸发，得到β-蜕皮激素的粗提物；
(4)将粗提物用甲醇完全溶解，加入等体积的正己烷，混匀，离心，弃去上清；
(5)将步骤(4)离心后的下层液体进行冷冻处理，析出白色沉淀后，吸取上清，弃去沉淀，将上清液旋转蒸发后有机滤膜过滤，获得南极磷虾β-蜕皮激素提取物。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，经冷冻处理的南极磷虾冷冻处理的温度为-45℃～-80℃；优选的，步骤(1)为：取冷冻南极磷虾，在5％生理盐水中解冻，解冻时间2-4h，将解冻处理的南极磷虾吸干水分，并将其进行组织剪碎处理。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中取剪碎的南极磷虾和甲醇以W/V为1：10-15的比例混合进行超声提取；优选的，超声提取的条件为:30℃-38℃、250-350W、30-50kHz的条件下超声提取1-2h；更为优选，超声提取的条件为：35℃、300W、40kHz的条件下超声提取1h。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为45-55℃，得到β-蜕皮激素的粗提物；优选的，旋蒸温度为50℃。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，将粗提物用甲醇完全溶解，加入等体积的正己烷，超声混匀，2800-3200rpm，4℃条件下离心25-35min，弃去上清，重复三次；优选的，步骤(4)中超声混匀条件为，25-35℃，250-350w，40kHz；优选的，超声混匀条件为35℃，300w，40kHz。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)中，将下层液体放入-20℃冰箱，析出白色沉淀后，吸取上清，弃去沉淀，将上清液旋转蒸发至一定体积，用0.22μm的有机滤膜过滤，作为样品液备用。
7.一种南极磷虾中β-蜕皮激素的检测方法，其特征在于，
采用权利要求1-6任一项提取方法中步骤(1)-(5)提取南极磷虾β-蜕皮激素；此外还包括如下步骤：
(6)以步骤(5)获得的南极磷虾β-蜕皮激素提取物作为样品液，称取β-蜕皮激素标准品溶于甲醇制备标准品液；
(7)采用高效液相色谱检测标准品液和样品液，高效液相色谱的检测条件为：紫外/可见光检测器，YMC-PACK ODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱，流动相为甲醇-水，检测波长248nm；
(8)通过软件进行高效液相峰面积定量，得到样品中β-蜕皮激素的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的检测条件为：Waters1525BianaryHPLC泵，Waters 2489UV/Visible检测器，YMC-PACK ODS-A 250×4.6mml.D.S-5μm.12nm色谱柱。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(6)中，精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1.0ml甲醇，得浓度为1.0mg/ml的标准液。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(7)中，流动相为甲醇：水＝40:60，流速：1ml/min，等度洗脱。
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