CN103353490B - 一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法 - Google Patents
一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法，包括：取梨组织，粉碎后加入提取液进行提取，提取完成后向体系中加入萃取试剂，萃取获得内源激素的粗提物；采用固相萃取柱对所述粗提物进行分离纯化，得到检测样品；利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱对检测样品进行分析，得到梨组织中内源激素的种类和含量；其中，所述的提取液由异丙醇、水和盐酸组成，其中异丙醇、水和盐酸的体积比为1.5～2.5：1：0.001～0.002，所述的萃取试剂为二氯甲烷。本发明的方法具有灵敏度高、前处理方法简单、回收率高且准确度和精密度高等优点，适用于多类植物组织中内源激素的检测和确证。
Description
技术领域
本发明涉及波谱分析技术领域，尤其涉及一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法。
背景技术
植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，并自产生部位移动到作用部位，在极低浓度下就有明显的生理效应的微量物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素。
植物激素与细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面息息相关，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。这种调节的灵活性和多样性，可通过使用外源激素或人工合成植物生长调节剂的浓度与配比变化，进而改变内源激素水平与平衡来实现。植物内源激素对植物体生长发育过程的调节，并不是单一激素作用的结果，而是多种激素之间相互作用的结果。因此，开展生理水平的多种内源激素检测及相关的前处理技术的研究是探索植物激素生理作用的基础工作。
植物内源激素的测定方法很多，根据其原理主要分为三类：生物鉴定法、免疫学方法和物理化学法。其中，质谱检测技术是当前发展趋势，也是目前最为可靠的激素检测方法，同时可验证其他测定方法的可靠性，并鉴定未知物质的结构，目前最常用的结合系统有气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）。
植物内源激素对植物的各种生理活动起着重要的调节作用，因此，对其进行精确的定量检测成为学界关注的焦点之一。GC-MS以其分析快速、灵敏度高，能同时进行定性定量分析等优势，成为植物内源激素分析的常规方法之一，但复杂的样品提取、纯化和衍生过程在很大程度上制约了它的发展。
超高效液相色谱串联质谱在速度、灵敏度及分离度较GC-MS有很大的进步，在食品、中药等领域应用广泛，但是在植物内源激素的分析上鲜有报道，尽管超高效液相色谱串联质谱对基质复杂的痕量组分具有更高的分析通量，但仍需建立在可靠的分析样品基础之上，植物内源激素热不稳定，且植物体成分复杂，如何快速、有效的获得分析样品，建立理想的分析条件，以可靠的对植物内源激素进行定性、定量检测仍是个难题。
发明内容
本发明提供了一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法，前处理方法简单，可以简单、快速、准确的同时测定样品的多种内源激素，回收率高、重现性好，能够满足痕量的分析要求。
一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法，包括：
（1）取梨组织，粉碎后加入提取液进行提取，提取完成后向体系中加入萃取试剂，萃取获得内源激素的粗提物；
（2）采用固相萃取柱对所述粗提物进行分离纯化，得到检测样品；
（3）利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱对检测样品进行分析，得到梨组织中内源激素的种类和含量；
其中，所述的提取液由异丙醇、水和盐酸组成，其中异丙醇、水和盐酸的体积比为1.5～2.5：1：0.001～0.002，所述的萃取试剂为二氯甲烷。
样品的前处理是内源激素分析过程中的关键环节，目前，内源激素的提取、分离大都沿用80%甲醇水溶液从植物组织中提取，存在试剂用量大，净化不完全，步骤繁琐等问题，且不同类别样品和不同类别激素需要不同的纯化过程，无法多组分的同时提取和测定。采用本发明的提取液和萃取试剂，可以有效的提取组织中的内源激素，通过方法验证，回收率较高，基质对激素的测定影响较小，取得了较好的效果。优选的，提取液中，异丙醇、水和盐酸的体积比为2：1：0.002。
所述的盐酸为市售的浓盐酸，质量分数通常为37.5%，由于已经给出盐酸的质量分数，为方便配置，该提取液配方中所述的水并不包含盐酸中的水。
提取液的使用量影响内源激素的提取效果，优选的，所述的梨组织与提取液的重量体积比（g/ml）为1：8～12，更优选为1：10。
