CN116165302A - 食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品分析检测领域，提供一种食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，该方法将新鲜食用菌样品烘干、研磨成粉末，取干燥粉末加入含有甲酸的甲醇水溶液混匀后超声提取，离心分离、取上清液；离心分离的残渣加入与第一次等量的含有甲酸的甲醇水溶液混匀后超声提取，离心分离、取上清液，合并上清液作为样品提取液；预先分别用甲醇、超纯水淋洗活化反相固相萃取柱，将所述样品提取液过所述反相固相萃取柱，用甲醇水溶液淋洗、洗脱，收集洗脱液，经微孔滤膜过滤后，进行HPLC‑MS/MS检测并定量分析，得到白僵菌素和恩镰孢菌素的含量。本发明首次建立了一种能够检测食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的高效液相色谱串联质谱法。

Description

食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法

技术领域

本发明属于食品分析检测领域，具体涉及食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法。

背景技术

食用菌是指一类能够形成肉质、胶质、膜质和木质等大型子实体或菌核类组织，可供人类食用或药用的蕈菌总称。常见的食用菌包括：平菇、金针菇、香菇和蛹虫草等。由于食用菌兼具植物性食物和动物性食物的营养优点，富含蛋白质和膳食纤维，同时低脂肪、低热量和低盐分。因此，食用菌也被公认为健康食品。食用菌不仅味道鲜美、风味独特、营养均衡，同时还具有药用保健功效，其市场前景十分广阔，消费需求也日益增加。我国作为食用菌生产、出口和消费大国，对食用菌的安全性十分重视。食用菌具有悠久的食用历史和广泛的消费人群，通常被认为是较为安全的。然而，随着相关研究的深入，常常出现新的食用菌安全问题，例如，食用菌的安全性主要受农药滥用和残留、重金属和添加剂污染、微生物和生物毒素侵染等影响。

食用菌的生产环境通常是密闭、潮湿和不见光的，较易受到微生物的侵染。当食用菌被微生物污染后，不仅会影响食用菌的感官品质，某些微生物在一定条件下产生的次级代谢产物，例如真菌毒素，被人体摄入后可能会产生慢性毒副作用。近年来，有研究发现在1种人工培养的药食两用菌—蝉花的培养物和活性部位中检出1种新兴镰刀菌毒素—白僵菌素(beauvericin，BEA)。该毒素是一种环状六酯肽类化合物，与恩镰孢菌素(enniatins，ENNs)具有相似的结构，均含有可变的羟基酸和N-甲基-氨基酸残基。BEA和ENNs具有离子载体抑制特性，可诱导DNA片段化和细胞凋亡，进而产生一定的毒性效应。因此，有必要对食用菌中可能存在的BEA和ENNs污染开展研究。然而，目前国内外暂无有关食用菌中BEA和ENNs的检测分析和协同污染的报道。

目前，检测食品中多组分真菌毒素采用高效液相色谱串联质谱法较为普遍。这是由于该方法既具有检出限低的优点，同时又能够做到精准定量。在小麦、燕麦、意大利面和面包等谷类食品中较易检出BEA和ENNs。文献报道的检测方法一般为液相色谱串联质谱法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)，样品大多经乙腈水溶液提取，过滤净化后在电喷雾电离正离子扫描模式下进行检测。该方法结合色谱对多组分目标物的高效分离能力和质谱对靶向检测物的精准定性优势，具有灵敏度高、特异性好等优点，广泛应用于食品中多种真菌毒素的检测分析。

但是，该方法也存在一定的局限性。例如，高效液相色谱串联质谱仪采用电喷雾电离方式不可避免地会存在基质效应，即来自食品样品的基质组分共流出物可引起目标检测物在仪器信号强度上的增强或抑制。因此，通过优化样品前处理方法来减少基质效应，可以大大提升检测水平。然而，针对不同的食品样品，其前处理方法和仪器条件不尽相同，这主要与检测对象的基质各不相同有关。一般情况下，HPLC-MS/MS的分析步骤为：对样品中的真菌毒素进行提取和净化，接着采用高效液相色谱串联质谱仪对真菌毒素进行定性和定量分析。【

