CN115015443B - 一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法 - Google Patents
一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法。本发明将茶叶和/或咖啡样品粉碎后，通过碱性溶液提取，乙腈/乙酸乙酯混合溶液进行液液萃取，采用QuEChERS方法净化，ChromCore Biphenyl色谱柱分离后进行LC‑MS/MS分析，实现了茶叶及咖啡样品中丙烯酰胺、1‑甲基咪唑、2‑甲基咪唑和4‑甲基咪唑的同时快速检测。茶叶和咖啡的制作均包含热加工过程，容易产生丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物，且茶叶和咖啡基质比较复杂，测试时干扰物质多，因此，本发明建立茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物的同时检测方法，具有重大的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法。
背景技术
食品的热加工过程中，发生的主要化学变化美拉德反应产生的一系列特有的风味物质构成了相关食品特有风味的基础，但是伴随着食品热加工过程中成香成色反应的进行，会产生一些伴生危害物，如丙烯酰胺、甲基咪唑类化合物等，是当前食品安全领域的研究热点。其中，丙烯酸胺属于2A级致癌物，目前已经证实对动物有生殖毒性、致癌性和神经毒性等。甲基咪唑类副产物主要包括4-甲基咪唑(4-MEI)、2-甲基咪唑(2-MEI)和1-甲基咪唑(1-MEI)，是一类极易溶于水的化合物，其中，4-MEI和2-MEI具有致癌性，属于2B级致癌物。由于食品种类多样，基质复杂，目前已报道的研究大多无法实现丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测，因此若需要测定样品中丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物的含量需分别进行样品前处理后再分别测定。
茶叶、咖啡和可可为世界三大无酒精饮料，其中在我国饮用较多的为茶叶和咖啡两种饮料，其制作均包含热加工过程，且其样品基质复杂，对于其中丙烯酰胺、甲基咪唑类化合物的检测均较为复杂，前处理过程耗时耗力。目前的检测方法，均无法实现茶叶和咖啡中丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的同时检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法。采用本发明的方法对茶叶和/或咖啡进行处理，能够实现样品中丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的同时检测，避免了目前实验中将丙烯酰胺与甲基咪唑类化合物分开检测的繁琐实验步骤，提高了检测效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法，包括以下步骤：
将茶叶和/或咖啡样品粉碎，得到样品粉末；
将所述样品粉末依次进行提取、萃取、净化和浓缩，得到供试品溶液；
将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据预定的标准曲线和得到的供试品的质谱图，分别得到所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量；所述甲基咪唑类化合物包括1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为联苯基色谱柱；流动相A为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1～0.3％，流动相B为甲醇，梯度洗脱；柱温为25～35℃，进样量为1～10μL，流速为0.2～0.6mL/min；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；离子源温度：150℃；毛细管电压：2.5kV；脱溶剂温度：500℃；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；雾化气、气帘气和辅助加热气均为氮气；碰撞气：氩气。
优选的，所述提取的提取液包括碱性溶液。
优选的，所述碱性溶液包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液，所述碱性溶液的浓度为0.01～0.1mol/L。
优选的，所述提取液的体积与样品粉末的质量的比值为3～10mL：0.4～0.6g。
优选的，所述萃取的萃取剂包括乙腈和乙酸乙酯的混合溶液。
优选的，所述乙腈和乙酸乙酯的混合溶液中乙腈和乙酸乙酯的体积比为1：1～9。
优选的，所述萃取使用的萃取剂与提取使用的提取液的体积比为5～25：3～10。
优选的，所述萃取的过程还包括加入无水硫酸镁和氯化钠。
优选的，所述净化使用的净化材料包括：N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、无水硫酸镁和C18吸附剂，所述N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、无水硫酸镁、C18吸附剂与样品粉末的质量比为0.05～0.3：0.3～1.5：0.05～0.3：0.4～0.6。
