CN113533608A - 一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，步骤如下：1）将待测食用油样品用正己烷稀释后，经松花粉固相萃取小柱上样，对样品中的黄曲霉毒素进行萃取富集；2）上样结束后，松花粉固相萃取小柱经清洗去除干扰物，解吸、复溶后，所得溶液即为食用油中黄曲霉毒素的待测液；3）采用外标法，高效液相色谱‑荧光检测器快速检测样品中的黄曲霉毒素含量。本发明前处理过程可以去除食用油中大量基质，净化效果好，黄曲霉毒素的回收率很好，结合普适性、低成本的液相色谱‑荧光检测器对黄曲霉毒素进行分离检测，可实现大批量食用油样品的低成本快速检测，且检测灵敏度和准确性高，重现性好。

Description

一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检 测的方法

技术领域

本发明属于快速分析检测技术领域，特别涉及一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins)是污染农产品与食品最常见的真菌毒素之一，主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和特曲霉(又叫“集蜂曲霉”，Aspergillus nomius)等产毒真菌侵染寄主后产生的一类有毒次生代谢产物。在花生、玉米、大米、坚果、棉籽和乳制品等110余种农产品及食品中均有检出，其中以花生和玉米等粮油产品污染最为严重。黄曲霉毒素分子结构稳定，耐高温(熔点为237℃～299℃)，在一般的烹调加工温度下很难被破坏。

目前，已分离出20多种黄曲霉毒素及其衍生物，常见种类主要是黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)和黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素M2(AFM2)。自然条件下，受污染的植物源性食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，它是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者可能与致癌性有关。黄曲霉毒素是迄今发现的毒性最强的一类真菌毒素，具有急、慢性毒性，可致癌、致畸、致突变。黄曲霉毒素危害的主要靶标是肝脏，属肝毒素，对肝脏组织有破坏作用，毒性大小因黄曲霉毒素种类或结构不同存在较大差异。实验结果表明，黄曲霉毒素B1毒性最强，为氰化钾的10倍，砒霜的68倍，致癌力是六六六的10000倍。1993年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将黄曲霉毒素B1列为I类致癌物。黄曲霉毒素G1的致癌能力低得多，黄曲霉毒素B2和G2本身不致癌，但认为B2可在体内经生物转化小部分成为B1，因此，B2也有一定致癌性。

油料和粮食作物容易被黄曲霉毒素B1污染，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。因此，GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中对植物油脂中黄曲霉毒素B1设立了最高限量—植物油脂(玉米油、花生油除外)为10μg/kg，玉米油、花生油中黄曲霉毒素的最高限量为20μg/kg。因此，建立食用油中黄曲霉毒素的快速分析方法非常重要。

与水果和蔬菜等农产品相比，食用油基质中含有大量的内源性干扰物，如甘油三脂、生育酚等，这些干扰物质一方面会对目标物的定性和定量检测产生干扰，同时也会减少色谱柱和仪器的使用寿命，因此必须采取合适的样品前处理技术去除这些干扰物。现行的黄曲霉毒素检测标准GB 5009.22(食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定)中公开了一种食用油中黄曲霉毒素的前处理方法，主要涉及20mL的乙腈-水(50+50)或甲醇-水(70+30)提取，液液萃取分层，随后取有机相用缓冲盐稀释后，采用免疫亲和柱纯化。李莉和李硕(化学分析计量.2020,29(06):10-14)报道了一种基于分散固相萃取的食用油中黄曲霉毒素的前处理方法，样品采用乙腈-水(84+16)提取，盐析分层后，有机相采用DisQuE净化管(含有750mg硫酸镁、250mg PSA、150mg C18和150mg Al-N)进行净化，液相色谱串联质谱检测。类似地，JoséL.Hidalgo-Ruiz等人(Food chemistry,2019,288:22-28)也采用乙腈-水(80+20)提取，盐析分层后，有机相采用100mg的C18进行净化，液相色谱串联质谱检测。尽管以上方法都可以得到很好的灵敏度和准确度，然而以上前处理方法在液液萃取过程中有机溶剂的用量较大，耗时较长，而且免疫亲和柱和净化包的成本很高，步骤繁琐，不利于大批量样品低成本、高通量的检测。因此，低成本、大批量样品中黄曲霉毒素的分析方法亟待开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的不足，提供一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，通过一步固相萃取技术实现食用油中黄曲霉毒素快速的富集净化，避免了传统液液萃取和凝胶渗透色谱有机溶剂消耗多、步骤繁琐等缺点，再结合普适性的液相色谱-荧光检测器对黄曲霉毒素进行分离检测，大大减少了样品分析的成本，实现大批量样品低成本的快速检测。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，包括如下步骤：