J L，NIELSEN K F，RASMUSSEN P H，et al.Development of a LC-MS/MS method for the analysis of enniatins and beauvericin in whole fresh andensiled maize[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(21):10439-10443.】

对食品中的真菌毒素进行前处理一般先采用有机溶液进行提取，然后经固相萃取柱或免疫亲和柱进行富集和净化。但是，这两种分析柱适用于成分较为简单，基质干扰较少的样品。由于食用菌中富含维生素、蛋白质、多糖和膳食纤维等生物活性物质，且菌体含水量较大，因此对食用菌中真菌毒素的提取、富集和净化存在一定的难度，难以准确检测真菌毒素的实际含量。

目前国内外均无关于食用菌中BEA和ENNs的检测方法和联合污染的报道，因此，如何建立1种能够定量检测食用菌中BEA和ENNs的HPLC-MS/MS方法、填补技术空白，具有重要的研究意义。

发明内容

本发明提供一种食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，首次建立了一种能够检测食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的高效液相色谱串联质谱法。

本发明采用的技术方案的基本构思如下：

食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，包括如下步骤：

将新鲜食用菌样品烘干、研磨成粉末，取干燥粉末加入含有甲酸的甲醇水溶液混匀后超声提取，离心分离、取上清液；离心分离的残渣加入与第一次等量的含有甲酸的甲醇水溶液混匀后超声提取，离心分离、取上清液，合并上清液作为样品提取液；

预先分别用甲醇、超纯水淋洗活化反相固相萃取柱，将所述样品提取液过所述反相固相萃取柱，用甲醇水溶液淋洗、洗脱，收集洗脱液，经微孔滤膜过滤后，进行HPLC-MS/MS检测并定量分析，得到白僵菌素和恩镰孢菌素的含量。

作为一种案例，所述反相固相萃取柱为Oasis PRiME HLB反相固相萃取柱，优选1cc，30mg的规格。

作为一种案例，所述HPLC-MS/MS检测中色谱条件为：使用含C18填料的色谱柱，流动相分别为乙酸铵溶液和乙腈，流速为0.2～0.3mL/min，色谱柱温度为30～40℃、样品室温度为10～20℃，进样量为2～5μL；采用梯度洗脱的方式对目标分析物进行色谱分离；

质谱条件为：采用电喷雾电离的离子化方式，正离子扫描模式和多反应监测方式。

作为一种案例，所述定量分析的方法包括：在空白样品基质提取液中加入已知浓度的白僵菌素和恩镰孢菌素标准品，上机检测后分别得到各目标分析物的检测图谱，以白僵菌素和恩镰孢菌素加标后的浓度为横坐标，以检测图谱中对应的目标分析物的峰面积积分值为纵坐标，绘制不同目标分析物的空白基质加标工作曲线，所述工作曲线中各目标分析物在0～100μg/L的浓度范围内具有良好的线性关系；

用空白基质加标工作曲线对待测样品进行定量，样品上机检测后可由检测图谱得到峰面积积分值，对照相应的工作曲线获得待测样品中目标分析物的浓度；待测样品溶液中各目标分析物的峰面积积分值均应在相应工作曲线的线性范围内，若超过该线性范围，需用空白基质提取液稀释待测样品溶液，直到各目标分析物的峰面积积分值落在对应工作曲线的线性范围内。

作为一种案例，所述含有甲酸的甲醇水溶液由体积分数10％的甲酸水溶液与纯甲醇按照等体积混合而成。

作为一种案例，超声提取30min，以12000rpm转速在4℃下离心10min，取上清液。

作为一种案例，所述采用梯度洗脱的方式为：0～2min，100％A+0％B；3min，40％A+60％B；19min，30％A+70％B；21min，100％A+0％B，其中，A为2mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈。

