CN111272939A - 一种测定水果中青霉酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种测定水果中青霉酸含量的方法。本发明公开了一种测定水果中青霉酸含量的方法,包括步骤:(1)向水果果肉中加入乙酸乙酯和氯化钠,振荡,离心,旋蒸至近干,再用洗耳球吹干,定容,得到定容液;(2)取所述定容液置于装有净化剂的离心管中,涡旋,离心,过滤,得到样品溶液;(3)将所述样品溶液用超高效液相色谱质谱联用方法检测,最终得到水果中青霉酸含量。本发明的方法克服了高效液相色谱法前处理繁琐、检测时间较长的缺点,通过使用超高效液相色谱质谱联用方法,能够高效、准确、灵敏地得到水果中青霉酸的检测结果,操作简单、安全。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种测定水果中青霉酸含量的方法。
背景技术
青霉酸(penicillic acid)分子式为C8H10O4,相对分子量为170.16,是一种无色针状结晶化合物,熔点83℃,极易溶于热水、乙醇、乙醚和氯仿,不溶于戊烷、己烷。青霉酸主要是由圆弧青霉菌产生的多聚乙酰类霉菌毒素,是常见的霉菌毒素之一,能抑制动物DNA合成,并能与其他霉菌毒素产生联合毒性。水果在运输贮藏过程中容易受青霉菌的污染而腐烂变坏,因此建立一种新的青霉酸的痕量分析方法,可以快速、准确地测定水果中青霉酸的含量,为水果中青霉酸的污染水平和水果中青霉酸的最大残留限量的设定提供支持。
目前,国内外青霉酸的检测主要使用的方法有薄层层析法、柱前衍生-气相色谱法、柱前衍生-高效液相色谱法。薄层层析法难以应用于食品中痕量青霉酸的检测。青霉酸极性较大,沸点较高,无法直接进气相色谱分析,需要进行硅烷化衍生,操作非常繁琐。青霉酸的紫外吸收较弱,应用高效液相色谱法检测青霉酸可先进行柱前衍生反应,提高检测灵敏度,但样品前处理繁琐,若应用高效液相色谱直接进行检测,检测时间长,灵敏度不高。
发明内容
针对本领域研究方面之不足,本发明的目的提供一种测定水果中青霉酸的方法,为水果中青霉酸含量的测定提供更高效、准确、灵敏的分析方法。
实现本发明目的的具体技术方案为:
一种测定水果中青霉酸含量的方法,其包括步骤:
(1)向水果果肉中加入乙酸乙酯和氯化钠,放置在摇床上振荡30min,离心5min,取离心后的上清液于旋转蒸发仪中旋蒸至近干,再用洗耳球吹干,之后用色谱纯乙腈定容,得到定容液;
其中,所述水果果肉与乙酸乙酯的固液比为1:1;所述氯化钠与水果果肉的质量比为3:10;所述色谱纯乙腈与所述离心后的上清液的体积比为1:5;
(2)取所述定容液置于装有净化剂的离心管中,涡旋30s,离心1min,取上清液过0.22μm有机系滤膜于进样小瓶中,得到样品溶液;
其中,所述净化剂与定容液的固液比为0.08:1;
(3)将所述样品溶液用超高效液相色谱质谱联用方法检测,与标准曲线比较,最终得到水果中青霉酸含量。
优选地,所述水果为桃子、苹果、柑橘、猕猴桃、葡萄中的一种。
优选地,所述步骤(1)中称取水果果肉为10g(+0.02g),乙酸乙酯的加入量为10mL,氯化钠的加入量为3g。
优选地,所述步骤(1)中上清液体积为7.5mL,色谱纯乙腈体积为1.5mL;用乙酸乙酯提取后的上清液没有固体杂质,可以直接旋蒸。
优选地,所述步骤(1)中,所用仪器的条件为:
摇床条件:时间30min,温度25℃,转速200rpm;
离心机条件:时间5min,温度0℃,转速3800rpm;
旋转蒸发仪条件:转速20~280rpm,水浴温度为室温。
优选地,所述步骤(2)中净化剂为多壁碳纳米管和十八烷基硅烷键合硅胶按照质量比为3:5混合。
更优选地,所述步骤(2)中多壁碳纳米管的质量为30(+0.2)mg;十八烷基硅烷键合硅胶的质量为50(+0.2)mg;定容液的体积为1mL。
优选地,所述步骤(3)中,超高效液相色谱质谱联用方法中的色谱柱为Omega1.6μm PS C18,柱温25℃,柱流速0.2mL/min,进样量3.0μL;流动相为乙腈和5mM乙酸铵水溶液的混合液,其中,乙腈:5mM乙酸铵水溶液的体积比为8:2;
质谱条件:电喷雾电离源(ESI),三重四极杆质谱(QQQ)质量分析器,负离子(ESI-)模式扫描,多反应选择检测(MRM);锥孔电压为20V,碰撞能为18V、14V、10V。
优选地,所述质谱条件中,选择的特征性离子中,母离子为:m/z 169.03,子离子为:m/z92.525、92.779、109.836。
优选地,所述步骤(3)中的标准曲线是以青霉酸标准溶液为样品,用超高效液相色谱质谱联用方法测峰面积,绘制的标准曲线。
本发明的有益效果在于:
