CN108107118A - 一种决明子药材中9种真菌毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种决明子药材中9种真菌毒素的检测方法，所述方法包括如下步骤：步骤1：标准品储备液的制备；步骤2：混合标准品储备液的制备；步骤3：标准工作溶液的制备；步骤4：供试品溶液的制备；步骤5：基质匹配标准溶液的制备；步骤6：测定。

Description

一种决明子药材中9种真菌毒素的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药材中真菌种类及含量的检测方法，具体涉及一种决明子药材中9种真菌毒素的检测方法。

背景技术

真菌毒素是由真菌在适宜的环境条件下产生具有毒性的次级代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族毒素、伏马毒素、黄绿毒素以及麦角生物碱等,这些真菌毒素可广泛污染农作物、植物及其副产品等。

常见真菌毒素的介绍如下：黄曲霉毒素，发现于1960年，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍，具有肝肾毒性、致畸、致突变、免疫抑制等作用，已被世界卫生组织的癌症研究机构划定为一类致癌物质；伏马毒素诱发人体食道癌、肝癌、胃癌的发生；3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇都属于单端孢霉烯族毒素，其毒性是恶心、呕吐等急性毒性、慢性毒性，致癌、致畸、致突变，免疫毒性，遗传和细胞毒性，影响人类消化和神经系统，导致多种地方病的发生。总而言之，真菌毒素是一类天然产生的生物毒素，从古至今一直对人类、动物和植物产生巨大的潜在威胁。目前已发现的真菌毒素有200多种，对人类危害大的真菌毒素有十几种，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。

中药作为治疗药物、膳食补充剂、免疫调节剂广泛使用。世界卫生组织的一项调查表明，世界范围内约70～80％的人口在一级疾病治疗中使用过传统药物，其中主要是中草药。就真菌毒素残留而言，对药材的研究远不及食品深入和广泛，主要表现为涉及的品种及真菌毒素种类少，研究缺乏系统性；研究多局限于黄曲霉毒素，对其它毒性强、污染频度高的毒素，如赭曲霉毒素、伏马毒素等较少涉及；需要检测的药材品种、真菌毒素种类不明确，无法制定相应的真菌毒素限度；一旦污染后也没有简便可行的脱毒措施。

欧洲药典(EP6.2)规定药材中黄曲霉毒素B1≤2μg/kg，总量≤4μg/kg；韩国食品医药品安全厅(KFDA)2008年起实施甘草、决明子、桃仁、半夏、柏子仁、槟榔、山赛仁、远志及红花真菌毒素限量标准，规定黄曲霉毒素B1不得过10μg/kg；我国《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》中规定中成药及药材中黄曲霉毒素Bl≤5μg·kg-1(暂定)；《中国药典》2005年版一部增补本已收载黄曲霉毒素测定法(HPLC-FLD)，2010年版规定陈皮、僵香、胖大海、酸枣仁、桃仁五种药材需要检测黄曲霉毒素，规定黄曲霉毒素B1不得过5μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量不得过10μg/kg。

决明子为种子类药材，是国家卫生部公布的药食同源的物质之一，具有较好的降血脂、降血压、抗氧化、清肝明目和润肠通便的功效。决明子在存储过程中最容易受到黄曲霉毒素的污染，但其他真菌毒素对决明子的污染现有文献中并没有报道。在《中国药典》2015年版中也仅仅记载了黄曲霉毒素的检测，并限定每1000g决明子中含黄曲霉毒素B₁，不得过5μg，黄曲霉毒素G₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素B₂和黄曲霉毒素B₁总量不得过10μg，现有方法仅检测了黄曲霉毒素相关的毒素，并没有检测其他真菌毒素。因此毒素的控制对于完善中药材质量标准、保证中药材安全具有重要作用。

目前，真菌毒素的检测方法有薄层色谱法、酶联免疫测定法(ELISA)、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法等。其中：薄层色谱法，用于初步筛选，现已很少使用；ELISA法，适合大批样品检测；胶体金免疫层析方法，适合单个或少数样品即时检测；高效液相色谱法，测定结果易出现假阳性；液相色谱质谱联用法选择性好，操作简单，省时，尤其是三重四极杆线性离子阱质量分析器，既能获得化合物的MRM信息，又能通过MRM-IDA-EPI扫描模式获得化合物二级质谱碎片的全部信息，结合谱库检索能够实现对未知化合物的同时定性和定量分析，还能有效排除假阳性结果，是多种真菌毒素检测的有力手段。

