CN105289773B - 一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法 - Google Patents

Abstract

一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，包括取样灭活、样品均质与研磨、离心过滤等步骤，通过对各组织部位分开取样，采用液氮迅速冷冻灭活，在液氮环境中采用高速震荡进行样品均质和研磨，在得到混合样品后采用超声波辅助提取，最后高速离心去除蛋白质。克服了传统方法温度变化、容易被污染、样品浪费多、可重复性较差、混样不均、工作效率较低、操作危险系数高、对操作人员的熟练程度及工作经验要求高等缺陷。该发明能够很好的运用于茶树等木本植物样品坚硬组织取样、均质、研磨、提取的前处理方法，是一种进行代谢组学分析测试的快速、无损、无污染的样品前处理技术，该方法处理样品还可用于品质成分分析、RNA提取、蛋白质组学分析等。

Description

一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法

技术领域

本发明涉及一种高效的新鲜植物组织样品的代谢组分析快速处理方法，具体地说，是对茶树等木本植物新鲜组织（含叶片、嫩茎、根）进行代谢组学分析测试的快速、无损、无污染的样品前处理技术。该方法处理样品还可用于品质成分分析、RNA提取、蛋白质组学分析等多种检测。

背景技术

代谢组学技术逐渐在品种分析、代谢机理的研究方面体现强大的优势。但是代谢组学方法对样品前处理技术要求很高，代谢物对环境变化敏感，处理条件要求较高。由于很多代谢反应可以在1 s以内发生，所以样品前处理过程不仅要求绝对低温处理，而且所有转移步骤和操作过程也必须不产生温度变化。

很多组学研究文献表明，植物代谢组学分析中的主要误差来至样品准备和前处理，并提出了植物样品前处理必须遵守的基本要求，即可重复性、无损、无污染。然而，现有用于拟南芥、水稻研究的代谢组学样品前处理方法在茶叶等木本植物样品中的运用具有较大的局限性，主要表现在：

茶树等木本植物，组织体积较大、取样的均一性很容易对结果造成误差，因此传统方法对实验人员的技术熟练程度要求较高。

茶树等木本植物，组织坚硬，对与研磨和提取有更高的要求，传统研磨方法直接在敞开的大量液氮中操作，不仅操作危险性高，而且研磨效率极低。

茶树等木本植物富含多种易受环境影响而氧化的特殊次级代谢成分，特别是茶树中富含抗氧化活性极强的多酚类物质，对环境变化（如空气暴露，温度）极为敏感，容易发生氧化反应。

当前主要采用研钵研磨样品，并添加液氮，需要来回转移，清洗研钵等过程，该方法不仅对样品造成大量的浪费，并且很容易造成污染。

总之，当前所采用的方法很容易使样品被污染，可重复性差，且工作效率低，其样品前处理过程费时、费力，对操作人员的熟练程度及工作经验要求较高，与代谢组学的高通量技术要求相违背，所采用的处理方法时间较长，对样品的影响较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效的植物组织样品的代谢组分析快速处理技术，以解决现有技术存在的弊端，克服了现有技术中由于样品前处理中污染、混样不均等因素造成的组学分析重复性低等缺陷。

实现本发明的所采用的技术方案如下：

一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于主要包括如下步骤：

1）取样、灭活：对植物各组织部位分开取样立即放入离心管中冷冻灭活，离心管事先竖直放置在乘有液氮的盛装容器中；所述离心管由离心管主体和离心管盖构成，离心管主体的中上部设有一个用于液氮进出的离心管孔，离心管盖上设有供液氮气化流出的盖孔；所述盛装容器中液氮的液面高度低于离心管主体的管口；

2）样品均质与研磨：将研磨棒置于液氮中预冷15 min后放入离心管中，盖上离心管盖，带手套握住离心管盖置于漩涡振荡器上高速震荡进行样品均质和研磨30s；

3）离心过滤：加入置于-20度冰箱中预冷1小时以上的提取溶剂，离心，去除蛋白质，取上清液过0.22 μm有机滤膜即可上机器分析。

所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于：在样品均质与研磨后还包括样品精细研磨：在低于0℃条件下迅速称取研磨好的样品粉末0.1g置于预冷的2 mL离心管中，加入1 mL置于-20度冰箱中预冷1小时以上的提取溶剂，用超声波辅助提取10 min或加入2粒直径5 mm的不锈钢钢珠于离心管中，用球磨仪进一步精细研磨。

所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于：所述离心管为50 ml，离心管孔的直径为1.5 mm ，盖孔直径2-3 mm。

