CN112362796A - 一种蜂花粉中生物毒素的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蜂花粉中生物毒素的检测方法及其应用，所述检测方法包括以下步骤：(1)样品提取：将粉碎、均质后的蜂花粉样品中加入提取溶剂进行提取，然后加入盐析剂，混匀后离心，将离心后的上清液作为样品提取液；其中该提取溶剂包括乙腈、水和甲酸溶液，所述乙腈、水和甲酸溶液的体积比为75:20:5；(2)样品净化：将所述样品提取液加入净化柱中净化、进一步过滤得到目标检测液；(3)样品检测：将所述目标检测液置于超高效液相色谱‑三重四级杆串联质谱仪中进行分析检测。该检测方法实现了蜂花粉中10种生物毒素的高通量检测，分析时间短，定性、定量检测结果稳定可靠。

Description

一种蜂花粉中生物毒素的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物毒素检测技术领域，具体涉及一种蜂花粉中生物毒素的检测方法及其应用。

背景技术

蜂花粉是由蜜蜂将采集的花粉粒掺入少量的花蜜和自身腺体分泌物混合而成的花粉团，是蜜蜂的主要食物，其中含有多种重要的营养成分，如蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素和矿物质。除了能提供丰富的营养外，蜂花粉还具有抗炎、抗疲劳、增强免疫力等功能特性，自古以来就被人们当做营养和保健品食用。由于花粉的含水量、水活度和pH值非常适宜微生物如细菌、霉菌和酵母等的繁殖，是天然的培养基，因此蜂花粉在采集、储存和销售过程中很容易滋生霉菌而有可能产生生物毒素。根据国外文献报道，黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、脱氧雪烯醇和T-2毒素等生物毒素在蜂花粉中均有检出。生物毒素具有较高的生物毒性，如致癌、致畸和肝肾毒性等。根据IARC的致癌物质分级列表，目前已明确致癌或可能致癌的生物毒素类有：黄曲霉毒素B₁(1，2012)、赭曲霉毒素A、伏马毒素B₁(2B，2002)，摄入被生物毒素污染的食品会对人类健康造成极大危害。我国食品安全国家标准GB2761-2017为几种类型的食品设定了黄曲霉毒素B₁、M₁，赭曲霉毒素A的最高限量要求，但未包含蜂花粉等产品。关于伏马毒素，目前我国尚无伏马毒素的限量要求。

目前常用的生物毒素的净化方式多采用免疫亲和柱或富集浓缩型固相萃取小柱(SPE)的方法，免疫亲和柱虽然特异性强，但是往往只能针对特定种类的毒素，且价格昂贵，操作繁琐；传统固相萃取小柱需要经过活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，所用有机试剂较多且耗时较长，这两种净化方式都不适用于多种生物毒素的快速筛查。

此外，目前国内外文献报道中，有关蜂花粉中生物毒素的测定方法主要是液相色谱质谱联用技术，主要针对单一毒素或一类毒素进行检测，如赭曲霉毒素A或黄曲霉毒素B族和G族等，缺少对赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C，伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、伏马毒素B₃的检测方法，难以开展对蜂花粉中有毒有害物质的高通量检测，也尚未有多种致癌性生物毒素同时测定的报道。检测方法的不足直接制约了蜂花粉中生物毒素的风险评估和限量制定的研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种蜂花粉中生物毒素的检测方法，该检测方法实现了蜂花粉中10种生物毒素的高通量检测，分析时间短，定性、定量检测结果稳定可靠。

本发明的另一个目的在于提供所述生物毒素的检测方法的应用。

为达上述目的，一方面，本发明提供了一种蜂花粉中生物毒素的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)样品提取：将粉碎、均质后的蜂花粉样品中加入提取溶剂进行提取，然后加入盐析剂，混匀后离心，将离心后的上清液作为样品提取液；其中该提取溶剂中包括乙腈、水和甲酸溶液，所述乙腈、水和甲酸溶液的体积比为75:20:5；(2)样品净化：将所述样品提取液加入净化柱中净化、进一步过滤得到目标检测液；(3)样品检测：将所述目标检测液置于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪中进行分析检测；其中，分析检测所述目标检测液中生物毒素的种类包括：黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、伏马毒素B₃。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(1)中，每克蜂花粉中需要加入提取溶剂8-10mL。