1)将食用油用正己烷稀释后，加入到松花粉固相萃取小柱中，对其中的黄曲霉毒素进行富集净化；

2)上样完成后，经正己烷清洗，丙酮解吸，乙腈-水(50/50，v/v)复溶后，所得溶液即为快速测定食用油中黄曲霉毒素残留的待测液；

3)采用溶剂校准曲线，将黄曲霉毒素配制成一系列浓度的标准溶液，并用高效液相色谱-荧光检测器进行分析，然后浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制黄曲霉毒素的校准曲线；

4)将步骤2)所得食用油中黄曲霉毒素的待测液用高效液相色谱-荧光检测器进行分析，根据出峰时间确定黄曲霉毒素的具体类别，并将峰面积分别代入对应的校准曲线，从而得到待测液中黄曲霉毒素的含量，进而计算得到食用油样品中黄曲霉毒素残留的含量。

按上述方案，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。

按上述方案，所述稀释溶剂采用正己烷，其他非极性溶剂例如石油醚、正戊烷、正庚烷等也适用，但不能采用中等极性和强极性的溶剂，例如二氯甲烷、乙酸乙酯等，这是由于松花粉萃取黄曲霉毒素是基于极性和π-π相互作用机理，极性溶剂会减弱两者间相互作用力，导致萃取效率降低。优选地，食用油的质量和稀释溶剂的体积比值在0.01～2范围内。

按上述方案，所述松花粉前处理过程如下：采用索氏提取法，取松花粉颗粒，甲醇回流24h，去除花粉吸附剂中的色素等干扰物质，得到的吸附剂在60℃下减压干燥12h，备用。所述食用油和花粉的质量比在0.5～5.0范围内。

按上述方案，清洗溶剂采用正己烷。溶剂的体积用量与食用油质量比值在5～20范围内。

按上述方案，所述解吸溶剂为非质子极性溶剂丙酮，可以很好地破坏松花粉与黄曲霉毒素之间的极性和π-π相互作用，其他溶剂(例如乙腈、甲醇等)解吸效果没有丙酮好，选择解吸溶剂丙酮的体积用量与食用油质量比值在10～30范围内。

优选地，所述解吸液经吹干后复溶，复溶溶剂采用流动相乙腈-水(乙腈和水的体积比优选1:1)混合溶剂，能够将目标物有效溶解即可。

按上述方案，所述校准曲线的浓度线性范围在0.1～20μg/kg。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明通过一步固相萃取技术实现食用油中黄曲霉毒素快速的富集净化，可以去除食用油中大量基质，净化效果好，黄曲霉毒素的回收率很好，避免了传统液液萃取、离心和凝胶渗透色谱有机溶剂消耗多、步骤繁琐等缺点；

(2)本发明所述的前处理方法结合高效液相色谱-荧光检测，实现了对黄曲霉毒素的快速分离和检测，建立了食用油中黄曲霉毒素快速、有效和灵敏的分析方法，检测灵敏度和准确性高，且方法具有很好的重现性，并成功应用于市场上多种食用油中黄曲霉毒素的分析检测，非常适合大批量食用油样品中黄曲霉毒素的快速分析检测。

(3)本发明采用松花粉作为固相萃取小柱的填充材料，实现对食用油中的黄曲霉毒素的选择性地萃取。松花粉的尺寸大约在30-40μm，其外壳孢子花粉素结构稳定，其表面含有大量的羟基和芳香基团，在正相色谱的模式下易于黄曲霉毒素发生π-π和氢键等相互作用，从而选择性地萃取食用油中的黄曲霉毒素。