优选的，所述联苯基色谱柱包括ChromCoreBiphenyl，规格为3μm，3.0×150mm。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物的同时检测方法，包括以下步骤：将茶叶和/或咖啡粉碎，得到样品粉末；将样品粉末依次进行提取、萃取、净化和浓缩，得到供试品溶液；将供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据标准曲线，得到丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量。本发明的前处理方法，可以同时提取和净化茶叶和/或咖啡中的丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物；本发明的待测物丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的水溶性好，现有技术很难实现丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物的同时检测，本发明采用联苯基色谱柱实现了丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的有效分离，尤其是ChromCoreBiphenyl色谱柱，对丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的分离效果更好；本发明的检测方法实现了茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的同时分离检测，避免了以往丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物分开检测的繁琐步骤，提高了检测效率，且同时检测可以节省试剂，更加绿色环保。而且，本发明的检测方法准确度好，精密度高。
进一步地，本发明采用碱性溶液提取，可以使目标化合物(丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑)以分子形式存在，提取效率高，另外在碱性条件下，提取液中的酸性物质如酚类、酸类留在水溶液中，不被萃取，起到除杂的效果，而且碱性溶液可以提高后续的萃取效率。
进一步地，本发明以乙腈和乙酸乙酯的混合溶液为萃取剂，采用液液萃取方式将样品提取液中的目标化合物丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物萃取到有机溶剂中，萃取效率高。
进一步地，本发明使用的净化材料包括：N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、无水硫酸镁、C18吸附剂，采用QuEChERS方法将萃取液进行净化，选择的净化材料能够有效去除色素及样品基质中弱极性化合物的干扰，降低茶叶及咖啡的基质效应，更进一步提高了检测结果的准确可靠性。
茶叶和咖啡的制作均包含热加工过程，容易产生丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物，且茶叶和咖啡基质比较复杂，测试时干扰物质多，因此，本发明建立茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物的同时检测方法，具有重大的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物浓度均为5.0ng/mL，丙烯酰胺-13C3的的浓度为300ng/mL，1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6和4-甲基咪唑-D6的浓度均为50ng/mL的标准工作溶液的TIC图(丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑及其内标化合物丙烯酰胺-13C3、1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6和4-甲基咪唑-D6)；
图2为4号咖啡阳性样品的TIC图；
图3为3号茶叶阳性样品的TIC图。
具体实施方式
本发明提供了一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法，包括以下步骤：
将茶叶和/或咖啡样品粉碎，得到样品粉末；
将所述样品粉末依次进行提取、萃取、净化和浓缩，得到供试品溶液；
将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据预定的标准曲线和得到的供试品的质谱图，分别得到所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量；所述甲基咪唑类化合物包括1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为联苯基色谱柱；流动相A为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1～0.3％，流动相B为甲醇，梯度洗脱；柱温为25～35℃，进样量为1～10μL，流速为0.2～0.6mL/min；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；离子源温度：150℃；毛细管电压：2.5kV；脱溶剂温度：500℃；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；雾化气、气帘气和辅助加热气均为氮气；碰撞气：氩气。
在本发明中，若无特殊说明，使用的试剂、耗材、仪器和设备均为本领域市售商品。
本发明将茶叶和/或咖啡样品粉碎，得到样品粉末。本发明对所述粉碎的方式没有特殊的要求，采用本领域技术人员常用的方式即可。本发明优选将茶叶和/或咖啡样品粉碎后过60目筛，取筛下部分即为所述样品粉末。
得到样品粉末后，本发明将所述样品粉末依次进行提取、萃取、净化和浓缩，得到供试品溶液。
在本发明中，所述提取前优选还包括加入所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同位素内标，所述同位素内标优选包括13C3-丙烯酰胺、D6-1-甲基咪唑、D6-2-甲基咪唑和D6-4-甲基咪唑。
在本发明中，所述提取的提取液优选包括碱性溶液，所述碱性溶液优选包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液，所述碱性溶液的浓度优选为0.01～0.1mol/L，更优选为0.08～0.1mol/L，最优选为0.1mol/L。
在本发明中，所述提取液的体积与样品粉末的质量的比值优选为3～10mL：0.4～0.6g，更优选为5～8mL：0.4～0.6g，最优选为5mL：0.5g。