所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法在木本植物新鲜组织代谢组分析的样品前处理上的应用。

所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法在茶树新鲜组织代谢组分析的样品前处理上的应用。

本发明通过对新鲜植物各组织部位分开取样，采用液氮迅速冷冻灭活，在液氮环境中采用高速震荡进行样品均质和研磨（部分样品可采用球磨仪和钢珠进一步精细研磨），在得到混合样品后采用超声波辅助提取，最后高速离心去除蛋白质，与现有相比具有如下有益效果：（1）适用于茶叶等坚硬的木本植物样品各组织部位（含叶片、新梢、嫩茎、根等部位）均质和研磨；（2）能够处理体积较大的茶树组织样品，适用样品质量范围为0.1 g至35g，不需分批次，保证均质效果，提高实验可重复性；（3）适合微量样品处理，减少样品在不同容器转移过程中的浪费；（4）严格低温环境，样品没有融化解冻，样品温度变化极小，保证样品最原始状态；（5）避免过多容器之间的转移造成的污染和转移的浪费。样品存储，均质研磨均在同一容器中进行（50 mL离心管），不用来回转移，减少污染；（6）所用样品容器为独立容器，比常规方法中使用研钵来回转移效率更高、处理样品时间更短；（7）采用两步研磨法（震荡粗磨加精细球磨）可以很好的处理根等样品，同时也提高了球磨取样的均一性；避免操作过程中液氮的直接接触，提高了操作的安全性。

综上，本发明克服了传统方法温度变化、容易被污染、样品浪费多、可重复性较差、混样不均、工作效率较低、操作危险系数高、对操作人员的熟练程度及工作经验要求高等众多不足之处和技术难点。该发明能够很好的运用于茶树等木本植物样品坚硬组织取样、均质、研磨、提取的前处理方法，是一种对茶树组织（含叶片、嫩茎、根）进行代谢组学分析测试的快速、无损、无污染的样品前处理技术，该方法处理样品还可用于品质成分分析、RNA提取、蛋白质组学分析等。

附图说明

图1为本发明中离心管的结构示意图；

图2为方法操作流程图；(a) 取样、灭活；(b) 研磨棒预冷；(c)加研磨棒和离心管盖；(d) 样品均质与震荡研磨；(e)研磨完成；

图3为专利方法和传统方法前处理样品代谢轮廓（负离子模式）；

图4为专利方法和传统方法前处理样品代谢物聚类及热图分析结果；

图5为专利方法和传统方法前处理样品代谢物主成分分析结果；

图中：1-离心管主体；2-离心管盖；3-管孔；4-盖孔；5研磨棒；6-盛装容器。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步具体说明。以下实施例中所述的50ml离心管由离心管主体1和离心管盖2构成，离心管主体1的管壁中部设有孔径为1.5 mm管孔3，用于液氮自动浸入和流出；管盖2上设有1-2个孔径为2-3 mm 盖孔4，用于残留液氮气化排出。研磨棒为5 cm × 2 cm陶瓷研磨棒；振荡器为100 W，300 r/min振荡器，设置为Full 模式；提取试剂为79%甲醇溶液。

实施例1茶树新梢及叶片样品前处理

以龙井43茶树两年生扦插苗为材料，对照组茶树样品采用15℃恒温培养，实验组样品采用25℃恒温培养。实验设6个生物学重复，独立取样检测。培养处理1周后取新梢叶片用于代谢组学分析。

专利方法为：叶片样品立即放入50 ml离心管于液氮中灭活（离心管事先竖直放置在乘有液氮的盛装容器6中，盛装容器6中液氮的液面高度低于离心管主体1的管口，下同）。每管样品约30 g（研磨后为离心管体积的1/3）,将5 cm研磨棒置于液氮中预冷15 min后放入离心管中，盖上离心管盖2。带手套小心握住离心管盖部置于漩涡振荡器上震荡研磨30s。加甲醇浸提，UPLC-Q-TOF MS代谢轮廓分析，多元统计并对茶叶主要化合物进行相对定量比较，结果见图3。

传统方法为：选取植物样品，用锡箔纸包好，放入液氮中灭活；将干燥的陶瓷研钵放置在盛满冰的泡沫盒中，用汤勺舀取液氮倒入研钵中；小心拆开包裹样品的锡箔纸，取适量样品放入研钵中；戴棉手套后一手轻轻扶住研钵，一手用研磨杵在液氮中轻捣植物组织样品（小心防治液氮溅出）；待液氮挥发近干时迅速沿研钵边缘研磨样品；再次用汤勺加入液氮入研钵并继续捣碎，反复数次，直至样品研磨粉碎；最后使用样品勺小心将研钵中样品粉末转移至离心管中保存。萃取操作同专利方法。

对照组和实验组样品经两种前处理方法后进行代谢轮廓分析结果，两种前处理方法的对照组和实验组代谢轮廓均有明显差异，而传统方法和专利方法的代谢轮廓分析结果有细微差异。说明本方法能够用于代谢轮廓分析。进一步提取各样品特征离子碎片，设置相同提取条件，比较所得各组离子峰数量，见表2,。可以发现，采用本专利方法前处理所得样品中的离子碎片峰（代表化合物数量）略多于传统方法，可见本方法能够有效的运用于代谢组学分析前处理。