本发明建立了改进QuEChERs结合高效液相色谱三重四级杆串联质谱联用方法检测水果中的痕量青霉酸。本发明的方法克服了高效液相色谱法前处理繁琐、检测时间较长的缺点,通过使用超高效液相色谱质谱联用方法,能够高效、准确、灵敏地得到水果中青霉酸的检测结果,操作简单、安全。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明,但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制,对于本领域的普通技术人员,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是青霉酸桃子的基质标准曲线;
图2是青霉酸苹果的基质标准曲线;
图3是青霉酸柑橘的基质标准曲线;
图4是青霉酸猕猴桃的基质标准曲线;
图5是青霉酸葡萄粒的基质标准曲线。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1:
准确称取去核的桃子匀浆后的果肉10.0g于50mL塑料离心管中,加入10mL乙酸乙酯和3g氯化钠,放置在摇床上,以200rpm的转速在25℃下振荡提取30min,3800rpm离心5min,取7.5mL上清液于一干净的圆底烧瓶中,放置在旋转蒸发仪中,水浴温度为室温的条件下,旋蒸至近干,用洗耳球吹干,用1.5mL色谱纯乙腈定容。
取1mL定容液于装有净化剂(30mg多壁碳纳米管+50mg C18)的2mL离心管中,放在涡旋仪上涡旋30s,吸附色素等杂质,10000rpm离心1min,取上清液过0.22μm的有机系滤膜,待高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测分析。
实施例2
准确称取去核的苹果匀浆后的果肉10.0g于50mL塑料离心管中,加入10mL乙酸乙酯和3g氯化钠,放置在摇床上,以200rpm的转速在25℃下振荡提取30min,3800rpm离心5min,取7.5mL上清液于一干净的圆底烧瓶中,放置在旋转蒸发仪中,水浴温度为室温的条件下,旋蒸至近干,用洗耳球吹干,用1.5mL色谱纯乙腈定容。
取1mL定容液于装有净化剂(30mg多壁碳纳米管+50mg C18)的2mL离心管中,放在涡旋仪上涡旋30s,吸附色素等杂质,10000rpm离心1min,取上清液过0.22μm的有机系滤膜,待高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测分析。
实施例3
准确称取柑橘果肉匀浆后的果肉10.0g于50mL塑料离心管中,加入10mL乙酸乙酯和3g氯化钠,放置在摇床上,以200rpm的转速在25℃下振荡提取30min,3800rpm离心5min,取7.5mL上清液于一干净的圆底烧瓶中,放置在旋转蒸发仪中,水浴温度为室温的条件下,旋蒸至近干,用洗耳球吹干,用1.5mL色谱纯乙腈定容。
取1mL定容液于装有净化剂(30mg多壁碳纳米管+50mg C18)的2mL离心管中,放在涡旋仪上涡旋30s,吸附色素等杂质,10000rpm离心1min,取上清液过0.22μm的有机系滤膜,待高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测分析。
实施例4
准确称取整个猕猴桃匀浆后的果肉10.0g于50mL塑料离心管中,加入10mL乙酸乙酯和3g氯化钠,放置在摇床上,以200rpm的转速在25℃下振荡提取30min,3800rpm离心5min,取7.5mL上清液于一干净的圆底烧瓶中,放置在旋转蒸发仪中,水浴温度为室温的条件下,旋蒸至近干,用洗耳球吹干,用1.5mL色谱纯乙腈定容。
取1mL定容液于装有净化剂(30mg多壁碳纳米管+50mg C18)的2mL离心管中,放在涡旋仪上涡旋30s,吸附色素等杂质,10000rpm离心1min,取上清液过0.22μm的有机系滤膜,待高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测分析。
实施例5
准确称取整个葡萄粒匀浆后的果肉10.0g于50mL塑料离心管中,加入10mL乙酸乙酯和3g氯化钠,放置在摇床上,以200rpm的转速在25℃下振荡提取30min,3800rpm离心5min,取7.5mL上清液于一干净的圆底烧瓶中,放置在旋转蒸发仪中,水浴温度为室温的条件下,旋蒸至近干,用洗耳球吹干,用1.5mL色谱纯乙腈定容。