在本发明中，所述提取优选包括超声提取，所述超声提取的温度优选为室温；所述超声提取的功率优选为200～500W，更优选为300～400W；所述超声提取的时间优选为5～15min，更优选为10min。在本发明的具体实施例中，所述超声提取在超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)中进行。
本发明将所述样品粉末进行提取后，得到样品提取液。
本发明优选将所述样品提取液与萃取剂混合进行所述萃取，得到样品待净化液，所述萃取优选为液液萃取。
在本发明中，所述萃取的萃取剂优选包括乙腈和乙酸乙酯的混合溶液，所述乙腈和乙酸乙酯的混合溶液中乙腈和乙酸乙酯的体积比优选为1：1～9，更优选为乙腈：乙酸乙酯＝1：3～7，最优选为1：4。
在本发明中，所述萃取使用的萃取剂与提取使用的提取液的体积比优选为5～25：3～10，更优选为15：5。
在本发明中，所述萃取的过程优选还包括加入无水硫酸镁和氯化钠。本发明优选在样品提取液中加入萃取剂的同时，加入无水硫酸镁和氯化钠，所述样品提取液的体积与无水硫酸镁、氯化钠的质量的比值优选为1mL：1～3.5g：0.1～1g，更优选为1mL：1.4g：0.2g。所述无水硫酸镁、氯化钠与样品粉末的质量比优选为3～10：0.5～2：0.4～0.6，更优选为7：1：0.5。本发明在液液萃取过程中，加入无水硫酸镁和氯化钠，可以提高目标化合物的萃取效率。
本发明优选在样品提取液中加入萃取剂、无水硫酸镁和氯化钠后，涡旋振荡进行所述萃取，所述涡旋振荡的时间优选为10min。本发明优选将涡旋振荡后的溶液进行离心，得到所述样品待净化液，所述离心的转速优选为8000rpm，时间优选为5min。
本发明采用液液萃取方式，将所述样品提取液中的目标待测物丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物萃取到萃取剂中。
得到样品待净化液后，本发明优选进行净化得到样品净化液，所述净化优选为QuEChERS方法。
在本发明中，所述净化使用的净化材料包括：N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、无水硫酸镁和C18吸附剂，所述N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、无水硫酸镁、C18吸附剂与样品粉末的质量比优选为0.05～0.3：0.3～1.5：0.05～0.3：0.4～0.6，更优选为0.15：0.9g：0.15：0.5。在本发明中，所述N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂的粒径优选为40～60μm。
得到净化液后，本发明优选还包括在所述样品净化液中加入水，所述水的加入量和样品净化液的体积比优选为0.1～0.5：10，更优选为0.1：10。在本发明中，在样品净化液中加入水，能够防止后续净化液浓缩过程中被吹干而损失待测物。
得到样品净化液后，本发明优选将所述样品净化液浓缩后，溶解于水中，过滤，得到供试品溶液。
在本发明中，所述浓缩的方式优选为氮气吹干；所述氮气吹干的温度优选为室温。本发明对所述氮气吹干的设备没有具体的要求，在本发明的具体实施例中，使用氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)。
在本发明中，净化液被浓缩后，用水溶解并过滤，所述过滤的滤膜的孔径优选为0.22μm。
得到供试品溶液后，本发明将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据预定的标准曲线和得到的供试品的质谱图，分别得到所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量；所述甲基咪唑类化合物包括1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑。
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为联苯基色谱柱；流动相A为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1～0.3％，流动相B为甲醇，梯度洗脱；柱温为25～35℃，进样量为1～10μL，流速为0.2～0.6mL/min；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；离子源温度：150℃；毛细管电压：2.5kV；脱溶剂温度：500℃；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；雾化气、气帘气和辅助加热气均为氮气；碰撞气：氩气。
在本发明中，所述联苯基色谱柱优选包括ChromCoreBiphenyl，规格为3μm，3.0×150mm；柱温优选为35℃，进样量优选为5μL，所述流动相A优选为体积分数0.3％的甲酸水溶液，所述流动相的流速优选为0.2～0.4mL/min，更优选为0.25mL/min，所述梯度洗脱程序优选如表1所示。
表1液相色谱梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A/体积％ | 流动相B体积/％ |
| 0.00 | 100 | 0 |
| 6.00 | 100 | 0 |
| 6.50 | 10 | 90 |
| 7.50 | 10 | 90 |
| 8.00 | 100 | 0 |
| 10.00 | 100 | 0 |
在本发明中，所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的质谱参数优选如表2所示。
表2丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的质谱参数
| 组分 | 母离子(Da) | 子离子(Da) | 锥孔电压(v) | 碰撞电压(eV) |
| 丙烯酰胺 | 72.0 | 55.0*、44.00 | 30 | 9 |
| 13C3-丙烯酰胺 | 75.0 | 58.0* | 30 | 9 |
| 1-甲基咪唑 | 83.1 | 42.1*、56.1 | 40 | 15 |
| D6-1-甲基咪唑 | 89.1 | 45.1* | 30 | 15、12 |
| 2-甲基咪唑 | 83.1 | 42.1*、56.1 | 40 | 14、12 |