提取时，可采用超声提取与振荡提取相结合的方式，可先超声提取3～5min，再振荡提取30～40min。超声波产生的振动作用加强了激素的释放、扩散和溶解，提高提取效率，但是超声时间不宜过长，时间过长容易破坏激素的结构，并增加体系内的杂质含量，干扰后续试验。更优选的，超声提取的时间为5min，振荡提取的时间为30min。
二氯甲烷萃取时，取下层澄清液，干燥后即为所述的粗提物。萃取也可采用超声萃取与振荡萃取相结合的方式，通常先超声萃取3～5min，再振荡萃取30～40min，更优选的，超声萃取的时间为5min，振荡萃取的时间为30min。
所述的固相萃取柱为C18固相萃取小柱。
为尽量避免杂质和离子的影响，实验中所用的水通常选用超纯水。
在进行超高效液相色谱串联质谱分析时，样品采用甲醇溶解后进样。
超高效液相色谱的流动相为乙腈、0.02%冰乙酸的水溶液按体积比60：35～45配置而成。试验表明，采用该流动相，峰面积信号强且灵敏度高。进一步优选的，所述的流动相中，乙腈、0.02%冰乙酸的水溶液的体积比为60：40。
步骤（3）中，所述内源激素为反玉米素核苷（t-ZR）、细胞分裂素（GA4）、吲哚乙酸（IAA）或脱落酸（ABA）。
优选的，质谱条件如下表所示：
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）样品前处理是激素分析过程中的关键环节，直接影响后续超高效液相色谱电喷雾串联质谱的分析结果，本发明优化了梨内源激素的提取方法，可快速、高效提取样品中的多种内源激素，方法简单可靠，提取得到的样品能够满足分析要求。
（2）本发明方法设计合理，通过标准品的调谐实验，得到了最优化的内源激素测定参数，如分离流动相、质谱条件等，建立了植物组织内源激素多组分同时提取、同时检测的超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱（UPLC-ESI-MS/MS）测定方法，较高效液相色谱质谱测定更为准确、灵敏，具有回收率高，重复性好，灵敏度高等优点，保证了定性和定量结果的可靠性。
附图说明
图1a为内源激素标准品（100μg/L）在流动相为乙腈和0.02%冰乙酸的水溶液条件下的MRM谱图；
图1b为内源激素标准品（100μg/L）在流动相为乙腈和0.2%冰乙酸的水溶液条件下的MRM谱图；
图1c为内源激素标准品（100μg/L）在流动相为乙腈和0.6%冰乙酸的水溶液条件下的MRM谱图；
图2a为内源激素IAA检测定性离子MS/MS图；
图2b为内源激素ABA检测定性离子MS/MS图；
图2c为内源激素GA4检测定性离子MS/MS图；
图2d为内源激素t-ZR检测定性离子MS/MS图；
图3为内源激素标准品（50μg/L）MRM谱图；
图4为样品内源激素MRM谱图；
图5为授粉后10天（2012年3月10日）梨花托部位内源激素含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。
实施例1
一、试验仪器与试剂
氮气吹干仪（天津市恒奥科技有限公司）
Milli Q超纯水器（美国Millipore公司）
真空离心浓缩仪（Concentrator plus，德国Eppendorf公司）
超高效液相色谱质谱联用仪（ACQUITYsystem followed bytandem Waters Quattro Premier XE Mass Spectrometry detection，美国Waters公司）
液相色谱柱ACQUITY BEH C181.7um（2.1×100mm，Waters）
C18固相萃取小柱（6mL，waters）
IAA标准品（美国Sigma公司）；ABA标准品（美国sigma公司）；t-ZR标准品（美国sigma公司）；GA4标准品（美国sigma公司）
二、样品前处理和标准溶液的配置
（1）将植物组织置于预冷的研钵中、利用液氮冷冻研磨；
（2）称取0.3g研磨好的植物材料于装有3mL提取液I（由异丙醇：超纯水：浓盐酸=2：1：0.002体积比配制成的提取液）的10mL离心管中，涡旋1min，超声提取5min，避光4℃振荡提取30min；
（3）加入5mL提取液II（二氯甲烷），涡旋1min，超声萃取5min，避光4℃振荡萃取30min；
（4）4℃冷冻离心5～8min后，取下层澄清液5mL，利用氮吹仪吹干，并用1.0mL甲醇溶解；
（5）步骤（4）获得的溶液过C18固相萃取小柱纯化，利用氮吹仪吹干，用200μL甲醇溶解，得到样品溶液；
（6）样品溶液过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，滤液供（UP）LC-MS/MS上机测定。
三、标准品的配置
称取0.01g标准品溶于甲醇中，并定容至50mL，配成200μg/mL的标准溶液，用甲醇稀释配成25μg/mL的混合标准溶液。取稀释配成25μg/mL的混合标准溶液，加入甲醇稀释到0.32μg/L、1.6μg/L、8μg/L、40μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、1000μg/L系列浓度的混合标准溶液，备用。
四、植物内源激素测定条件的优化