作为一种案例，所述质谱条件中的离子源参数分别为：离子化电压5500v，去溶剂温度550℃，气帘气30psi，雾化气80psi，辅助加热气80psi，碰撞气设为medium。

作为一种案例，白僵菌素和恩镰孢菌素的含量按照下式进行计算：

其中，X为待测样品中白僵菌素或恩镰孢菌素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；C_x为由工作曲线计算得到的待测样品溶液中白僵菌素或恩镰孢菌素的浓度，单位为微克每升(μg/L)；V为进样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；m为待测样品的质量，单位为克(g)；1000为单位换算常数；f为待测样品的稀释倍数。

本发明和现有技术相比具有以下优点：

1、本发明首次建立了一种能够检测食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的高效液相色谱串联质谱法。另外，本发明方法的样品前处理操作简单便捷。

2、本发明方法采用新型的反相固相萃取吸附方式净化样品提取液，能够去除蛋白质、磷脂等95％以上的基质干扰物，使得样品提取液更洁净、基质效应更小，检测结果更准确、可靠。

3、本发明方法可以实现同时检测1种白僵菌素和4种恩镰孢菌素，且各目标分析物分离度较好、方法检测限较低、准确性较高。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1是香菇样品中白僵菌素和恩镰孢菌素的工作曲线；

其中，a:香菇样品中BEA的空白基质加标工作曲线；b:香菇样品中ENA的空白基质加标工作曲线；c:香菇样品中ENA₁的空白基质加标工作曲线；d:香菇样品中ENB的空白基质加标工作曲线；e:香菇样品中ENB₁的空白基质加标工作曲线。

图2是香菇样品HPLC-MS/MS多反应监测图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例中涉及的仪器设备主要包括：配备Exion LC^TM超高效液相色谱仪的QTRAP5500^TM质谱仪(美国AB Sciex公司)；粉碎机(美国Warning Commercial公司)；电子天平(梅特勒—托利多上海有限公司)；超声波清洗器(无锡超声电子设备厂)；小型离心机(美国Sigma公司)；大型冷冻高速离心机(美国Fisher Scientific公司)；自动涡旋混合器(德国IKA公司)；纯水仪(美国Millipore公司)；振荡器(德国IKA公司)。

本实施例中涉及的试剂主要包括：白僵菌素和恩镰孢菌素标准品均购自澳大利亚Bioaustralis公司；甲醇和乙腈均购自美国Fair Lawn公司；甲酸和乙酸铵均购自美国Sigma-Aldrich公司。

(1)样品前处理

将新鲜香菇样品烘干，研磨成粉末。称取干燥粉末0.25g，置于50mL离心管中，加入体积分数10％甲酸水溶液与纯甲醇等体积混合后的溶液4mL，涡旋混匀，超声提取30min，以12000rpm转速4℃离心10min，取上清液。残渣中加入体积分数10％甲酸水溶液与纯甲醇等体积混合后的溶液4mL，涡旋混匀，超声提取30min，以12000rpm转速4℃离心10min，合并上清液。

(2)净化

预先分别用2mL甲醇和2mL超纯水淋洗活化Oasis PRiME HLB反相固相萃取柱(1cc，30mg)，再将4mL样品提取液过柱，用1mL体积分数5％甲醇水溶液淋洗两次，最后用1mL甲醇洗脱。收集洗脱液，用0.22μm滤膜过滤后装瓶待测。

(3)HPLC-MS/MS检测

色谱条件：采用Waters UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)色谱柱；流动相分别为：流速设为0.20mL/min；柱温和样品室温度分别为35℃和15℃；进样量设为5μL；

采用梯度洗脱程序，具体为：0～2min，100％A+0％B；3min，40％A+60％B；19min，30％A+70％B；21min，100％A+0％B。

质谱条件：采用电喷雾电离的离子化方式，正离子扫描模式和多反应监测方式。离子源参数分别为：离子化电压5500v，去溶剂温度550℃，气帘气30psi，雾化气80psi，辅助加热气80psi，碰撞气设为medium。