进一步对以上提取的碎片离子峰进行聚类和热图分析（见图4），发现两种提取方法均能很好的区分实验组和对照组，但是两种前处理方法也表现微小的差异。

对以上提取的碎片离子峰进行主成分分析（见图5），发现两种提取方法均能很好的区分实验组和对照组，但是本专利采用的前处理方法得到更好的重复性，及TS（new）和CK（new）的变异更小，而传统方法虽然也能够将两组样品加与区分，但是样品点分布更加离散，表示组内差异更大（TS（old）和CK（old））。由此可见，专利方法比传统方法在前处理的一致性上有较大的优势，能够很好的保持样品的可重复性，提高实验准确度。

对于茶叶中主要的化合物，提取其中有代表性化合物进行相对定量分析，计算相对含量的变异系数（见表3），可以发现，本专利方法显著降低了相同处理样品中化合物的差异，及前处理过程中提高了样品的均一性，保证了实验的可重复性和准确性。该方法相比传统方法，具有更加稳定，更加准确的优势。

实施例2：用于茶树吸收根样品处理

1）以龙井43茶树两年生扦插苗为材料，取茶苗茶树吸收根为原料，立即放入50ml离心管于液氮中迅速冷冻灭活（离心管中注入液氮，编号放置于盛装2/3液氮的不锈钢保温饭盒中，离心管管壁中部钻1.5 mm小孔用于液氮自动浸入和流出），每管样品约30 g（研磨后为离心管体积的1/3）；

2）样品均质与研磨：将5 cm研磨棒置于液氮中预冷15 min后放入离心管中，盖上预开有小孔的离心管盖（用于防止残留液氮气化排出）。带手套小心握住离心管盖部置于漩涡振荡器上高速震荡进行样品均质和研磨30s；

3）样品提取及精细研磨：在2mL低温环境下迅速准确称取研磨好的样品粉末0.1g置于预冷的2mL离心管中，加入1mL预冷过的提取溶剂，（置于-20度冰箱预冷1小时），采用超声波辅助提取10min。该过程亦可加入2粒0.3mm的不锈钢钢珠与离心管中，采用球磨仪进一步精细研磨；

4）离心过滤：12000r/min高速离心去除蛋白质。取上清液过0.22um有机滤膜即可上级分析。

实施例3：用于茶树嫩茎样品处理

以龙井43茶树两年生扦插苗为材料，取茶苗一芽二三叶新梢为原料，取样时立即放入50 ml离心管于液氮中灭活（离心管中注入液氮，管壁中部钻1.5 mm小孔用于液氮自动浸入和流出），每管样品约30 g（研磨后为离心管体积的1/3）,将5 cm研磨棒置于液氮中预冷15 min后放入离心管中。盖上预开有小孔的离心管盖（用于防止残留液氮气化排出）。带手套小心握住离心管盖部置于漩涡振荡器上震荡研磨30s，放入液氮冷冻后重复震荡研磨一次，研磨后样品粉末一般具有较好的萃取效果，能够满足品质成分分析、RNA提取、代谢组学分析、蛋白质组学分析等，如枝条较老，具有较多的嫩茎，而对提取粉末具有较高的要求，可以采取球磨仪和钢珠进一步精细研磨。

实施例4：使用于干茶样品处理

如实施例1方法，以含水量为5%的一芽二叶龙井干茶为材料，取10 g茶样装与50mL离心管,将5 cm研磨棒置于离心管中。盖上离心管盖（用于防止残留液氮气化排出）。小心握住离心管盖部置于漩涡振荡器上震荡研磨30s。

Claims (5)

1.一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于主要包括如下步骤：

1）取样、灭活：对植物各组织部位分开取样立即放入离心管中冷冻灭活，离心管事先竖直放置在乘有液氮的盛装容器（6）中；所述离心管由离心管主体（1）和离心管盖（2）构成，离心管主体（1）的中上部设有一个用于液氮进出的离心管孔（3），离心管盖（2）上设有供液氮气化流出的盖孔（4）；所述盛装容器（6）中液氮的液面高度低于离心管主体（1）的管口；

2）样品均质与研磨：将研磨棒置于液氮中预冷15 min后放入离心管中，盖上离心管盖（2），带手套握住离心管盖（2）置于漩涡振荡器上高速震荡进行样品均质和研磨30s；

3） 离心过滤：加入置于-20度冰箱中预冷1小时以上的提取溶剂，离心，去除蛋白质，取上清液过0.22 μm有机滤膜即可上机器分析。

2.根据权利要求1所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于：在样品均质与研磨后还包括样品精细研磨：在低于0℃条件下迅速称取研磨好的样品粉末0.1g置于预冷的2 mL离心管中，加入1 mL置于-20度冰箱中预冷1小时以上的提取溶剂，用超声波辅助提取10 min或加入2粒直径5 mm的不锈钢钢珠于离心管中，用球磨仪进一步精细研磨。

3.根据权利要求1所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法，其特征在于：所述离心管为50 ml，离心管孔（3）的直径为1.5 mm ，盖孔（4）直径2-3 mm。

4.权利要求1-3中任意一项所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法在木本植物新鲜组织代谢组分析的样品前处理上的应用。

5.权利要求1-3中任意一项所述的一种用于植物代谢组分析的样品前处理方法在茶树新鲜组织代谢组分析的样品前处理上的应用。