通过标准品调谐试验，对植物内源激素的测定条件进行优化。
（1）色谱条件的优化
美国Waters ACQUITYsystem色谱柱：Waters ACQUITY UPLCBEH C18柱，2.1mm×100mm，粒径1.7μm；
柱温：40℃；
样品温度：25℃；
进样体积：5μL；
流速：0.15mL/min；
洗脱程序：0～5min，40%B。
分别选择甲醇和乙腈作为强洗脱流动相。实验证明：当甲醇作流动相时，液相分离效果不好，质谱离子化受到不同程度的抑制，丰度明显降低，从而导致灵敏度下降，而乙腈的离子化效率明显优于甲醇，故本实验采用乙腈作为强洗脱流动相。
在流动相中加入乙酸能增加各种化合物在ESI-模式下的离子化效率。试验分别配制0.02%、0.2%、0.6%的乙酸水溶液作为流动相，经试验表明0.02%乙酸水溶液体系能提供最佳离子化条件，峰面积信号最强，灵敏度最高（图1a～图1c所示）。最终得到最佳的流动相为：乙腈（A）与0.02%乙酸-水溶液（B）的混合溶液，A：B(v/v)=60：40。
（2）质谱条件的优化
离子源：电喷雾ESI，正离子/负离子；
扫描方式：多反应监测MRM；
喷雾电压：（+）3500V、（－）2800V；
去溶剂气体流速：800L/h；
样品锥气体流速：80L/h；
离子源温度：120℃；
毛细管温度：350℃。
表1内源激素的质谱分析条件
在电喷雾质谱、负离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行了充分的优化，选取经碰撞后所得丰度较高的子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的电压值。标准品的裂解质谱图（图2a～图2d），最终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数（表1）。
利用优化后的色谱质谱条件，UPLC-MS/MS进样分析得到混合标准品（50μg/L）的MRM色谱图如图3所示。
五、方法学验证
标准曲线和定量限
利用上述优化后的色谱质谱条件，取不同质量浓度的混合标准品溶液进行UPLC-MS/MS测定，以峰面积（y）对相应的质量浓度（x）作图，获得它们的标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数，结果见表2。
表2内源激素标准样品的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
结果表明：4种植物激素在0～200μg/L的质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均在0.99以上。按3倍信噪比计算得到样品中的检出限和以5倍信噪比计算得到的定量限，结果见表2。
精密度和回收率的测定
在阴性的白菜样品中分别添加20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg质量分数水平的4种植物激素标准溶液，样品预处理方法如上，平行操作5次，进行分析，结果见表3；4种植物激素的RSD范围为4.25%～15.96%。回收率见表3，四种植物激素的回收率都在70%以上。
表3内源激素的相对标准偏差（n=5）和回收率
基质效应
基质效应在内源激素测定分析中非常普遍，内源激素和样品本身的性质都是影响基质效应的因素，因此，本实验对分别用甲醇和已知激素浓度的样品溶液稀释了一系列的标准溶液，进行液相色谱-串联质谱对比检测。结果表明：基质标样的峰面积与甲醇溶解的标样的峰面积变化不大，说明内源激素物质并不具有明显的基质效应。因而，在实际样品测试中，采用甲醇溶液配制标样即可。
实施例2方法的应用
应用实施例1优化后的参数方法对授粉后10天（2012年3月10日），梨花托部位取样，进行内源激素的测定，最终样品的MRM色谱图如图4所示，四种激素的含量测定结果见图5。可以看出，本方法通过样品的预处理及UPLC-MS/MS测定条件的选择，在植物组织中实现了不同种类激素的同时测定，方法的定量限、回收率和精密度均满足痕量的分析要求，方法简便，分析效率高。
Claims (1)
1.一种利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱检测梨内源激素的方法，包括：
(1)取梨组织，粉碎后加入提取液进行提取，提取完成后向体系中加入萃取试剂，萃取获得内源激素的粗提物，所述的梨组织与提取液的重量体积比为1：8～12；
(2)采用C18固相萃取柱对所述粗提物进行分离纯化，得到检测样品；
(3)利用超高效液相色谱电喷雾串联质谱对检测样品进行分析，得到梨组织中内源激素的种类和含量；
其中，所述的提取液由异丙醇、水和盐酸组成，其中异丙醇、水和盐酸的体积比为2：1：0.002，所述的萃取试剂为二氯甲烷；
提取时，先超声提取3～5min，再振荡提取30～40min；
超高效液相色谱的流动相为乙腈、0.02％冰乙酸的水溶液按体积比60：40配置而成；
质谱条件如下表所示：
所述的内源激素为反玉米素核苷、细胞分裂素、吲哚乙酸和脱落酸。
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