| D6-2-甲基咪唑 | 88.1 | 45.0* | 40 | 14、18 |
| 4-甲基咪唑 | 83.1 | 42.1*、56.1 | 40 | 14、12 |
| D6-4-甲基咪唑 | 88.1 | 45.0* | 40 | 20、14 |
其中，*代表定量离子。
本发明对所述标准曲线的获得方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
在本发明中，所述利用标准曲线分别得到所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量的方法优选为内标法。本发明分别以丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准品溶液及其对应同位素标准品溶液浓度比为横坐标，以在MRM扫描模式下各目标化合物的定量离子对强度为纵坐标进行线性回归分析得到标准曲线，并根据标准曲线计算待测液中目标化合物的含量，所述目标化合物优选包括丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑。
在本发明中，得到所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量优选包括定性分析过程，所述定性分析过程中，每种待测化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检验批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。
表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度/％ | >50 | 20-50 | 10-20 | ≤10 |
| 允许相对偏差/％ | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
在本发明中，所述供试品溶液的响应值优选在线性曲线的线性范围内，当超过线性范围上限时，本发明优选减少取样量后重新测定。
在本发明中，所述采用内标法计算样品中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量的计算式如式(1)所示：
式(1)中，X为样品中丙烯酰胺或甲基咪唑类化合物的含量，单位为μg/kg；
C为样品溶液中丙烯酰胺或甲基咪唑类化合物按照内标法在标准曲线中对应的浓度，单位为ng/mL；
V1为样品提取液体积，单位为mL；
V3为样品待测液的定容体积，单位为mL；
m为样品质量，单位为g；
V2为分取净化液浓缩体积，单位为mL。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物系列标准工作溶液的配制
1)1mg/mL的丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物标准储备溶液
准确称取丙烯酰胺标准品25mg(精确至0.01mg)，加水1mL使溶解，用乙腈转移至25mL棕色容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的丙烯酰胺标准储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
准确称取1-甲基咪唑标准品25mg(精确至0.01mg)，加水1mL使溶解，用乙腈转移至25mL棕色容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的1-甲基咪唑标准储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
准确称取2-甲基咪唑标准品25mg(精确至0.01mg)，加水1mL使溶解，用乙腈转移至25mL棕色容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的2-甲基咪唑标准储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
准确称取4-甲基咪唑标准品25mg(精确至0.01mg)，加水1mL使溶解，用乙腈转移至25mL棕色容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的4-甲基咪唑标准储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
2)2.0μg/mL的丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物混合标准应用液
分别吸取100μL的丙烯酰胺、1-甲基咪唑标准储备溶液、2-甲基咪唑标准储备溶液和4-甲基咪唑标准储备溶液置于同一50mL棕色容量瓶中，加乙腈稀释定容至刻度，摇匀，得到2.0μg/mL的丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物混合标准应用液，在4℃避光密封保存，有效期为3个月。
3)1.5mg/mL丙烯酰胺同位素内标储备溶液
准确称取15mg(精确至0.01mg)丙烯酰胺-13C3，用乙腈溶解，转移至10mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，得到1.5mg/mL的丙烯酰胺-13C3内标储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月；
4)1.5μg/mL丙烯酰胺同位素内标应用液
吸取100μL的丙烯酰胺同位素内标储备溶液于100mL棕色容量瓶中，加乙腈稀释定容至刻度，摇匀，得到1.5μg/mL的丙烯酰胺同位素内标应用液，在4℃避光密封保存，有效期为3个月。
5)1mg/mL的甲基咪唑类化合物同位素内标储备溶液
准确称取10mg(精确至0.01mg)1-甲基咪唑-D6，用乙腈溶解，转移至10mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的1-甲基咪唑-D6内标储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