由于蜂花粉基质较为复杂，富含蛋白质、脂类、黄酮类化合物和色素等成份，提取溶剂的选择直接影响目标化合物的提取效率。此外，10种生物毒素性质差异较大，其中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂易溶于有机溶剂；赭曲霉毒素A、B、C可溶于极性有机溶剂，微溶于水；伏马毒素B₁、B₂、B₃结构中含有极性基团，易溶于水，且伏马毒素类化学结构中含有羧基，水溶性强，对酸敏感。本发明发现：含有乙腈、水和甲酸溶液的提取溶剂能够适应蜂花粉基质以及10种生物毒素的特点，实现准确检测。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(1)中，加入提取溶剂后需旋涡混匀30-60s，室温下超声提取20-30min。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(1)中，所述蜂花粉与所述盐析剂的质量比为1:2；优选地，所述盐析剂包括MgSO₄和NaCl，所述MgSO₄和NaCl的质量比为4:1。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(1)中，加入盐析剂后通过涡旋剧烈振摇1min以进行混匀，所述离心的条件为8000-10000r/min，离心5-10min。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(2)中，所述净化柱为纳米复合材料材质的MPFC-QuEChERS高脂类超滤型净化柱。

本发明是以蜂花粉样品为基础，蜂花粉基质复杂，蛋白质、脂类、黄酮类物质和色素是松花粉中主要的基质干扰。MPFC-QuEChERS超滤型净化柱采用的是纳米复合材料，比表面积大、去除基质中其它大分子干扰物优于PSA、C₁₈等，能够兼顾多种类别生物毒素的提取效果，保证10种毒素回收率满足要求。本发明首次将QuEChERS快速样品前处理技术用于蜂花粉中多种生物毒素的检测，前处理过程简单、快捷，样品经过溶剂提取，净化柱快速净化后即可上机检测，克服了目前普遍采用的免疫亲和柱纯化方法成本高、效率低、对检验者要求高的弊端，大大提高了样品的提取净化效率。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(2)中，所述过滤是通过微孔有机滤膜过滤的，优选地，所述微孔有机滤膜为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(3)中，所述超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪中的色谱条件为：色谱柱Agilent Infinity Poroshell 120SB-C18柱，长度100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm；柱温40℃；流速：0.3mL/min；进样量5μL；流动相：0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸乙腈溶液。

根据本发明的一些具体实施方案，步骤(3)中，所述超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪中的质谱条件为：离子化方式为电喷雾离子化正模式，多反应监测模式，雾化气流量3L/min，干燥气流量10L/min，加热气流量10L/min，接口温度300℃，接口电压4.0kV。

另一方面，本发明还提供了上述检测方法在蜂花粉安全风险评估和筛查监测中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次对蜂花粉中10种生物毒素采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法进行检测，分析时间短，定性、定量检测结果稳定可靠，可用于蜂花粉的安全风险评估和筛查监测，具有较广的应用前景。

(2)本发明的检测方法对于蜂花粉的前处理过程简单、快捷，首次将QuEChERS快速样品前处理技术用于蜂花粉中多种生物毒素的检测，样品经过溶剂提取，净化柱快速净化后即可上机检测，克服了目前普遍采用的免疫亲和柱纯化方法成本高、效率低、对检验者要求高的弊端，大大提高了样品的提取净化效率。

附图说明

图1为本发明10种生物毒素的总离子流色谱图；

图2A为本发明黄曲霉毒素B₁的MRM定量离子色谱图；

图2B为本发明黄曲霉毒素B₂的MRM定量离子色谱图；

图2C为本发明黄曲霉毒素G₁的MRM定量离子色谱图；

图2D为本发明黄曲霉毒素G₂的MRM定量离子色谱图；

图2E为本发明伏马毒素B₁的MRM定量离子色谱图；

图2F为本发明伏马毒素B₂的MRM定量离子色谱图；

图2G为本发明伏马毒素B₃的MRM定量离子色谱图；

图2H为本发明赭曲霉毒素A的MRM定量离子色谱图；

图2I为本发明赭曲霉毒素B的MRM定量离子色谱图；

图2J为本发明赭曲霉毒素C的MRM定量离子色谱图；

图3为本发明采用MPFC-QuEChERS超滤型净化柱和其他净化柱的净化效果的对比图；

图4A为本发明采用0.1％甲酸溶液-乙腈体系流动相对10种毒素的洗脱分离效果的影响；

图4B为本发明采用5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈体系流动相对10种毒素的洗脱分离效果的影响；