(4)本发明使用天然松花粉作为黄曲霉毒素固相萃取吸附剂，避免了高成本的免疫亲和柱、黄曲霉毒素专用柱以及其他化学吸附剂的使用，分析成本较传统方法降低10-100倍，具有环境友好、成本低、萃取效率高等优点。相比背景技术中的免疫亲和柱(>80元/根)和分散固相萃取的吸附剂(>600元/100g)，花粉作为免疫亲和柱和分散固相萃取的吸附剂的成本很低(500g不到50元)，在大批量样品分析中可以大大节约样品分析的成本。因此，本发明将花粉作为固相萃取的吸附剂，构建了食用油中大批量、低成本的黄曲霉毒素分析方法体系。

附图说明

图1为本发明所述的食用油固相萃取的前处理方法的一种具体示意图。其中，目标物为黄曲霉毒素B1和B2。

图2为2种黄曲霉毒素的标样色谱图。

图3为对比例1中不同上样溶剂的黄曲霉毒素回收率结果。

图4为对比例2中不同清洗溶剂的黄曲霉毒素回收率结果。

图5为对比例3中不同解吸溶剂的黄曲霉毒素回收率结果。

图6为对比例4中不同体积解吸溶剂(丙酮)的黄曲霉毒素回收率结果。

图7为不同质量松花粉用量的黄曲霉毒素回收率结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所述固相萃取吸附剂松花粉原材料购买于超市，500g袋装破壁松花粉，前处理过程如下：采用索氏提取法，取粗松花粉粒用甲醇回流清洗24h，得到的颗粒物在60℃下减压干燥12h，备用。将前处理后的松花粉填充于SPE小柱，得到松花粉SPE小柱。

下述实施例中，2种黄曲霉毒素物质是黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。黄曲霉毒素B1(2.0μg/mL)和黄曲霉毒素B2(2.0μg/mL)由农业部环境保护科研监测所(天津)提供。下述实施例中将2种黄曲霉毒素标样用色谱纯正己烷配制成200μg/L的混合标样，在后续实验中，将其加入样品溶液得到所需要的浓度。标准溶液在4℃冰箱中避光保存，实验证明，在该条件下，所有的标准品可稳定保存至少一个月。

实施例1

一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，如图1所示，步骤如下：

1)称取0.5g待测食用油样品置于5mL离心管中，用3mL正己烷稀释上述待测食用油样品，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，使用前用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，实现对样品溶液中黄曲霉毒素萃取富集；

3)继续加入5mL正己烷淋洗SPE柱，然后用5mL丙酮解吸，解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为快速测定食用油中黄曲霉毒素的待测液，进行后续HPLC-FLD分析，即快速检测食用油中黄曲霉毒素残留。

本发明建立了低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，本实施例选择了2种黄曲霉毒素(包括AFB1和AFB2)用于该方法的考察。本实施例，以及后续实施例中，所述高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)的检测条件：液相色谱采用WatersAlliance 2695高效液相色谱系统，分析柱为Insert ODS-3柱(250×4.6mm，5μm)(GLScience Inc.，Tokyo，Japan)，流速0.8mL/min，进样量为20μL；柱温和样品盘温度分别为40℃和10℃；流动相为ACN:MeOH:H₂O(2:3:5，v/v/v)。荧光检测器：发射波长384nm，激发波长406nm，柱温40℃。

实施例2

为了验证本发明所提供的低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法在实际应用中的可行性，本实施例对其线性、检出限(LODs)、定量限(LOQs)等参数进行了考察。将2种黄曲霉毒素配制0.1～20μg/kg的系列标准混合溶液，采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，以每种组分浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标，建立黄曲霉毒素的校准曲线。如表1所示，2种黄曲霉毒素在0.1～20μg/kg的范围内线性关系良好，回归系数的平方(R²)大于0.9987；以信噪比的3倍和10倍计算出2种黄曲霉毒素的检出限和定量限分别在0.003～0.01μg/kg和0.01～0.03μg/kg的范围内。

表1 2种黄曲霉毒素校准曲线的线性范围、线性方程、回归系数的平方(R²)、检出限(LODs)和定量限(LODs)

实施例3

为了评价本发明所提供的低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法的准确性和精密度，本实施例对该方法的回收率进行了考察。具体步骤如下：