准确称取10mg(精确至0.01mg))2-甲基咪唑-D6，用乙腈溶解，转移至10mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的2-甲基咪唑-D6内标储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
准确称取10mg(精确至0.01mg)4-甲基咪唑-D6，用乙腈溶解，转移至10mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，得到1mg/mL的4-甲基咪唑-D6内标储备溶液，在-20℃下避光密封保存，有效期为6个月。
6)1.0μg/mL的甲基咪唑类化合物同位素混合内标应用液
分别吸取100μL的1-甲基咪唑-D6内标储备溶液、2甲基咪唑-D6内标储备溶液和4-甲基咪唑-D6内标储备溶液于同一100mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，摇匀，得到1.0μg/mL的甲基咪唑类化合物同位素混合内标应用液，在4℃避光密封保存，有效期为3个月。
7)丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物系列标准工作溶液
分别吸取2.5μL、12.5μL、62.5μL、125μL、625μL和1250μL步骤2)得到的2.0μg/mL的丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物混合标准应用液至5mL容量瓶中，分别加入1000μL步骤4)配制的1.5μg/mL的丙烯酰胺同位素内标应用液和250μL步骤6)得到的1.0μg/mL的甲基咪唑类化合物同位素混合内标应用液，用水定容至刻度，得到丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物系列标准工作溶液；所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物系列标准工作溶液中丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的浓度分别为1.0ng/mL、5.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、250.0ng/mL、500.0ng/mL，丙烯酰胺-13C3的的浓度为300ng/mL，1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6和4-甲基咪唑-D6的浓度为50ng/mL。
2.标准曲线回归方程
将上述浓度为1.0ng/mL、5.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、250.0ng/mL和500.0ng/mL的丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物系列标准工作溶液按浓度从小到大依次进行LC-MS/MS检测。
LC-MS/MS检测的液相色谱条件包括：联苯基色谱柱为ChromCore Biphenyl，规格为3μm，3.0×150mm，柱温为35℃，进样量为5μL，流动相A为体积分数0.3％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速为0.25mL/min，梯度洗脱程序如表1所示。
质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；离子源温度为150℃；毛细管电压为2.5kV；脱溶剂温度为500℃；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测；雾化气、气帘气和辅助加热气均为高纯氮气；碰撞气为高纯氩气。使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；锥孔电压、碰撞能量等电压值优化至最优灵敏度；丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量如表2所示。
得到对应浓度的丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物系列标准工作溶液的TIC图，丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物浓度均为5.0ng/mL，丙烯酰胺-13C3的的浓度为300ng/mL，1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6和4-甲基咪唑-D6的浓度均为50ng/mL的标准工作溶液的TIC图如图1所示，并根据测定的目标化合物及其对应内标化合物的色谱峰面积，将目标化合物色谱峰与其对应内标色谱峰的峰面积比值与浓度线性拟合，得到线性回归方程，如表4所示。
当样品取样量为0.5g，萃取液总体积为15mL，净化后取10mL浓缩后复溶到1mL，检出限为信噪比S/N＝3时的仪器检测浓度0.333ng/mL，对应的样品中含量为1μg/kg；定量限为信噪比S/N＝10时的仪器检测浓度1ng/mL，对应的样品中含量为3μg/kg。
表4丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2甲基咪唑和4-甲基咪唑的线性曲线回归方程
实施例2
1.样品前处理
1)样品制备：将咖啡豆粉碎，得到样品粉末。
2)样品提取：准确称取0.5g(精确到0.0001g)样品粉末于50mL刻度离心管中，加入300μL的1.5μg/mL的13C3-丙烯酰胺内标溶液和75μL的1.0μg/mL的甲基咪唑-D6混合内标溶液，混匀后静置15min。加入5mL的0.1mol/LKOH水溶液溶解样品，涡旋振荡提取10min后，超声提取10min。
3)溶剂萃取：依次向样品提取液中加入15mL乙腈和乙酸乙酯混合液(乙腈：乙酸乙酯＝2：8)、1gNaCl和7g无水MgSO4，立即涡旋提取10min，8000rpm离心5min，取上层澄清液体12mL置于15mL离心管中。