因此，有必要寻找一种适合检测决明子中多种真菌毒素的方法。

发明内容

本发明提供一种检测决明子中9种真菌毒素的方法，该方法采用的是液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱法(UFLC-MS/MS)检测。

所述9种真菌霉素为黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇。

所述检测方法包括如下步骤：

步骤1：标准品储备液的制备，将9种真菌毒素对照品用乙腈作为溶剂分别配制成标准储备液；

步骤2：混合标准品储备液的制备：取步骤1所得各标准储备液，用乙腈作为溶剂配制成混合在一起的混合标准品储备液；

步骤3：标准工作溶液的制备，将混合标准储备液用乙腈作为溶剂稀释成不同浓度的标准工作溶液；

步骤4：供试品溶液的制备，将决明子用溶剂提取，提取液过免疫亲和柱，用甲醇洗脱，取洗脱液配制成供试品溶液；

步骤5：基质匹配标准溶液的制备，将不含9种真菌毒素的决明子按步骤4供试品溶液制备方法制备不含9种真菌毒素的空白基质溶液，并将该溶液照步骤3的标准工作溶液的制备配制成基质匹配标准溶液；

步骤6：测定：在获得9种真菌毒素的标准曲线以及基质匹配溶液标准曲线后，将供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，按外标法根据基质匹配标准曲线确定和计算供试品溶液中9种真菌毒素的种类和含量。

优选地，所述步骤1：标准品储备液的制备为：分别取各固体真菌毒素标准品适量，加乙腈分别制成质量浓度为180-240μg/mL的标准品储备液，储存于-20℃冰箱中；

进一步优选，所述步骤1：标准品储备液的制备为：分别取各固体真菌毒素标准品适量，加乙腈分别制成质量浓度为200μg/mL的标准品储备液，储存于-20℃冰箱中；

优选地，所述步骤2：混合标准品储备液的制备为：精密量取各标准品储备液适量，加乙腈稀释，制得混合储备液，混合储备液中各成分的浓度为：黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂质量浓度分别为1μg/mL；伏马毒素B1、伏马毒素B₂、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇质量浓度分别为10μg/mL，于-20℃冰箱中保存；

优选地，所述步骤3：标准工作溶液的制备为：准确吸取混合储备液系列体积，乙腈定容至2mL，制成系列质量浓度的标准工作溶液。

优选地，所述步骤4：供试品溶液的制备为：取决明子粉末1.0g，精密称定，加PBS溶液3-7mL浸泡20-40min，加含3-7％甲酸的乙腈溶液2.0-3.0mL，涡旋1.5-3min，加无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠合计2.75-4.25g，涡旋1min，以10000r/min的速度离心2-4min，取上清1.5mL用含3-7％甲酸的乙腈溶液定容至15-25mL，以10000r/min的速度离心2-4min，得上清液，将上清液按照与免疫亲和柱比例为10-25：1转移至免疫亲和柱中，3-7mL 0.2％吐温-PBS溶液、3-7mL水溶液依次淋洗小柱，3-7mL甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹至近干，50％乙腈定容至2mL，得供试品溶液；

进一步优选，所述步骤4：供试品溶液的制备为：取决明子粉末1.0g，精密称定，加PBS溶液5mL浸泡30min，加含5％甲酸的乙腈溶液2.5mL，涡旋2min，加无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠合计3.75g，涡旋1min，以10000r/min的速度离心3min，取上清1.5mL用含5％甲酸的乙腈溶液定容至20mL，以10000r/min的速度离心3min，得上清液，将上清液按照与免疫亲和柱比例为20：1转移至免疫亲和柱中，5mL 0.2％吐温-PBS溶液、5mL水溶液依次淋洗小柱，5mL甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹至近干，50％乙腈定容至2mL，得供试品溶液；

上述供试品溶液的制备中：无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠的重量比为1-3：1：0.25-0.75：0.1-0.3，优选为2：1：0.5：0.25。

优选地，所述步骤5：基质匹配标准溶液的制备为：按供试品溶液制备方法制备不含目标化合物的空白基质溶液，将获得的提取液作为稀释溶剂，照上述“标准工作溶液”同法配制基质匹配标准溶液；

