CN106526041A

CN106526041A - 一种多种霉菌毒素同时检测方法

Info

Publication number: CN106526041A
Application number: CN201611103951.7A
Authority: CN
Inventors: 杨敏; 周合; 张根义; 张进; 周朱晨; 胡彬; 吴念绮
Original assignee: 100 Olson Jiangsu Food Safety Technology Co Ltd
Current assignee: 100 Olson Jiangsu Food Safety Technology Co Ltd
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2017-03-22

Abstract

本发明公开了一种多种霉菌毒素同时检测方法，该方法包括以下步骤：（1）对样品进行提取，先后用含酸的不同浓度的乙腈‑水溶液对样品分三次进行振荡提取、离心，合并三次提取液，得样品提取液；（2）对样品提取液进行盐析、除脂，在所述样品提取液中加入甲醇和0.2%氨水进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂。本发明能同时检测多种霉菌毒素，完善了食品的安全监控的手段，避免消费者的健康受到损害。

Description

一种多种霉菌毒素同时检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体是一种多种霉菌毒素同时检测方法。

背景技术

霉菌毒素是由产毒霉菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，从古至今一直对人类、动物和植物具有巨大的潜在威胁。1960年，英国发生了10万多只火鸡中毒死亡事件，研究发现，饲料中有从巴西进口的霉变的花生饼粉，用这种花生饼粉喂养大白鼠能诱发肝癌，诱发肝癌的物质被证实为黄曲霉的代谢产物，命名为黄曲霉毒素（Aflatoxins）。随后引发了科技界对霉菌毒素广泛、系统的研究。霉菌毒素目前已发现有200多种，对人类危害大的霉菌毒素有十几种，一般由青霉属、曲霉属以及镰刀菌属的霉菌产生，具有毒性强和污染频率高的特点，其中包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、杂色曲霉毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮、串珠镰刀菌素、T-2毒素、HT-2毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、二乙酸镳草镰刀菌烯醇等。

由于霉菌毒素的低浓度高危害性，目前全世界很多国家都对霉菌毒素规定了其在食品中的残留限量。我国国家标准（GB2761-2011）规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、展青霉素、玉米赤霉烯酮、脱氧镰刀雪腐菌烯醇等6类霉菌毒素的限量，限量范围从0.5ug/kg到1000ug/kg不等。

目前常用的针对食品中霉菌毒素残留量的检测技术主要有酶联免疫试剂盒（ELISA）、薄层色谱（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）以及超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）等。酶联免疫法原理是利用抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测；薄层色谱法是根据与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，进行含量测定的方法，这两者均为半定量方法，多用于一种或少数几种毒素的初步筛查；高效液相色谱法是采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析，此法定量准确，但对于同时检测多组分的霉菌毒素，以及对样品基质净化不完全时，目标化合物在色谱柱上无法实现基线分离，无法对目标化合物进行准确定量。超高效液相色谱串联质谱是在色谱分离的基础上，利用质谱的高灵敏性和高选择性对化合物进行定性和定量检测，结果更加准确。

随着仪器检测技术的发展，前处理净化技术也在不断更新，目前受到广泛研究的集中在免疫亲和（Immunoaffinity）、固相萃取（SolidPhaseExtraction）以及分散固相萃取（QuEChERS）方法。免疫亲和层析技术是以抗原抗体中的一方作为配基亲和吸附另一方的分离系统，用此技术对样品进行前处理，专一性强，样品净化程度高，但目前研制出的免疫亲和抗体种类较少，除少数几种化合物（黄曲霉毒素类）无法对多组分化合物同时进行净化，且成本高，目前有免疫亲和抗体的毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素等少数几种毒素；固相萃取技术是基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程，此技术选择性吸附和净化程度不如免疫亲和技术，可用于一种或几种结构相似毒素的同时净化，但无法对复杂基质中多种毒素进行同时进行吸附和净化，常用于食品中伏马霉素、黄曲霉毒素B1以及赭曲霉素A检测的前处理。分散固相萃取方法（QuEChERS）是由英文快速（Quick）、简便（Easy）、低廉（Cheap）、高效（Effective）、耐用（Rugged）以及安全（Safe）的首字母缩写，此技术由提取，盐析、净化、浓缩等及步骤组成，最先由美国科学家发明，用于多农药残留的检测，后扩大应用于兽药残留以及生物毒素检测的前处理。该方法的优点正如所组成的缩写词一样，灵活性强，可以进行改进后对不同结构极性的多种毒素进行同时提取和净化。用现有技术方法无法全部检测多种霉菌毒素，且目前尚未有同时检测多种霉菌毒素的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多种霉菌毒素同时检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种多种霉菌毒素同时检测方法，该方法包括以下步骤：（1）对样品进行提取，先后用含酸的不同浓度的乙腈-水溶液对样品分三次进行振荡提取、离心，合并三次提取液，得样品提取液；（2）对样品提取液进行盐析、除脂，在所述样品提取液中加入甲醇和0.2%氨水进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂；（3）对盐析、除脂后的样品进行净化、浓缩、复溶，将盐析、除脂后的样品离心，在所得的下层乙腈层加入100%甲醇旋涡振荡进行净化，离心，对所得上清液进行真空浓缩后，先用甲醇对残渣复溶，再用水对剩余的残渣复溶，合并两次复溶所得的复溶液，进行滤膜过滤，得样品分析液；（4）采用质谱仪对样品分析液进行定性定量检测。