图5为本发明提取溶液种类对10种生物毒素的提取效率的影响；

图6为本发明提取溶液酸度对10种生物毒素的提取效率的影响。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明/的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1

本实施例提供了蜂花粉中生物毒素的检测方法的样品提取过程，具体步骤如下：

准确称取粉粹过筛后的样品2.5g(精确至0.001g)于50mL聚丙烯离心管中(对于加标样品，加入所需体积的标准溶液)。加入20mL乙腈-水-甲酸溶液(75：20：5，v/v/v)，旋涡混匀30s，室温下超声提取30min。在样品经超声提取后加入4g MgSO₄和1g NaCl(QuEChERS提取盐包，含有4g MgSO₄和1g NaCl，北京绿绵科技有限公司公司)，剧烈振摇1min，10000r/min离心5min。所使用仪器如下：

AL 204分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；Vortex Genie 2涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司)；CF 16RXII离心机(日本日立公司)；KQ-3200DE超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

实施例2

本实施例提供了蜂花粉中生物毒素的检测方法的样品净化过程，具体步骤如下：

样品经离心后，取上清液1mL过MPFC-QuEChERS高脂类超滤型净化柱(北京绿绵科技有限公司)净化后，经0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，续滤液作为待测溶液。

本发明选择上述净化过程的原因在于，由于蛋白质、脂类、黄酮类物质和色素是松花粉中主要的基质干扰，目前常用的生物毒素的净化方式多采用免疫亲和柱或富集浓缩型固相萃取小柱(SPE)的方法，免疫亲和柱虽然特异性强，但是往往只能针对特定种类的毒素，且价格昂贵，操作繁琐；传统固相萃取小柱需要经过活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，所用有机试剂较多且耗时较长，这两种净化方式都不适用于多种生物毒素的快速筛查。采用空白基质加标的方式考察不同净化材料对10种生物毒素净化效果的影响，向空白蜂花粉基质中添加低(5μg/L)和高(20μg/L)2种浓度的10种生物毒素标准溶液，提取后分别采用DisQuE净化管(含有PSA、C18等材料)和MPFC-QuEChERS净化柱(含有新型纳米复合材料)净化，具体对比结果详见图3。从图3中可以看出3种伏马毒素经过DisQuE净化管净化后的回收结果偏低，回收率小于60％，而10种生物毒素经过MPFC-QuEChERS净化柱净化后的回收率均大于75％，该方法能够兼顾多种类别生物毒素的提取净化效果，保证10种毒素回收率都满足实验要求。

实施例3

本实施例提供了蜂花粉中生物毒素的检测方法的样品检测过程，具体步骤如下：

采用LCMS-8060超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪(日本岛津公司)对净化后的样品进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱分析。

色谱条件：

色谱柱Agilent Infinity Poroshell 120SB-C18柱，长度100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm；柱温40℃；流速：0.3mL/min；进样量5μL。流动相：0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸乙腈溶液，流动相及梯度洗脱程序见表1：

表1

时间/min	0.1％甲酸水溶液/％	0.1％甲酸乙腈溶液/％
			0	90	10
1	80	20
			9	60	40
12	5	95
			14	5	95
14.1	90	10
			16	90	10

本实施例研究考察了0.1％甲酸溶液-乙腈体系和5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈体系两种流动相对10种毒素的洗脱分离效果，发现以0.1％甲酸溶液-乙腈体系为流动相时得到的基线平稳，噪音小，同分异构体的分离效果更好(具体结果详见图4A和图4B)。因此选择0.1％甲酸溶液-乙腈体系为流动相进行梯度洗脱。

质谱条件：电喷雾离子源(electrospray ion，ESI)，多反应监测(multi reactionmonitoring，MRM)模式，雾化气流量3L/min，干燥气流量10L/min，加热气流量10L/min，接口温度300℃，接口电压4.0kV，其他质谱分析条件参数见表2。