步骤6:测定：将制备好的供试品溶液按如下所述色谱质谱条件进行测定，含量按外标法进行计算。

所述的色谱质谱条件如下：

正离子模式：

色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2.0-5.0μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％(v/v)甲酸水；梯度洗脱程序：0～8.0min，27％A～77％A；8.0～9.0min，77％A～100％A；9.0～10min，100％A～27％A。

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子化电压(IS)：5500V；雾化温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35L/min；喷雾气(Gas1)：55L/min；辅助加热气(Gas2)：55L/min；碰撞气压力(CAD)：medium。

负离子模式：

色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2.0-5.0μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％(v/v)氨水；梯度洗脱程序：0～8.0min，5％A～50％A；8.0～9.0min，50％A～100％A；9.0～10min，100％A～5％A。

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子化电压(IS)：-4500V；雾化温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；喷雾气(Gas1)：55psi；辅助加热气(Gas2)：55psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

上述方法中：

如无特殊说明，所述乙腈为纯溶剂；

所述净化是指过免疫亲和小柱净化；

免疫亲和小柱优选为真菌毒素6合1免疫亲和柱，可以选Myco6in1^TM-IAC柱(美国VICAM公司)；

所述C18柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱。

PBS液配制方法：称取8.00g氯化钠，2.92g磷酸氢二钠，0.20g磷酸二氢钾，0.20g氯化钾于1000mL烧杯中，用900mL超纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.4，最后用超纯水稀释至1000mL，即得PBS缓冲溶液。

本发明具有以下有益效果：

1、真菌毒素检测为一种痕量分析，其前处理方法非常重要，真菌毒素在不同基质样品之间存在着很大的差异，因此，针对不同样品都必须采用不同的前处理方法。样品净化处理是测定真菌毒素的难点所在。常用的净化方法有机溶剂萃取法，固相萃取柱(SPE)法，QuEChERS法、免疫亲和柱法等。其中：有机溶剂萃取法，存在过程复杂、毒性大等缺点，QuEChERS法虽操作简单，但净化效果不理想。与上述前处理方法相比，免疫亲和柱法利用其抗原抗体特异性结合的优势极大地提高了试样的净化效率，且减少了有毒有害试剂的使用，是中药中真菌毒素净化的最佳选择，且多功能免疫亲和柱可以实现多种真菌毒素的同时富集净化。故本发明采用免疫亲和柱法来测定决明子中9种真菌毒素的残留量。使用免疫亲和柱净化的前处理方法，利用抗原抗体特异性可逆结合的特点，从复杂的待测样品中提取目标化合物，选择性高，去除基质更为干净。

LC-MS/MS法测定真菌毒素含量时，在MRM-IDA-EPI模式下进行扫描，得到的谱图和谱库中的EPI图谱对比，在准确定量的同时，又能确证真菌毒素的存在，排除假阳性的可能。

2、液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱法检测虽然已经广泛的应用到各个领域，但是应用到中药领域时，不能确定这种方法能去除掉其他中药材中的干扰测定的成分。但是决明子基质复杂，含有蒽醌类，脂肪酸类，氨基酸和无机盐等多种化学成分，因此，发明人通过现有技术得知可以考虑采液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱法检测方法进行检测。

3、与现有技术比较，以文献1(葛宝坤等.免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定中药材中的14种真菌毒素[J].色谱,2011,29(06):495-500)为例：

1)针对的对象：文献1针对的是所有中药，没有特别指出是那个中药成分。

2)样品的提取方式：文献1将决明子用PBS和甲醇依次浸泡，且通过实验证实了PBS和甲醇一次提取提高了生物毒素的回收率。

本发明是将决明子用PBS溶液浸泡，然后加含甲酸的乙腈溶液涡旋，再加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠涡旋。在CN201410417728.4(公开号为CN104133023A)公开了一种利用合相色谱同时检测羊草中四溴菊酯及溴氰菊酯的分析方法，该方法也是用乙腈配合硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠提取，但是没有涉及真菌毒素或决明子的相关内容，本领域技术人员无从得知该方法是否可以用于本发明。本发明在用含甲酸的乙腈提取后，加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠属于盐析的步骤，因为溶液提取后，提取液中还存在大量的共萃取化合物，通过盐析，可以起到净化的作用，硫酸镁-柠檬酸盐缓冲体系，对真菌毒素的回收率影响小，适合真菌毒素。