作为本发明进一步的方案：在所述步骤（3）之前还能够将对盐析、除脂后的样品过固相萃取柱HLB柱进行纯化、浓缩。

作为本发明进一步的方案：将对盐析、除脂后的样品按照0.6-1.0mL/min的过柱速度过固相萃取柱HLB柱。

作为本发明进一步的方案：所述不同浓度的乙腈-水溶液为体积比为70-90：30-10的乙腈-水溶液、体积比为10-40：90-60的乙腈-水溶液和体积比为20-60：80-60的乙腈-水溶液。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤（2）中的盐析、除脂包括：在所述样品提取液中加入硫酸镁、氨水、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能同时检测多种霉菌毒素，完善了食品的安全监控的手段，避免消费者的健康受到损害。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明实施例中，一种多种霉菌毒素同时检测方法，该方法包括以下步骤：（1）对样品进行提取，先后用含酸的不同浓度的乙腈-水溶液对样品分三次进行振荡提取、离心，合并三次提取液，得样品提取液；（2）对样品提取液进行盐析、除脂，在所述样品提取液中加入甲醇和0.2%氨水进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂；（3）对盐析、除脂后的样品进行净化、浓缩、复溶，将盐析、除脂后的样品离心，在所得的下层乙腈层加入100%甲醇旋涡振荡进行净化，离心，对所得上清液进行真空浓缩后，先用甲醇对残渣复溶，再用水对剩余的残渣复溶，合并两次复溶所得的复溶液，进行滤膜过滤，得样品分析液；（4）采用质谱仪对样品分析液进行定性定量检测。在所述步骤（3）之前还能够将对盐析、除脂后的样品过固相萃取柱HLB柱进行纯化、浓缩。将对盐析、除脂后的样品按照0.6-1.0mL/min的过柱速度过固相萃取柱HLB柱。所述不同浓度的乙腈-水溶液为体积比为70-90：30-10的乙腈-水溶液、体积比为10-40：90-60的乙腈-水溶液和体积比为20-60：80-60的乙腈-水溶液。所述步骤（2）中的盐析、除脂包括：在所述样品提取液中加入硫酸镁、氨水、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂。

实施例1

（1）称量2.5g待测样品，先用20ml含0.1%（体积比）甲酸的80%（体积比）的乙腈-水溶液对样品进行振荡提取30min、离心，得提取液1，再对提取后的剩余物用5ml含0.1%（体积比）甲酸的20%（体积比）的乙腈-水溶液进行振荡提取30min、离心，得提取液2，合并所述提取液1和所述提取液2，得样品提取液；（2）在所述样品提取液中加入1.0g柠檬酸钠、4.0g硫酸镁、1.0g氨水、0.5g柠檬酸氢二钠进行盐析，离心后转移上清液，向其中加入20mL正己烷，旋涡振荡1min除去脂肪；（3）将盐析、除脂后的样品离心，转移下层乙腈层至离心管中，加入150mg甲醇和50mg 0.2%氨水硫酸镁后旋涡振荡进行净化，离心，用5mL乙腈洗涤，离心，合并所述净化、所述洗涤两次离心后的上清液，进行真空浓缩；先用1.5mL甲醇复溶残渣，再用大于等于1mL的水复溶残渣，合并两次复溶所得的复溶液，用0.22um滤膜进行过滤后得样品分析液；（4）利用超高效液相色谱串联质谱方法检测样品分析液中的多种霉菌毒素。优选所述步骤（4）的高效液相色谱条件为：流动相A为含0.1%甲酸的甲醇，流动相B为含0.1%甲酸的水，流动相A和流动相B的体积比为：70-20:30-80，梯度洗脱，或者流动相A为甲醇，流动相B为水，流动相A和流动相B的体积比为：90-10:10-90，梯度洗脱；色谱柱以十八烷基硅烷建和硅胶为填料。进一步优选所述步骤（4）的质谱条件为：采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式（ESI+）和负离子模式（ESI-）进行扫描后，利用多反应监测模式（MRM）检测。