表2

符号说明：伏马毒素(FB₁,FB₂,FB₃),黄曲霉毒素(AFB₁,AFB₂,AFG₁,AFG₂)，赭曲霉毒素(OTA,OTB,OTC)。

由于10种生物毒素采用电喷雾离子源(ESI)时都有较高的响应，选用ESI+模式对目标化合物一级质谱全扫描，得到目标物的[M+H]⁺母离子，随后进行二级扫描，优化电压选择响应最强的2个子离子，并在多反应监测模式(MRM)下优化出子离子响应最优时的碰撞能量，得到最优的质谱条件。其中10种生物毒素的总离子流色谱图详见图1，上述10种生物毒素各自的MRM定量离子色谱图详见图2A-图2J。

对比例1

本对比例对乙腈和甲酸的使用体积进行验证，具体步骤及结果如下：

10种生物毒素性质差异较大，其中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂易溶于有机溶剂；赭曲霉毒素A、B、C可溶于极性有机溶剂，微溶于水；伏马毒素B₁、B₂、B₃结构中含有极性基团，易溶于水。此外，蜂花粉基质较为复杂，富含蛋白质、脂类、黄酮类化合物和色素等成份，提取溶剂的选择直接影响目标化合物的提取效率。实验通过空白基质加标的方式，考察了乙腈、75％乙腈溶液和50％乙腈溶液3种提取溶液的提取效果。实验结果(如图5所示)表明，4种黄曲霉毒素和3种赭曲霉毒素用纯乙腈或75％乙腈溶液提取，回收率较好，用50％乙腈溶液提取时回收率小于40％；3种伏马毒素用75％乙腈溶液或50％乙腈溶液时，回收率大于70％，用纯乙腈提取时回收率小于50％。综合考虑后选择75％乙腈溶液作为提取溶剂。

由于伏马毒素类化学结构中含有羧基，水溶性强，对酸敏感，提取溶剂加入适量的酸可以提高回收率。对4种不同酸度的提取溶液(甲酸含量分别为5％和10％、乙酸含量分别为0.5％和1％)进行考察，具体试验结果如图6所示。通过图6可以得知对于黄曲霉毒素和赭曲霉毒素而言，酸度对其回收率影响差异不大。但是伏马毒素的提取效率受酸度影响较大，提取液中酸度低时，伏马毒素的回收率很低，当提取液中甲酸含量为5％时，10种生物毒素的回收率在70％～120％之间，满足回收率实验要求。因此最终选择乙腈-水-甲酸溶液(75：20：5，v/v/v)作为样品的提取溶剂。此外，在提取体系中加入适量MgSO₄和NaCl可以促进乙腈和水相更好的分层，在盐析作用下容易从水相中萃取极性较弱的毒素，同时还能减少干扰杂质的引入有利于样品溶液的进一步净化。

Claims (10)

1.一种蜂花粉中生物毒素的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)样品提取：将粉碎、均质后的蜂花粉样品中加入提取溶剂进行提取，然后加入盐析剂，混匀后离心，将离心后的上清液作为样品提取液；其中该提取溶剂中包括乙腈、水和甲酸溶液，所述乙腈、水和甲酸溶液的体积比为75:20:5；

(2)样品净化：将所述样品提取液加入净化柱中净化、进一步过滤得到目标检测液；

(3)样品检测：将所述目标检测液置于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪中进行分析检测；其中，分析检测目标检测液中生物毒素的种类包括：黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、伏马毒素B₃。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，每克蜂花粉中需要加入提取溶剂8-10mL。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，加入提取溶剂后需旋涡混匀30-60s，室温下超声提取20-30min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蜂花粉与所述盐析剂的质量比为1:2；优选地，所述盐析剂包括MgSO₄和NaCl，所述MgSO₄和NaCl的质量比为4:1。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的条件为8000-10000r/min，离心5-10min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述净化柱为纳米复合材料材质的MPFC-QuEChERS高脂类超滤型净化柱。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过滤是通过微孔有机滤膜过滤的，优选地，所述微孔有机滤膜为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜。

8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪中的色谱条件为：色谱柱Agilent Infinity Poroshell120SB-C18柱，长度100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm；柱温40℃；流速：0.3mL/min；进样量5μL；流动相：0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸乙腈溶液。

9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪中的质谱条件为：离子化方式为电喷雾离子化正模式，多反应监测模式，雾化气流量3L/min，干燥气流量10L/min，加热气流量10L/min，接口温度300℃，接口电压4.0kV。

10.权利要求1-9任一项所述的检测方法在蜂花粉安全风险评估和筛查监测中的应用。

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