白僵菌素和恩镰孢菌素标准品的保留时间和多反应监测参数详见表1。

表1

/>

注：*为定量子离子。

(4)定量分析

采用本方法第1～3步对香菇样品进行前处理、净化和HPLC-MS/MS检测，同时未检出BEA和ENNs特征性色谱峰的样品视为空白样品。

称取烘干后的空白香菇样品2.5～5.0g，按上述步骤1和步骤2进行样品前处理和净化，得到空白香菇样品提取液。加入5～20μL含有BEA和ENNs的混合标准储备液，配制成基质加标系列工作溶液，根据基质加标系列工作溶液绘制工作曲线，其中：

ENA的浓度为：0.005μg/L、0.015μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、5μg/L、15μg/L；

ENA₁和ENB的浓度均为：0.013μg/L、0.04μg/L、0.13μg/L、0.4μg/L、1.33μg/L、4.0μg/L、13.33μg/L和40μg/L；

ENB₁和BEA的浓度均为0.033μg/L、0.1μg/L、0.33μg/L、1.0μg/L、3.33μg/L、10.0μg/L、33.33μg/L和100μg/L。

将空白香菇样品基质加标系列工作溶液按照步骤3进行HPLC-MS/MS检测，分别得到5种目标分析物的色谱图和峰面积。分别以BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的浓度为横坐标，以BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的峰面积积分值为纵坐标，绘制香菇样品中BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的工作曲线，如图1所示。

同时，在0.25g空白香菇样品中加入10μL含有BEA和ENNs的混合标准储备液，使得空白香菇样品中BEA的浓度为200μg/kg，ENA的浓度为10μg/kg、ENA₁的浓度为80μg/kg、ENB的浓度为80μg/kg，ENB₁的浓度为200μg/kg，并设置3个平行样品，采用本方法第1～4步进行检测后用于计算空白香菇样品的加标回收率。将加标的空白香菇样品一天内检测分析6次，计算结果的相对标准偏差，用于评价本发明方法对香菇样品的精密度。将加标的空白香菇样品连续检测5天，计算结果的相对标准偏差，用于评价重复度。

此外，当阳性香菇样品在仪器上的信噪比为3:1时，对应的BEA和ENNs浓度即为本发明方法对香菇样品中BEA和ENNs的检测限；当阳性香菇样品在仪器上的信噪比为10:1时，对应的BEA和ENNs浓度即为本发明方法对香菇样品中BEA和ENNs的定量限。

将待测香菇样品按上述步骤1～2进行前处理和净化，得到的样品待测溶液按照步骤3进行上机检测，用对应的空白香菇样品基质加标工作曲线对样品待测溶液进行定量。香菇样品中BEA、ENA、ENA₁、ENB或ENB₁的含量按下式进行计算：

其中，X为香菇样品中BEA、ENA、ENA₁、ENB或ENB₁的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；C_x为由工作曲线计算得到的香菇样品溶液中BEA、ENA、ENA₁、ENB或ENB₁的浓度，单位为微克每升(μg/L)；V为进样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；m为香菇样品的质量，单位为克(g)；1000为单位换算常数；f为香菇样品的稀释倍数。

(5)检测结果

本发明方法对香菇样品中BEA和ENNs的平均加标回收率、精密度、重复度、检测限和定量限如表2所示。

表2香菇样品中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测结果

从上述结果可知，本发明方法对香菇样品的平均加标回收率在62.9％～91.3％之间，精密度和重复度均小于20％，检测限范围在0.2～5.5μg/kg之间，定量限范围为0.7～18.3μg/kg，可以满足香菇样品中白僵菌素和4种恩镰孢菌素的检测分析要求(EU Decision2002/657/EC.Commission Decision of12August 2002implementing Council Directive96/23/EC concerning the performance of analytical methods and theinterpretation of results,Off.J.Eur.Common.2001,L221,8-36.)。