1)称取0.5g食用油样品置于5mL离心管中，添加低、中、高三种浓度的黄曲霉毒素作为待测食用油样品，涡旋混匀后静置30min，用3mL正己烷稀释上述待测食用油样品，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL正己烷淋洗SPE柱，然后用5mL丙酮解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为快速测定食用油中黄曲霉毒素的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将每种组分所得峰面积分别代入实施例2对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种组分的浓度；然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，结果如表2所示。

另外，以一天内单独配制4组平行样品进行实验，根据得到的检测结果计算出日内相对标准偏差；以连续4天单独配制的样品进行实验，根据得到的检测结果计算出日间相对标准偏差，结果如表3所示。

表2食用油样品中黄曲霉毒素在低、中、高三个浓度水平下的平均加标回收率和RSD％(n＝4)

表3日内日间精密度(n＝4)

由表2所知：本发明所述方法中大部分农药的回收率在83.2～105.8％，RSDs低于4.5％，说明本发明建立的低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法准确度高；由表3可知：本方法得到的日内相对标准偏差低于3.5％，日间相对标准偏差低于4.8％，说明本发明建立的低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法重现性良好。

实施例4

一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，本实施例对市场上4种植物油(玉米油、花生油、菜籽油和核桃油)作为待测食用油样品进行分析，每个样品的具体步骤均如下：

1)称取0.5g待测食用油样品置于5mL离心管中，用3mL正己烷稀释上述待测食用油样品，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL正己烷淋洗SPE柱，最后用5mL丙酮解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为快速测定食用油中黄曲霉毒素的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，检测结果表明，4种油样中未检测到黄曲霉毒素。

为了考察方法的适用性，在4种食用油样品中添加2.5μg/kg的目标分析物(即AFB1和AFB2)，按照以上步骤进行样品前处理和仪器分析，分别根据出峰时间确定黄曲霉毒素具体种类，将每种组分所得峰面积分别代入实施例2对应的线性方程中，计算得到待测样品中黄曲霉毒素的浓度；然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，不同种类食用油的黄曲霉毒素回收率结果如表4所示。

表4不同种类食用油的黄曲霉毒素回收率结果

实施例5

本实施例对一种植物油质控样品中的黄曲霉毒素进行快速检测，步骤如下：

1)称取0.5g质控花生油样品置于5mL离心管中，用3mL正己烷稀释上述质控食用油样品，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，使用前用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL正己烷淋洗SPE柱，最后用5mL丙酮解吸，解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为快速测定食用油中黄曲霉毒素的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将黄曲霉毒素B1组分所得峰面积代入实施例2对应的线性方程中，计算得质控植物油样品中黄曲霉毒素B1的浓度，结果如表5所示。

表5植物油质控样品中的黄曲霉毒素B1结果分析

对比例1

一种检测食用油中黄曲霉毒素的方法，采用不同于实施例的上样溶剂，具体步骤如下：

1)称取0.5g食用油样品置于5mL离心管中，添加5μg/kg的目标分析物(即AFB1和AFB2)，涡旋混匀，静置30min后，用3mL不同上样溶剂(分别为正己烷、甲苯和乙酸乙酯)溶解稀释油样，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL正己烷淋洗SPE柱，最后用5mL丙酮解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为对比例1的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将每种组分所得峰面积分别代入实施例2对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种组分的浓度。然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，不同上样溶剂的黄曲霉毒素回收率结果如图3所示。

对比例2

一种检测食用油中黄曲霉毒素的方法，采用不同于实施例的清洗溶剂，具体步骤如下：

1)称取0.5g食用油样品置于5mL离心管中，添加5μg/kg的目标分析物(即AFB1和AFB2)，涡旋混匀，静置30min后，用3mL正己烷稀释油样，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL乙酸乙酯与正己烷混合溶液(乙酸乙酯含量0～100％)淋洗SPE柱，最后用5mL丙酮解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为对比例2的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将每种组分所得峰面积分别代入实施例2对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种组分的浓度。然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，不同清洗溶剂的黄曲霉毒素回收率结果如图4所示。