4)样品净化：向净化液的离心管中加入150mg的N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、900mg无水硫酸镁和150mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，8000rpm离心，取出10mL上清液于15mL离心管中，加入0.1mL水，氮气吹至近干后，加入1mL水超声溶解5min，涡旋混合均匀，过0.22μm滤膜，得到待测样品液。
2.待测样品液的LC-MS/MS检测
采用实施例1的液相色谱和质谱检测条件对待测样品液进行LC-MS/MS检测，得到样品色谱图，根据所述样品色谱图得到样品中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的峰面积；根据所述峰面积与实施例1得到的标准曲线回归方程，根据式(1)，采用内标法计算待测样品液中的丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量，检测结果如表5所示。
表5咖啡样品检测结果
其中，ND代表未检出，最低检出浓度为1μg/kg。
4号咖啡阳性样品的TIC图(总离子流图)如图2所示，由图2可知，该咖啡样品中同时检出丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物。
实施例3
本实施例与实施例2的区别仅在于样品为茶叶，茶叶样品的检测结果如表6所示。
3号茶叶阳性样品的TIC图(总离子流图)如图3所示，由图3可知，该茶叶样品中同时检出丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物。
表6茶叶样品检测结果
其中，ND代表未检出，最低检出浓度为1μg/kg。
实施例4
按照实施例2的方法进行检测，与实施例2的不同之处在于：向咖啡样品中加入丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准品，加标浓度分别为5μg/kg、50μg/kg、150μg/kg、400μg/kg，测试结果为6次实验的平均值，测试结果如表7所示。
按照实施例2的方法进行检测，与实施例2的不同之处在于：样品为茶叶，向茶叶样品中加入丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准品，加标浓度分别为5μg/kg、50μg/kg、150μg/kg、400μg/kg，测试结果为6次实验的平均值，测试结果如表7所示。
表7咖啡、茶叶样品中3种甲基咪唑类化合物和丙烯酰胺加标回收结果
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由表7可知，咖啡及茶叶样品中丙烯酰胺、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的加标浓度分别为5μg/kg、50μg/kg、150μg/kg和400μg/kg时，平均回收率在89.8～109.5％之间，精密度在1.9～4.9％之间，说明本发明提供的前处理方法和检测方法的准确度高、精确度高。
由以上可知，本发明的检测方法准确度好，精密度高，可用于茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和3种甲基咪唑类化合物的同时检测，本发明检测方法的建立，具有现实意义。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性劳动前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (3)
1.一种茶叶和/或咖啡中丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的同时检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将茶叶和/或咖啡样品粉碎，得到样品粉末；
将所述样品粉末依次进行提取、萃取、净化和浓缩，得到供试品溶液；所述提取的提取液包括碱性溶液；所述碱性溶液包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液，所述碱性溶液的浓度为0.01~0.1mol/L；所述萃取的萃取剂包括乙腈和乙酸乙酯的混合溶液；所述乙腈和乙酸乙酯的混合溶液中乙腈和乙酸乙酯的体积比为1：1~9；所述萃取的过程还包括加入无水硫酸镁和氯化钠；所述净化使用的净化材料包括：N-丙基乙二胺吸附剂、无水硫酸镁和C18吸附剂，所述N-丙基乙二胺吸附剂、无水硫酸镁、C18吸附剂与样品粉末的质量比为0.05~0.3：0.3~1.5：0.05~0.3：0.4~0.6；
将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据预定的标准曲线和得到的供试品的质谱图，分别得到所述丙烯酰胺和甲基咪唑类化合物的含量；所述甲基咪唑类化合物包括1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为联苯基色谱柱；所述联苯基色谱柱包括ChromCore Biphenyl，规格为3μm，3.0×150mm；流动相A为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1~0.3%，流动相B为甲醇，梯度洗脱；柱温为25~35℃，进样量为1~10μL，流速为0.2~0.6mL/min；所述梯度洗脱的洗脱程序如下表所示：
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；离子源温度：150℃；毛细管电压：2.5kV；脱溶剂温度：500℃；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；雾化气、气帘气和辅助加热气均为氮气；碰撞气：氩气。
2.根据权利要求1所述的同时检测方法，其特征在于，所述提取液的体积与样品粉末的质量的比值为3~10mL：0.4~0.6g。
3.根据权利要求1所述的同时检测方法，其特征在于，所述萃取使用的萃取剂与提取使用的提取液的体积比为5~25：3~10。
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