对比例1

与实施例1的区别仅在于使用固相萃取柱Oasis HLB小柱(6cc,200mg)，其他分析步骤一致。

香菇样品中的各目标分析物的平均加标回收率为12.6％～41.3％，无法满足检测分析的要求。

对比例2

与实施例1的区别仅在于使用固相萃取柱Sep-Pak小柱(3mL,200mg)，其他分析步骤一致。

香菇样品中的各目标分析物的平均加标回收率为5.8％～36.2％，无法满足检测分析的要求。

由此可见，上述对比例没有采用本发明构思中的反相固相萃取柱，目标分析物的回收率均较低，达不到分析要求。

虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (9)

1.食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，包括如下步骤：

将新鲜食用菌样品烘干、研磨成粉末，取干燥粉末加入含有甲酸的甲醇水溶液混匀后超声提取，离心分离、取上清液；离心分离的残渣加入与第一次等量的含有甲酸的甲醇水溶液混匀后超声提取，离心分离、取上清液，合并上清液作为样品提取液；

预先分别用甲醇、超纯水淋洗活化反相固相萃取柱，将所述样品提取液过所述反相固相萃取柱，用甲醇水溶液淋洗、洗脱，收集洗脱液，经微孔滤膜过滤后，进行HPLC-MS/MS检测并进行定量分析，得到白僵菌素和恩镰孢菌素的含量。

2.根据权利要求1所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，所述反相固相萃取柱为Oasis PRiME HLB反相固相萃取柱，优选1cc，30mg的规格。

3.根据权利要求1所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS检测中色谱条件为：使用含C18填料的色谱柱，流动相分别为乙酸铵溶液和乙腈，流速为0.2～0.3mL/min，色谱柱温度为30～40℃、样品室温度为10～20℃，进样量为2～5μL；采用梯度洗脱的方式对目标分析物进行色谱分离；

质谱条件为：采用电喷雾电离的离子化方式，正离子扫描模式和多反应监测方式。

4.根据权利要求1所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，所述定量分析的方法包括：在空白样品基质提取液中加入已知浓度的白僵菌素和恩镰孢菌素标准品，上机检测后分别得到各目标分析物的检测图谱，以白僵菌素和恩镰孢菌素加标后的浓度为横坐标，以检测图谱中对应的目标分析物的峰面积积分值为纵坐标，绘制不同目标分析物的空白基质加标工作曲线，所述工作曲线中各目标分析物在0～100μg/L的浓度范围内具有良好的线性关系；

用空白基质加标工作曲线对待测样品进行定量，样品上机检测后可由检测图谱得到峰面积积分值，对照相应的工作曲线获得待测样品中目标分析物的浓度；待测样品溶液中各目标分析物的峰面积积分值均应在相应工作曲线的线性范围内，若超过该线性范围，需用空白基质提取液稀释待测样品溶液，直到各目标分析物的峰面积积分值落在对应工作曲线的线性范围内。

5.根据权利要求1所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，所述含有甲酸的甲醇水溶液由体积分数10％的甲酸水溶液与纯甲醇按照等体积混合而成。

6.根据权利要求1所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，超声提取30min，以12000rpm转速在4℃下离心10min，取上清液。

7.根据权利要求3所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，所述采用梯度洗脱的方式为：0～2min，100％A+0％B；3min，40％A+60％B；19min，30％A+70％B；21min，100％A+0％B，其中，A为2mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈。

8.根据权利要求3所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，所述质谱条件中的离子源参数分别为：离子化电压5500v，去溶剂温度550℃，气帘气30psi，雾化气80psi，辅助加热气80psi，碰撞气设为medium。

9.根据权利要求1所述的食用菌中白僵菌素和恩镰孢菌素的检测方法，其特征在于，白僵菌素和恩镰孢菌素的含量按照下式进行计算：

/>

其中，X为待测样品中白僵菌素或恩镰孢菌素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；C_x为由工作曲线计算得到的待测样品溶液中白僵菌素或恩镰孢菌素的浓度，单位为微克每升(μg/L)；V为进样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；m为待测样品的质量，单位为克(g)；1000为单位换算常数；f为待测样品的稀释倍数。

Images