对比例3

一种检测食用油中黄曲霉毒素的方法，采用不同于实施例的解吸溶剂，具体步骤如下：

1)称取0.5g食用油样品置于5mL离心管中，添加5μg/kg的目标分析物(即AFB1和AFB2)，涡旋混匀，静置30min后，用3mL正己烷稀释油样，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL淋洗松花粉SPE柱，最后用5mL不同溶剂(甲醇、乙腈和丙酮)解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为对比例2的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将每种组分所得峰面积分别代入实施例3对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种组分的浓度。然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，不同清洗溶剂的黄曲霉毒素回收率结果如图5所示。

对比例4

一种检测食用油中黄曲霉毒素的方法，采用不同于实施例的解吸溶剂体积，具体步骤如下：

1)称取0.5g食用油样品置于5mL离心管中，添加5μg/kg的目标分析物(即AFB1和AFB2)，涡旋混匀，静置30min后，用3mL正己烷稀释油样，并涡旋1min，备用；

2)取松花粉SPE小柱(500mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL淋洗松花粉SPE柱，最后用不同体积的丙酮(3～9mL)解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为对比例4的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将每种组分所得峰面积分别代入实施例2对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种组分的浓度。然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，不同体积清洗溶剂的黄曲霉毒素回收率结果如图6所示。

对比例5

一种检测食用油中黄曲霉毒素的方法，采用不同于实施例的吸附剂填充质量，具体步骤如下：

1)称取0.5g食用油样品置于5mL离心管中，添加5μg/kg的目标分析物(即AFB1和AFB2)，涡旋混匀，静置30min后，用3mL正己烷稀释油样，并涡旋1min，备用；

2)取不同吸附剂量的松花粉SPE小柱(100-1000mg，6mL)，用3mL正己烷活化，将步骤1)所得样品溶液转入SPE小柱中，弃去流出液，萃取富集样品溶液中的黄曲霉毒素；

3)加入5mL淋洗松花粉SPE柱，最后用5mL丙酮解吸，所得解吸液N₂吹干，采用1.0mL乙腈-水(50/50，v/v)复溶，所得溶液即为对比例5的待测液，进行后续HPLC-FLD分析。

4)将步骤3)所得待测液采用实施例1中的HPLC-FLD条件进行分析，根据出峰时间定性，将每种组分所得峰面积分别代入实施例2对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种组分的浓度。然后通过计算的值除以添加的值即可以得到黄曲霉毒素的添加回收率，不同清洗溶剂的黄曲霉毒素回收率结果如图7所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将待测食用油样品用正己烷稀释后，经松花粉固相萃取小柱上样，实现对样品中的黄曲霉毒素的萃取富集；

2）将步骤1）上样完成的松花粉固相萃取小柱经清洗、解吸、复溶后，所得溶液即为食用油中黄曲霉毒素的待测液；其中，清洗溶剂为正己烷，解吸溶剂为丙酮；

3）采用溶剂校准曲线，将黄曲霉毒素配制成一系列浓度的标准溶液，并用高效液相色谱-荧光检测器进行分析，然后浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制黄曲霉毒素的校准曲线；

4）将步骤2）所得食用油中黄曲霉毒素的待测液用高效液相色谱-荧光检测器进行分析，根据出峰时间确定黄曲霉毒素的具体类别，并将峰面积分别代入对应的校准曲线，从而得到待测液中黄曲霉毒素的含量，进而计算得到食用油样品中黄曲霉毒素残留的含量。

2.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1和B2。

3.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于步骤1）中，待测食用油样品的质量和正己烷的体积比在0.01～2范围内。

4.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于步骤1）中，所述待测食用油样品和固相萃取小柱中填充材料松花粉的质量比在0.5～10范围内。

5.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于步骤2）中，所述清洗溶剂的体积与待测食用油样品的质量比在5～20范围内。

6.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于步骤2）中，所述解吸溶剂的体积与待测食用油样品的质量比在10～30范围内。

7.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于所述复溶溶剂为乙腈-水的混合溶液，复溶溶剂体积与待测食用油样品的质量比在1～5范围内。

8.根据权利要求1所述的一种低成本的适合于大批量食用油样品中黄曲霉毒素快速检测的方法，其特征在于所述校准曲线的浓度线性范围在0.1～20 μg/kg。

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