发明人采用文献1的方法检测本发明决明子中9种真菌毒素，真菌毒素的回收率不合格，且峰出现分叉了(原因是文献1的流动相用了甲醇)，影响结果的判断。

4、本发明建立了超快速液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱法(UFLC-QTRAP-MS)，测定决明子中9种真菌毒素(B₁、B₂、G₁、G₂，伏马毒素B₁、B₂，3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇，呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇，雪腐镰刀菌烯醇)的残留量。试样经PBS溶液和5％甲酸乙腈溶液提取，免疫亲和柱净化后，经ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)梯度洗脱分离，以多级反应监测-信息相关采集-增强子离子扫描方式(MRM-IDA-EPI)，结合建立的9种真菌毒素的标准谱库检索的多模式进行同时定性及定量分析。结果表明，9种真菌毒素的检测限(LOQs)为0.3～1.5μg/kg，定量限(LODs)为0.8～3.5μg/kg，线性范围内线性关系良好，相关系数(r²)均大于0.993，在三个不同添加水平下，平均回收率在64.4％～119.9％之间，相对标准偏差(RSD)在1.8％～11.0％之间。该方法操作简便，准确可靠，适用于决明子中9种真菌毒素的检测分析。

附图说明

图1：9种真菌毒素混合对照品的提取离子流色谱图；

图2：9种真菌毒素的基质效应；

图3：检出AFB₂的决明子样品和标准溶液的EPI谱图比对，其中A为标准溶液的EPI谱图，B为决明子样品的EPI谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

仪器、试剂与材料

QTRAP 5500质谱仪，配有电喷雾离子源、三重四极杆-线性离子阱质量分析器及Analyst 1.6.2工作站(美国AB SCIEX公司)；

LC-30AD UFLC液相色谱系统(日本岛津公司)；

CF16RN型高速微量离心机(日本HITACHI公司)；XS105型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

乙腈(LC-MS级，美国Omni Chem公司)；

甲醇(LC-MS级，美国Omni Chem公司)；

甲酸(质谱级，Sigma-Aldrich)；

冰醋酸(色谱纯，天津威晨化学试剂科贸有限公司)；

无水硫酸镁(优级纯，Sigma-Aldrich)；

柠檬酸氢二钠水合物(99％，Aladdin)；

无水柠檬酸三钠(99％，Alfa Aesar)；

氯化钠(分析纯，天津威晨化学试剂科贸有限公司)；

真菌毒素6合1免疫亲和柱(Myco6in1^TM-IAC柱，美国VICAM公司)；

实验为用水Milli-Q纯水系统制超纯水。

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、黄曲霉毒素B₂(AFB₂)、黄曲霉毒素G₁(AFG₁)、黄曲霉毒素G₂(AFG₂)、伏马毒素B₁(FB₁)、伏马毒素B₂(FB₂)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)(纯度≥98％，美国Sigma-Aldrich公司)。

实施例1：检测决明子中9种真菌毒素的方法

1、正离子模式：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：3.5μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％(v/v)甲酸水；梯度洗脱程序：0～8.0min，27％A～77％A；8.0～9.0min，77％A～100％A；9.0～10min，100％A～27％A。

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子化电压(IS)：5500V；雾化温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35L/min；喷雾气(Gas1)：55L/min；辅助加热气(Gas2)：55L/min；碰撞气压力(CAD)：medium。

负离子模式：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2.0-5.0μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％(v/v)氨水；梯度洗脱程序：0～8.0min，5％A～50％A；8.0～9.0min，50％A～100％A；9.0～10min，100％A～5％A。

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子化电压(IS)：-4500V；雾化温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；喷雾气(Gas1)：55psi；辅助加热气(Gas2)：55psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

2、各液体的配制

步骤1：标准品储备液的制备

分别取各固体真菌毒素标准品适量置各自量瓶中，加乙腈分别制成质量浓度为200μg/mL的标准品储备液，储存于-20℃冰箱中。

步骤2：混合标准品储备液的制备

精密量取各标准品储备液适量，置同一量瓶中，加乙腈稀释至刻度，制得混合储备液，黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂质量浓度为1μg/mL；伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇质量浓度为10μg/mL，于-20℃冰箱中保存。

