CN109142584A - 一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法 - Google Patents

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施琦
王雅玲
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Abstract

本发明公开了一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，包括以下步骤，S1，取样；S2，提取；S3，定容；S4，净化。本发明利用液相色谱‑串联质谱法对虾饲料中的七种真菌毒素进行测定，各毒素浓度在试验浓度范围内线性良好，线性相关系数(r2)均大于0.99。在空白样本中添加高、中、低三个水平实验，回收率为87.5％～116.5％，精密度为2.4％～17.5％，各目标毒素回收率及精密度均满足检测要求。

Description

一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法
技术领域
本发明涉及真菌毒素的检测技术领域，尤其涉及一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法。
背景技术
真菌毒素是产毒真菌在生长过程中所产生的次级代谢产物，对人类和动物都有害，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1，脱氧雪腐镰孢菌烯醇，T-2毒素，HT-2毒素，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮是饲料中较常见的真菌毒素，现有的检测方法是用不同的检测方法检测几种真菌毒素，操作复杂，耗时长，为此我们设计出了一种同时测定虾饲料中的七种真菌毒素的方法来解决以上问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，包括以下步骤，
S1，取样：粉碎并精确的称取虾饲料样品2g，放入50ml的离心管中，并加入乙腈和水的混合液15ml、乙腈饱和正己烷10ml；
S2，提取：对S1中的材料进行涡旋振荡后，超声波处理20min, 并以4000r/min的速度离心10min；
S3，定容：取S2中振荡离心后的溶液的中间乙腈水层，重复提取2次后，合并提取液，旋转蒸发至近干，用含有5％乙酸的乙腈和水混合溶液，定容至5ml；
S4，净化：从S3中定容后的溶液中，取750μL，并用MycoSpinTM 400多毒素净化柱净化，收集滤出液，利用液相色谱-串联质谱法进行检测。
优选的，所述S1中乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为4:1。
优选的，所述S3中乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为1:1。
优选的，所述S4中检测的质谱条件为：ESI+和ESI-；选择反应监测扫描(SRM)，4000V喷雾电压、35au鞘气压力、15au辅助气压、 350℃毛细管温度、1.5mTorr碰撞压，并选择二级质谱中响应值较高的两个子离子作为定性定量离子。
优选的，所述色谱条件为：色谱柱Hypersil Gold(150mm× 2.1mm,5μm)；流速250μL/min、进样量10μL；针头到瓶底距离 2.0mm；进样速度10.0μL/s、淋洗体积2500μL、淋洗速度100.00 μL/s、冲洗体积2500μL，流动相：A为甲醇、B为水，且水中含0.03％氨水。
优选的，所述流动相的梯度洗脱条件为：0min～1min 5％A；1min～ 4min 5％～95％A；4min～7min 95％A；7min～7.1min 95％～5％A； 7.1min～12min 5％A。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
利用液相色谱-串联质谱法对虾饲料中的七种真菌毒素同时进行测定，各毒素浓度在试验浓度范围内线性良好，线性相关系数(r2)均大于0.99。在空白样本中添加高、中、低三个水平实验，各目标毒素回收率高，精密度好，回收率达87.5％～116.5％，精密度为2.4％～ 17.5％。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，包括以下步骤，
S1，取样：粉碎并精确的称取虾饲料样品2g，放入50ml的离心管中，并加入乙腈和水的混合液15ml、乙腈饱和正己烷10ml；
S2，提取：对S1中的材料进行涡旋振荡后，超声波处理20min, 并以4000r/min的速度离心10min；
S3，定容：取S2中振荡离心后的溶液的中间乙腈水层，重复提取2次后，合并提取液，旋转蒸发至近干，用含有5％乙酸的乙腈和水混合溶液，定容至5ml；
S4，净化：从S3中定容后的溶液中，取750μL，并用MycoSpinTM 400多毒素净化柱净化，收集滤出液，利用液相色谱-串联质谱法进行检测。
值得说明的是，所述S1中乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为4:1。
值得说明的是，所述S3中乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为1:1。
值得说明的是，所述S4中检测的质谱条件为：ESI+和ESI-；选择反应监测扫描(SRM)，4000V喷雾电压、35au鞘气压力、15au辅助气压、350℃毛细管温度、1.5mTorr碰撞压，并选择二级质谱中响应值较高的两个子离子作为定性定量离子。反应监测模式下毒素质谱参数见下表：
值得说明的是，所述色谱条件为：色谱柱Hypersil Gold(150mm ×2.1mm,5μm)；流速250μL/min、进样量10μL；针头到瓶底距离 2.0mm；进样速度10.0μL/s、淋洗体积2500μL、淋洗速度100.00 μL/s、冲洗体积2500μL，流动相：A为甲醇、B为水，且水中含0.03％氨水。
值得说明的是，所述流动相的梯度洗脱条件为：0min～1min 5％A； 1min～4min5％～95％A；4min～7min 95％A；7min～7.1min 95％～5％A；7.1min～12min 5％A。
利用本方法优化条件下各毒素的检出限为1.82μg/kg～12.63μ g/kg。各毒素浓度在试验浓度范围内线性良好，线性相关系数(r2)均大于0.99。在空白样本中添加高、中、低三个水平实验，各目标毒素回收率为87.5％～116.5％，精密度为2.4％～17.5％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1，取样：粉碎并精确的称取虾饲料样品2g，放入50ml的离心管中，并加入乙腈和水的混合液15ml、乙腈饱和正己烷10ml；
S2，提取：对S1中的材料进行涡旋振荡后，超声波处理20min,并以4000r/min的速度离心10min；
S3，定容：取S2中振荡离心后的溶液的中间乙腈水层，重复提取2次后，合并提取液，旋转蒸发至近干，用含有5％乙酸的乙腈和水混合溶液，定容至5ml；
S4，净化：从S3中定容后的溶液中，取750μL，并用MycoSpinTM400多毒素净化柱净化，收集滤出液，利用液相色谱-串联质谱法进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，其特征在于，所述S1中乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为4:1。
3.根据权利要求1所述的一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，其特征在于，所述S3中乙腈和水的混合液，乙腈和水的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，其特征在于，所述S4中检测的质谱条件为：ESI+和ESI-；选择反应监测扫描(SRM)，4000V喷雾电压、35au鞘气压力、15au辅助气压、350℃毛细管温度、1.5mTorr碰撞压，并选择二级质谱中响应值较高的两个子离子作为定性定量离子。
5.根据权利要求1所述的一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱Hypersil Gold(150mm×2.1mm,5μm)；流速250μL/min、进样量10μL；针头到瓶底距离2.0mm；进样速度10.0μL/s、淋洗体积2500μL、淋洗速度100.00μL/s、冲洗体积2500μL，流动相：A为甲醇、B为水，且水中含0.03％氨水。
6.根据权利要求5所述的一种测定虾饲料中的真菌毒素的方法，其特征在于，所述流动相的梯度洗脱条件为：0min～1min 5％A；1min～4min 5％～95％A；4min～7min 95％A；7min～7.1min 95％～5％A；7.1min～12min 5％A。
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