取1mL定容液于装有净化剂(30mg多壁碳纳米管+50mg C18)的2mL离心管中,放在涡旋仪上涡旋30s,吸附色素等杂质,10000rpm离心1min,取上清液过0.22μm的有机系滤膜,待高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测分析。
实施例6
实施例1~5中所述的高效液相色谱三重四级杆串联质谱分析:
仪器条件
质谱条件:电喷雾电离源(ESI),三重四极杆质谱(QQQ)质量分析器,负离子(ESI-)模式扫描,多反应选择检测(MRM);锥孔电压为20V,碰撞能为18V、14V、10V。选择的母离子为m/z:169.03,子离子为m/z:92.525、92.779、109.836。
(1)标准曲线:在空白水果的提取液中加入一定量的青霉酸标准溶液,得到相对应的青霉酸的浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L的水果基质标准溶液,经UPLC-MS/MS测定,以水果基质标准溶液浓度对应青霉酸(出峰时间0.67min)峰面积作标准曲线,以峰面积的比值为纵坐标y,样品浓度为横坐标x。青霉酸在0.01-0.5mg/L范围内的线性回归方程如图1所示,相关系数R2为0.992~0.999线性关系良好;
(2)添加回收在空白水果基质中添加青霉酸标准溶液,添加浓度为0.005、0.01、0.05mg/kg(每个处理5个重复),按上述方法进行测定,所得回收率在80%~120%范围内,相对标准偏差RSDs除苹果的为2.8~12.2%,其余水果的相对标准偏差RSDs均小于10.0%,大部分小于5%(表1)。因此,本发明能够准确灵敏地测定水果基质中青霉酸的含量,可操作性强,从事相关技术的工作人员,可以使用本发明方法进行检测。
表1空白水果基质中青霉酸的添加回收率
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,包括步骤:
(1)向水果果肉中加入乙酸乙酯和氯化钠,放置在摇床上振荡30min,离心5min,取离心后的上清液于旋转蒸发仪中旋蒸至近干,再用洗耳球吹干,之后用色谱纯乙腈定容,得到定容液;
其中,所述水果果肉与乙酸乙酯的固液比为1:1;所述氯化钠与水果果肉的质量比为3:10;所述色谱纯乙腈与所述离心后的上清液的体积比为1:5;
(2)取所述定容液置于装有净化剂的离心管中,涡旋30s,离心1min,取上清液过0.22μm有机系滤膜于进样小瓶中,得到样品溶液;
其中,所述净化剂与定容液的固液比为0.08:1;
(3)将所述样品溶液用超高效液相色谱质谱联用方法检测,最终得到水果中青霉酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述步骤(1)中称取水果果肉为10±0.02g,乙酸乙酯的加入量为10mL,氯化钠的加入量为3g。
3.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述步骤(1)中上清液体积为7.5mL,色谱纯乙腈体积为1.5mL。
4.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所用仪器的条件为:
摇床条件:时间30min,温度25℃,转速200rpm;
离心机条件:时间5min,温度0℃,转速3800rpm;
旋转蒸发仪条件:转速20~280rpm,水浴温度为室温。
5.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)中净化剂为多壁碳纳米管和十八烷基硅烷键合硅胶按照质量比为3:5混合。
6.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)中多壁碳纳米管的质量为30±0.2mg;十八烷基硅烷键合硅胶的质量为50±0.2mg;定容液的体积为1mL。
9.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述质谱条件中,选择的特征性离子中,母离子为:m/z 169.03,子离子为:m/z 92.525、92.779、109.836。
10.根据权利要求1所述的一种测定水果中青霉酸含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)中的标准曲线是以青霉酸标准溶液为样品,用超高效液相色谱质谱联用方法测峰面积,绘制的标准曲线。
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GR01 | Patent grant | ||
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