步骤3：标准工作溶液的制备

准确吸取混合储备液系列体积，分置2mL量瓶中，乙腈定容至刻度，制成系列质量浓度的标准工作溶液。

步骤4：供试品溶液的制备

取决明子粉末1.0g，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加PBS溶液5mL浸泡30min，加5％甲酸乙腈溶液2.5mL，涡旋2min，加无水硫酸镁2g，氯化钠1g，柠檬酸三钠0.5g和柠檬酸氢二钠0.25g，涡旋1min，以10000r/min的速度离心3min，取上清1.5mL置20mL量瓶中，5％甲酸乙腈溶液定容，全部转移至50mL聚丙烯塑料离心管中，以10000r/min的速度离心3min，得上清液，待净化。将上述待净化液转移至免疫亲和柱中，5mL 0.2％吐温-PBS溶液、5mL水溶液依次淋洗小柱，5mL甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹至近干，50％乙腈定容至2mL，得供试品溶液。

步骤5：基质匹配标准溶液的制备

按供试品溶液制备方法制备不含目标化合物的空白基质溶液，将获得的提取液作为稀释溶剂，照上述“标准工作溶液”同法配制基质匹配标准溶液。

3、检测法

将制备好的供试品溶液进行测定，含量按外标法计算。

实施例2：方法筛选

1、MRM-IDA-EPI方法及谱库建立

以MRM作为探测扫描，触发IDA工作。当MRM信号阈值大于IDA设定的1000cps时同时启动EPI扫描功能。EPI扫描范围为：250～800Da；扫描速率为：10000Da/s。对9种真菌毒素的混合标准溶液进行EPI扫描，化合物子离子的碰撞能量(Collision Energy Spread,CES)设为15V，在碰撞能量(Collision Energy,CE)分别为20，35，50V碰撞能量下各采集1张EPI谱图，平均后得到1张综合的EPI谱图，将各真菌毒素的EPI谱图输入数据库，同时填写各化合物的化学名称、相对分子量、分子式、化学结构及美国化学文摘(Chemical AbstractsService,CAS)登记号，建立9种真菌毒素的标准谱库。

2、色谱条件优化

参考以往的文献可知大部分实验都用的是甲醇-水和乙腈-水系统，发明人考察了甲醇-水，乙腈-水系统对9种真菌毒素的分离情况，发现：在甲醇-水系统中FB₁、FB₂及DON色谱峰分叉，分离效果差，而乙腈-水系统分离效果较好。本文进一步考察了流动相中不同添加剂(甲酸、氨水、甲酸铵和乙酸铵)对离子化效率的影响。结果表明，甲酸铵或乙酸铵抑制伏马毒素的质谱响应，而甲酸和氨水可分别增强正负离子化效果。故最终确定正离子模式为乙腈-0.1％甲酸水系统；负离子模式为乙腈-0.1％氨水系统。

3、UFLC-MS/MS条件优化

发明人考察了正、负离子模式下9种真菌毒素的响应情况。

AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、FB₁、FB₂正离子响应较好，DON、3-ADON和NIV负离子响应较好。采用MS-only模式，直接进样，对单一化合物逐个优化。首先进行Q1全扫，识别目标物的母离子，对该母离子做Q2扫描。每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，采用MRM扫描模式对每对离子对的各质谱参数进行优化，优化后的质谱参数见表1。

表1 9种真菌毒素的保留时间、定量及定性离子、质谱参数

*定量离子(quantitative ion)

三重四极杆质谱在MRM模式下通过离子对的丰度比来定性，MRM-IDA-EPI扫描模式可同时获得化合物的保留时间、峰面积及二级结构等信息，并可通过真菌毒素标准谱库的检索及二级结构信息快速确认化合物的结构，同MRM扫描方式相比，可更好的用于阳性样品中真菌毒素的确证，实现同时的定性定量分析。在MRM-IDA-EPI扫描模式下，9种真菌毒素的混合对照品溶液提取离子流色谱图如图1所示。

实施例3：方法学验证

1、线性

按实施例1中配制基质匹配标准工作溶液，经LC-MS/MS测定后，以各组分峰面积(y)对各组分质量浓度(x,μg/L)绘制标准曲线，结果见表2。

表2 9种真菌毒素的线性、检测限和定量限

表2结果表明：响应值和浓度之间均显示良好的线性关系，相关系数(r²)均大于0.993。

2、检测限和定量限

取标准曲线最低浓度点，用空白基质定量稀释后分析，以信噪比(S/N)≥10时的浓度为LOQ，信噪比(S/N)≥3时的浓度为LOD。测定结果见表2。

3、重复性和日间精密度

按实施例1所述方法制备加标水平为50μg/kg的供试品加标溶液6份，进样分析，记录峰面积，计算RSD值在3.7％～13.4％之间，表明方法重复性良好。

于不同日期分别取1.0g决明子样品，按同法制备6份供试品加标溶液，分别进样分析，记录峰面积，计算的RSD值均小于14.7％，表明方法的日间精密度良好。

4、加样回收试验

本文采用基质匹配标准曲线-外标法定量，在无真菌毒素残留的决明子空白基质中添加9种混合真菌毒素进行加样回收试验，加标水平分别为10、50和100μg/kg。3个添加水平下真菌毒素的平均回收率为64.6％～119.9％，RSD为1.8％～11.0％，回收率和重复性数据均满足对痕量分析方法学验证要求。表3为各个添加水平的回收率及其相对标准偏差(RSD)。

表3 9种真菌毒素的加标回收率

表3结果表明：建立的方法满足了方法学验证中回收率的要求。

5、基质效应

基质是样品中除被分析物以外的组分，常对分析物的分析有显著干扰，并且影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。基质效应在常量分析中并不显著，但在痕量残留分析中却极大的影响分析的准确度。用以补偿基质效应的方法有：基质净化法、同位素内标法、空白基质配制标准溶液和加入分析保护剂等。由于真菌毒素的极性差异大，内标法易造成结果偏差，故本文采用基质匹配标准溶液法对基质效应进行补偿。评价基质效应的公式如下：

当ME％的值大于或小于100％时，代表基质增强或者抑制作用，当ME％的值为100％时，表示不存在基质效应。9种真菌毒素的基质效应见图2。

实施例4：样品测定

按照实施例1的方法，对10批决明子药材进行测定。参考2015版中国药典四部9305中药中真菌毒素测定指导原则有关样品测定及结果判断的相关要求，即供试品色谱中如检出与对照品保留时间相同的色谱峰，供试品溶液的定性离子相对丰度比与浓度相当的对照品溶液的定性离子相对丰度比进行比较时，相对比例>50％，允许±20％偏差；相对比例20％～50％，允许±25％偏差，则可判定样品中存在该组分，结果见表4。

表4结果显示：对决明子样品进行结果分析，共检测10批样品，其中AFB₁检出1批，AFB₂检出3批，AFG₁检出4批，DON检出4批，其余均未检出；1批决明子的黄曲霉毒素检出残留量超出规定的真菌毒素的最大允许残留量(MRL)，为13.67μg/kg，其余均未超出限度。为进一步排除假阳性的可能，通过MRM-IDA-EPI模式扫描，比对EPI图谱，来确证真菌毒素的含量。

表4结果表明：所有检出真菌毒素的决明子样品均为阳性，排除了假阳性的可能。以检出的AFB2为例，其EPI图与谱库中标准谱图(图1的主要是用来进行定量计算，图3中的A是棒状图，定性更准确。)对比结果见图3。

表4 检测结果

注:"-"代表没有检测到

结论：采用本发明采用了免疫亲和柱净化的前处理方法，结合超快速液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱测定决明子中9种真菌毒素的残留量，通过MRM扫描和EPI标准谱库检索比对，实现了对9种真菌毒素同时定性、定量分析。该方法简便、准确、灵敏度高、实用性强，可用于决明子中9种真菌毒素残留量的同时测定。

Claims (10)

1.一种决明子药材中9种真菌毒素的检测方法，采用液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱法，所述9种真菌霉素为黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、伏马毒素B₁、伏马毒素B₂、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

步骤1：标准品储备液的制备，将9种真菌毒素对照品用乙腈作为溶剂分别配制成标准储备液；

步骤2：混合标准品储备液的制备：取步骤1所得各标准储备液，用乙腈作为溶剂配制成混合在一起的混合标准品储备液；

步骤3：标准工作溶液的制备，将混合标准储备液用乙腈作为溶剂稀释成不同浓度的标准工作溶液；

步骤4：供试品溶液的制备，将决明子用溶剂提取，提取液过免疫亲和柱，用甲醇洗脱，取洗脱液配制成供试品溶液；

步骤5：基质匹配标准溶液的制备，将不含9种真菌毒素的决明子按步骤4供试品溶液制备方法制备不含9种真菌毒素的空白基质溶液，并将该溶液照步骤3的标准工作溶液的制备配制成基质匹配标准溶液；

步骤6：测定：在获得9种真菌毒素的标准曲线以及基质匹配溶液标准曲线后，将供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，按外标法根据基质匹配标准曲线确定和计算供试品溶液中9种真菌毒素的种类和含量。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤1标准品储备液的制备，方法为：分别取各固体真菌毒素标准品适量，加乙腈分别制成质量浓度为180-240μg/mL的标准品储备液，储存于-20℃冰箱中；

优选地，所述步骤1标准品储备液的制备，方法为：分别取各固体真菌毒素标准品适量，加乙腈分别制成质量浓度为200μg/mL的标准品储备液，储存于-20℃冰箱中。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤2混合标准品储备液的制备，方法为：精密量取各标准品储备液适量，加乙腈稀释，制得混合储备液，混合储备液中各成分的浓度为：黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂质量浓度分别为1μg/mL；伏马毒素B1、伏马毒素B₂、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素/脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇质量浓度分别为10μg/mL，于-20℃冰箱中保存。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤3标准工作溶液的制备，方法为：准确吸取混合储备液系列体积，乙腈定容至2mL，制成系列质量浓度的标准工作溶液。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤4供试品溶液的制备，方法为：取决明子粉末1.0g，精密称定，加PBS溶液3-7mL浸泡20-40min，加含3-7％甲酸的乙腈溶液2.0-3.0mL，涡旋1.5-3min，加无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠合计2.75-4.25g，涡旋1min，以10000r/min的速度离心2-4min，取上清1.5mL用含3-7％甲酸的乙腈溶液定容至15-25mL，以10000r/min的速度离心2-4min，得上清液，将上清液按照与免疫亲和柱比例为10-25：1转移至免疫亲和柱中，3-7mL 0.2％吐温-PBS溶液、3-7mL水溶液依次淋洗小柱，3-7mL甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹至近干，50％乙腈定容至2mL，得供试品溶液。

7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤4供试品溶液的制备，方法为：取决明子粉末1.0g，精密称定，加PBS溶液5mL浸泡30min，加含5％甲酸的乙腈溶液2.5mL，涡旋2min，加无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠合计3.75g，涡旋1min，以10000r/min的速度离心3min，取上清1.5mL用含5％甲酸的乙腈溶液定容至20mL，以10000r/min的速度离心3min，得上清液，将上清液按照与免疫亲和柱比例为20：1转移至免疫亲和柱中，5mL 0.2％吐温-PBS溶液、5mL水溶液依次淋洗小柱，5mL甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹至近干，50％乙腈定容至2mL，得供试品溶液。

8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤4供试品溶液的制备中：无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠的重量比为1-3：1：0.25-0.75：0.1-0.3。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，其中，所述步骤4供试品溶液的制备中：无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠的重量比为2：1：0.5：0.25。

10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于，其中，所述的色谱质谱条件如下：

正离子模式：

色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2.0-5.0μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％(v/v)甲酸水；梯度洗脱程序：0～8.0min，27％A～77％A；8.0～9.0min，77％A～100％A；9.0～10min，100％A～27％A，

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子化电压(IS)：5500V；雾化温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35L/min；喷雾气(Gas1)：55L/min；辅助加热气(Gas2)：55L/min；碰撞气压力(CAD)：medium，

负离子模式：

色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2.0-5.0μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％(v/v)氨水；梯度洗脱程序：0～8.0min，5％A～50％A；8.0～9.0min，50％A～100％A；9.0～10min，100％A～5％A，

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；离子化电压(IS)：-4500V；雾化温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；喷雾气(Gas1)：55psi；辅助加热气(Gas2)：55psi；碰撞气压力(CAD)：medium。