还能够将对盐析、除脂后的样品过固相萃取柱HLB柱进行纯化、浓缩。将对盐析、除脂后的样品按照0.6-1.0mL/min的过柱速度过固相萃取柱HLB柱。所述不同浓度的乙腈-水溶液为体积比为70-90：30-10的乙腈-水溶液、体积比为10-40：90-60的乙腈-水溶液和体积比为20-60：80-60的乙腈-水溶液。所述盐析、除脂包括：在所述样品提取液中加入硫酸镁、氨水、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂。

所述的流动相为含0.1%甲酸的甲醇和含0.1%甲酸的水时，所对应的电离模式为正离子模式；流动相为甲醇和水时，所对应的电离模式为负离子模式。在正离子模式下，样品中可检出的霉菌毒素包括：新茄病镰刀菌烯醇(NEO)、黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）、伏马毒素（FB1、FB2、FB3）、二乙酰蔗草镰刀菌烯醇(DAS)、杂色曲霉（ST）、HT2毒素（HT2）、胶霉毒素(GLT)、T2毒素（T2）、烟曲霉素(FUM)。

在负离子模式下，样品中可检出的霉菌毒素包括：疣孢漆斑菌原（VER）、赭曲霉素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧镰刀雪腐菌烯醇（DON）、镰刀菌烯酮（FUS-X）、去环氧-脱氧镰刀雪腐菌烯醇（DOM-1）、微囊藻毒素（PAX）、3-乙酰基脱氧镰刀雪腐菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰基脱氧镰刀雪腐菌烯醇（15-ADON）。

霉菌毒素采用多反应监控模式（MRM）对毒素进行定性和定量。根据欧盟关于分析方法要求的法令2002/657/EU，采用液相色谱质谱方法分析，必须达到4分的要求，本方法选择1个母离子（2分），2个子离子（1分）对目标化合物进行定性，满足了4分的要求。定量方式采用了基质曲线定量，每条曲线由5个点构成，线性相关系数（r2）大于0.995，满足了定量的要求。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种多种霉菌毒素同时检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）对样品进行提取，先后用含酸的不同浓度的乙腈-水溶液对样品分三次进行振荡提取、离心，合并三次提取液，得样品提取液；（2）对样品提取液进行盐析、除脂，在所述样品提取液中加入甲醇和0.2%氨水进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂；（3）对盐析、除脂后的样品进行净化、浓缩、复溶，将盐析、除脂后的样品离心，在所得的下层乙腈层加入100%甲醇旋涡振荡进行净化，离心，对所得上清液进行真空浓缩后，先用甲醇对残渣复溶，再用水对剩余的残渣复溶，合并两次复溶所得的复溶液，进行滤膜过滤，得样品分析液；（4）采用质谱仪对样品分析液进行定性定量检测。

2.根据权利要求1所述的多种霉菌毒素同时检测方法，其特征在于，在所述步骤（3）之前还能够将对盐析、除脂后的样品过固相萃取柱HLB柱进行纯化、浓缩。

3.根据权利要求2所述的多种霉菌毒素同时检测方法，其特征在于，将对盐析、除脂后的样品按照0.6-1.0mL/min的过柱速度过固相萃取柱HLB柱。

4.根据权利要求1所述的多种霉菌毒素同时检测方法，其特征在于，所述不同浓度的乙腈-水溶液为体积比为70-90：30-10的乙腈-水溶液、体积比为10-40：90-60的乙腈-水溶液和体积比为20-60：80-60的乙腈-水溶液。

5.根据权利要求1所述的多种霉菌毒素同时检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的盐析、除脂包括：在所述样品提取液中加入硫酸镁、氨水、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂。