CN111289637A - 一种检测苹果汁中展青霉素的方法 - Google Patents

一种检测苹果汁中展青霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于展青霉素检测技术领域，涉及一种检测苹果汁中展青霉素的方法。该方法包括以下步骤：将待测苹果汁与展青霉素同位素内标混匀，之后进行固液分离，得到含内标的澄清苹果汁；利用季胺类高分子固相萃取柱对含内标的澄清苹果汁进行前处理，得到待测样品；配制含有展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液；对待测样品以及不同浓度的展青霉素标准工作液进行UPLC‑ID‑MS/MS检测，得到待测样品以及不同浓度的展青霉素标准工作液对应的质谱图峰面积；制作标准曲线；根据标准曲线以及待测样品对应的质谱图峰面积，计算待测样品中展青霉素的含量，从而得到待测苹果汁中展青霉素的含量。该方法提高对苹果汁中的展青霉素检测的准确度和灵敏度。

Description

一种检测苹果汁中展青霉素的方法
技术领域
本发明属于展青霉素检测技术领域，更具体地，涉及一种检测苹果汁中展青霉素的方法。
背景技术
展青霉素是一种有毒的真菌代谢产物，由于其具有较强的亲电性质，可以与蛋白质等物质中亲核的巯基和氨基化合物发生作用，对人类的中枢神经系统、消化系统和泌尿系统造成不同程度的毒害影响，具有潜在的致畸、致癌、致突变、影响生育和免疫抑制毒性。苹果类食品尤其是苹果汁中展青霉素污染是个全球性问题，严重威胁人类健康。世界卫生组织和联合国粮食及农业组织将展青霉素的最大日均摄入量定为0.4μg/kg体重/天，我国GB 2761-2017国家标准中规定含有苹果组分的果汁中展青霉素的上限为50μg/L。
苹果汁的组分非常复杂，除了大量的水外，总固体组分主要包含糖、山梨醇、氨基酸、酚类和矿物质等。经统计分析，葡萄糖、果糖和蔗糖含量最高，约占固体物重量的85％。因此，展青霉素准确定量的首要问题就是降低各种糖对准确检测的干扰。
在所有对苹果汁的前处理方法当中，基于乙酸乙酯的液液萃取、QuEChERS萃取和固相萃取是最广泛使用的三种。基于乙酸乙酯的液液萃取方法是在苹果汁中展青霉素检测中常用的前处理方法，这个方法最大的问题就是展青霉素在Na2CO3溶液碱性条件中不稳定，因此，前处理步骤要越快越好以降低展青霉素损失。针对展青霉素的QuEChERS方法需要三步操作和多种化学试剂，步骤繁琐耗时。固相萃取方法因其具有的可选择的材料种类繁多和重复性好等诸多优势而日益引起重视。新型的高分子类固相萃取材料具有亲水浸润性好、吸附容量高、免溶剂活化等诸多优点而广泛应用。
苹果汁中展青霉素的检测方法很多，例如薄层色谱法TLC、毛细管电泳法CE、气相色谱质谱法GC-MS、高效液相色谱法HPLC-UV和液相色谱质谱法HPLC-MS等。薄层色谱法是早期的展青霉素检测方法，缺陷是灵敏度低、回收率低、基质干扰严重。毛细管电泳方法本身的重现性差，同时展青霉素呈电中性不太适合电场分离，所以实际应用很少。气相色谱质谱法中，展青霉素必须进行衍生化增加挥发性，但是苹果汁中残留的酚类化合物的活泼质子会干扰反应，降低衍生化效率。同时，衍生化步骤也让样品制备过程复杂，反应不充分也会导致额外的方法误差。高效液相色谱法的选择性差，在反相色谱中保留行为相似的物质，如5-羟甲基糠醛会引起很强的干扰。而液相色谱质谱联用方法，在方法灵敏度和重现性、目标离子的选择性方面更具优势，是目前展青霉素分析最强大的手段。有机同位素稀释质谱法采用与待测物具有相同分子结构的稳定同位素标记的有机物作为内标(即稀释剂)，通过分别对同位素丰度的精确质谱测量和加入稀释剂的准确称量，可以算出样品中展青霉素的绝对量。该方法具有高精度、高准确度、样品无需严格分离等优点，是一种公认的测量痕量有机物的基准方法，已广泛应用于食品安全领域。
因此，提供一种能快速、简便、准确测定苹果汁中展青霉素含量的方法，才能满足生活生产中对展青霉素检测的实际需求，有效保障食品安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测苹果汁中展青霉素的方法，以提高检测苹果汁中的展青霉素含量的准确度和灵敏度。
为了实现上述目的，本发明提供一种检测苹果汁中展青霉素的方法，该方法包括以下步骤：
将待测苹果汁与展青霉素同位素内标混匀，之后进行固液分离，得到含内标的澄清苹果汁；
利用季胺类高分子固相萃取柱对所述含内标的澄清苹果汁进行前处理，得到待测样品；
配制含有所述展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液；
对所述待测样品以及不同浓度的所述展青霉素标准工作液进行UPLC-ID-MS/MS检测，其中，液相色谱的检测条件包括：色谱柱的种类为C18，流动相中A相为水，B相为乙腈，流速为0.2-0.4mL/min；质谱采用电喷雾离子源负离子模式，所述质谱的检测条件包括：毛细管电压-2.5±0.25KV，锥孔电压为10±1V，源偏移电压30±3V，源温度150±15℃；脱溶剂温度400±40℃，锥孔气流150±15L/h，解吸附气流800±80L/h，碰撞气流速为0.05±0.005mL/min，碰撞能量为8±0.8，得到所述待测样品以及不同浓度的所述展青霉素标准工作液对应的质谱图；
根据不同浓度的所述展青霉素标准工作液对应的质谱图峰面积制作标准曲线；
根据所述标准曲线以及所述待测样品对应的质谱图峰面积，计算所述待测样品中展青霉素的含量，从而得到所述待测苹果汁中展青霉素的含量。
在本发明中，将待测苹果汁与展青霉素同位素内标混匀的操作为将展青霉素同位素内标加入待测苹果汁中，旋涡震荡混合，旋涡震荡的时间可以为5-15min，即可将二者混合均匀。固液分离，可以采用离心分离，具体为在5000-8000r/min，优选为6000r/min的条件下，离心5-10min，吸取离心后的上清液即得到含内标的澄清苹果汁。
在本发明中，所述利用季胺类高分子固相萃取柱对所述含内标的澄清苹果汁进行前处理，得到待测样品包括以下步骤：
对所述季胺类高分子固相萃取柱进行活化；
将所述含内标的澄清苹果汁加入到活化后的所述季胺类高分子固相萃取柱中，依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液；
利用氮气将所述洗脱液进行吹干，之后复溶，得到所述待测样品。
本发明对于含内标的澄清苹果汁进行前处理所使用的所述季胺类高分子固相萃取柱包括HyperSep Retain AX固相萃取柱、Cleanert PAX Bond固相萃取柱、Elut PlexaPAX固相萃取柱或Oasis MAX固相萃取柱，优选为HyperSep Retain AX固相萃取柱，更优选为150mg HyperSep Retain AX固相萃取柱。
进一步地，所述活化所使用的活化剂为甲醇和水；所述淋洗所使用的淋洗剂为0.1％体积分数的乙酸溶液和水；所述洗脱所使用的洗脱剂为甲醇；所述复溶所使用的溶剂为所述流动相。流动相为前述的A相与B相的混合溶液。
在本发明的一种优选实施方式中，所述液色谱柱为BEH C18，进一步为BEH C18，1.7μm粒径，1mm×50mm。
在本发明的一种优选实施方式中，液相色谱的检测条件还包括：所述A相与所述B相的体积比为95:5的等度洗脱。
在本发明的一种优选实施方式中，所述色谱柱的温度为30-40℃。
本发明在进行液相色谱检测时，所述液相色谱使用的超高效液相色谱仪为Waters公司生产的ACQUITY UPLC。
进一步地，超高效液相色谱仪的样品室温度为4-10℃。
进一步地，在液相色谱的检测过程中，进样量为3-5μL。
本发明的检测苹果汁中展青霉素的方法在进行质谱检测时，质谱仪为三重四极杆质谱仪；所述三重四极杆质谱仪的m/z 153>m/z 109通道为检测展青霉素的定量离子对，m/z 153>m/z 81为检测展青霉素的定性离子对；m/z 160>m/z 115为检测所述展青霉素同位素内标的定量离子对，而m/z 160>m/z 86为检测所述展青霉素同位素内标的定性离子对。
在本发明中，所述配制含有所述展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液包括以下步骤：
称取展青霉素标准品，溶于有机溶剂，例如乙腈，定容，制成具有已知浓度的标准储备液；
量取不同体积的标准储备液，并分别向其中加入等体积的所述展青霉素同位素内标，用有机溶剂，例如流动相定容，制成含有所述展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液。可知，每个展青霉素标准工作液中的所述展青霉素同位素内标的浓度是相同的。在含有所述展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液中，展青霉素的浓度可分别为：0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和400ng/mL，所述展青霉素同位素内标的浓度均为50ng/mL。因此，所述标准曲线的线性范围为1-400ng/mL，检出限为0.2ng/mL。由此可知，本发明的方法线性范围宽，检测灵敏度高。
本发明所使用的所述展青霉素同位素内标可以为13C-展青霉素或氘代展青霉素。
本发明提供的一种检测苹果汁中展青霉素的方法，通过同位素内标法对苹果汁中的展青霉素进行检测，准确对展青霉素定量，利用季胺类高分子固相萃取柱进行前处理，由于季胺基修饰的高分子萃取材料通过氢键和离子交换作用对有展青霉素具有很好的吸附效果，可以显著降低苹果汁中基质干扰。因此，有效降低高糖基体的干扰，为后续对待测样品进行UPLC-ID-MS/MS检测提供保障，对液相色谱的检测条件和质谱的检测条件进行优化，能够很好地保留展青霉素，有效分离杂质，提高对苹果汁中的展青霉素检测的准确度和灵敏度。
本发明提供的一种检测苹果汁中展青霉素的方法，利用HyperSep Retain AX固相萃取柱、Cleanert PAX Bond固相萃取柱、Elut Plexa PAX固相萃取柱或Oasis MAX固相萃取柱对苹果汁进行前处理，能够有效去除苹果汁中的糖类、有机酸和色素等基质的干扰，并且前处理操作简单方便，耗时短。
本发明提供的一种检测苹果汁中展青霉素的方法，优化了同位素内标的平衡条件，保证了待测样品中同位素稀释剂的均匀平衡，保证了展青霉素测定结果的有效性。
本发明使用BEH C18色谱柱进行分离，对展青霉素有很好的保留性，能够高效分离杂质，降低基质干扰，有利于准确定量。
本发明使用13C-展青霉素同位素内标，降低了基质干扰，基质效应值仅为101％，测量准确度高。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了本发明中的标准工作液的色谱图。
图2示出了本发明中的标准工作液中展青霉素的质谱图。
图3示出了待测样品的色谱图。
图4示出了待测样品中展青霉素的质谱图。
图5示出了实施例2与对比例1的色谱图的对比结果。
图6示出了实施例2与对比例2的色谱图的对比结果。
图7示出了实施例2与对比例3的色谱图的对比结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
本实施例提供一种检测苹果汁中展青霉素的方法。该方法包括以下步骤：
展青霉素同位素内标加入待测苹果汁中，旋涡震荡混合5-10min，之后在6000r/min的条件下，离心5-10min，吸取离心后的上清液即得到含内标的澄清苹果汁。
首先利用甲醇和水对HyperSep Retain AX固相萃取柱进行活化，再将含内标的澄清苹果汁加入活化后的HyperSep Retain AX固相萃取柱中，之后利用0.1％体积分数的乙酸水溶液和水进行淋洗，然后利用甲醇进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用氮气吹干，用水与甲醇体积比为95:5的溶液复溶，制成所述待测样品。
称取展青霉素标准品，溶于乙腈，定容，制成具有已知浓度的标准储备液；量取不同体积的标准储备液，并分别向其中加入等体积的所述展青霉素同位素内标，用水与甲醇体积比为95:5的溶液定容，制成含有所述展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液。
对所述待测样品以及不同浓度的所述展青霉素标准工作液进行UPLC-ID-MS/MS检测，其中，液相色谱分离仪器采用的是Waters公司的ACQUITY UPLC，色谱柱为BEH C18(1.7μm粒径；1mm×50mm)，色谱柱的温度为30-40℃。样品室温度为4-10℃，进样量为3-5μL；流动相中A相为去离子水，B相为乙腈，体积比为A相:B相＝95:5的等度洗脱，流速为0.2-0.4mL/min；质谱检测条件为：三重四极杆质谱仪器为Waters TQS，电喷雾离子源负离子模式(ESI-)参数如下：毛细管电压-2.5±0.25KV，锥孔电压为10±1V，源偏移电压30±3V，源温度150±15℃；脱溶剂温度400±40℃，锥孔气流150±15L/h，解吸附气流800±80L/h，碰撞气流速为0.05±0.005mL/min，碰撞能量为8±0.8；对于展青霉素，m/z 153>m/z 109通道为定量离子对，m/z 153>m/z 81选为定性离子对。对于展青霉素同位素内标，m/z 160>m/z115为定量离子对，m/z 160>m/z 86为定性离子对，得到所述待测样品以及不同浓度的所述展青霉素标准工作液对应的色谱图和质谱图。
根据不同浓度的所述展青霉素标准工作液对应的色谱图和质谱图中通过保留时间、特征峰的对比，并通过与质谱数据库对比，准确定性展青霉素；积分标准工作溶液中展青霉素及同位素内标的色谱图，得到校准方程y＝aX+c，y代表展青霉素与同位素内标的峰面积比，X代表展青霉素与同位素内标的浓度比。
根据所述标准曲线以及所述待测样品对应的质谱图中的展青霉素的峰面积，计算所述待测样品中展青霉素的含量，从而得到所述待测苹果汁中展青霉素的含量。
实施例2
本实施例提供一种检测苹果汁中展青霉素的方法。该方法包括以下步骤：
1、苹果汁样品和标准样品准备：
用移液器取苹果汁2mL，加入浓度为1μg/mL的同位素内标100μL，涡旋混合5min，然后在6000r/min转速下离心5-10min，分离固体成分，得到含内标的澄清苹果汁。
标准样品准备：准确称取100mg展青霉素标准品，用乙腈配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液。并由标准储备溶液配制一系列不同浓度的标准校准溶液。加入浓度为1μg/mL的同位素内标，使同位素内标浓度均为50ng/mL。
2、苹果汁样品的前处理：
首先，HyperSep Retain AX固相萃取柱先后加入3mL甲醇和3mL水进行活化，再加入2mL含内标的澄清苹果汁，在重力作用下自然流出，之后依次用3mL 0.1％体积分数的乙酸水溶液和纯水淋洗固相萃取柱，然后用真空泵将固相萃取柱抽干，最后用1mL甲醇洗脱展青霉素，收集洗脱液氮气吹干后，用5％乙腈水溶液复溶，制成待测样品，用于后期的液质联用分析。
3、UPLC-ID-MS/MS检测：
色谱的检测条件：色谱柱为BEH C18(1.7μm粒径；1mm×50mm)，温度为30℃。流动相A为去离子水，B为乙腈，体积比为A:B＝95:5的等度洗脱，流速为0.3mL/min。样品室温度为10℃，进样量为3μL。如图1所示，样品运行时间为6min，展青霉素保留时间为4.21min。
质谱的检测条件：离子源：电喷雾离子源负离子模式(ESI-)；毛细管电压-2.5KV，锥孔电压10V，源偏移电压30V，源温度150℃，脱溶剂温度400℃，锥孔气流150L/h，解吸附气流800L/h；仪器采用多重反应检测模式，碰撞气流速为0.05mL/min，碰撞能量为8。对于展青霉素，m/z 153>m/z 109通道为定量离子对，m/z 153>m/z 81选为定性离子对。对于展青霉素同位素内标，m/z 160>m/z 115为定量离子对，m/z 160>m/z 86为定性离子对。
将步骤1得到的标准校准溶液和步骤2得到的待测样品分别在上述色谱和质谱的条件下进行检测，分别得到质谱图。请参见图1-4，如图1-4所示，基于图1和图3的保留时间、图2和图4的质谱碎片可以对展青霉素进行定性分析。同时，图3中展青霉素保留时间前后基线平稳，没有干扰峰，说明前处理方法得当，显著地去除了基质干扰成分。
4、将步骤3得到的质谱图通过保留时间、特征峰的对比，并通过与质谱数据库对比，准确定性展青霉素。积分标准工作溶液中展青霉素及同位素内标的色谱图，得到校准方程y＝aX+c，y代表展青霉素与同位素内标的峰面积比，X代表展青霉素与同位素内标的浓度比。通过苹果汁样品的上机测试，得到其中展青霉素与同位素内标的峰面积比，根据校准方程计算出待测样品中展青霉素浓度。
线性范围的确定：使用一定体积的标准储备液，配制与待测样品具有相同基质的一系列浓度的展青霉素样品，使其浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL，其中同位素内标浓度均为50ng/mL。以选定的展青霉素与同位素内标的定量离子峰面积比值与浓度做标准曲线。结果显示，在苹果汁基质中，展青霉素在1-400ng/mL范围内线性方程为y＝172.96X+7.02，线性相关系数(r2)为0.9997，表明线性相关性好。
检出限和定量限的确定：采用空白苹果汁中添加展青霉素的方法制备低浓度样品，进行同样的固相萃取和上机检测。以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定定量限。通过计算，得到展青霉素检出限为0.2ng/mL，定量限为1ng/mL。
5、加标回收率：取三个2mL苹果汁样品，分别加入10μL、20μL、100μL浓度为1μg/mL的展青霉素标准液，通过重量法准确计算制备的三个样品的浓度水平，按照待测样品预处理方法进行处理，上机测定其浓度，计算得到相对加标回收率为97.24％-100.20％，回收率高，回收结果非常好。
基质效应评价：取空白苹果汁样品，按照待测样品预处理方法进行固相萃取，得到的洗脱液吹干后用50ng/mL展青霉素标准工作溶液复溶。上机测试后，计算空白苹果汁复溶液与同浓度标准工作溶液峰面积比，来评价基质效应对结果影响。计算得到基质效应值为101％，表明基质效应微弱，测定结果准确度高。
Figure BDA0002374026980000111
对比例1
对比例1与实施例2的区别仅在于步骤2苹果汁样品的前处理不同。
步骤2具体为：
首先，HyperSep Retain AX固相萃取柱先后加入3mL甲醇和3mL水进行活化，再加入2mL含内标的澄清苹果汁，在重力作用下自然流出，之后依次用1mL 0.1％体积分数的乙酸水溶液和纯水淋洗固相萃取柱，然后用真空泵将固相萃取柱抽干，最后用1mL甲醇洗脱展青霉素，收集洗脱液氮气吹干后，用5％乙腈水溶液复溶，制成待测样品，用于后期的液质联用分析。结果详见图5。由图5可知，该对比例中，展青霉素峰面积略低，同时前有较强的杂质峰，相对于实施例2的结果，淋洗效果差。
对比例2
对比例2与实施例2的区别仅在于步骤3中的色谱的分离条件不同。
具体地：
3、UPLC-ID-MS/MS检测：
色谱的检测条件：色谱柱为BEH C18(1.7μm粒径；1mm×50mm)，温度为30℃。流动相A为去离子水，B为乙腈，体积比为A:B＝80:20的等度洗脱，流速为0.3mL/min。样品室温度为10℃，进样量为3μL。结果详见图6，相对于实施例2的色谱检测条件，对比例2中使用高比例乙腈，导致展青霉素出峰时间提前，无法与杂质分离，同时背景基线较高，影响展青霉素检测的灵敏度。
对比例3
对比例3与实施例2的区别仅在于步骤3中的质谱的检测条件不同。
具体地：
质谱的检测条件：离子源：电喷雾离子源负离子模式(ESI-)；毛细管电压-1.5KV，锥孔电压10V，源偏移电压30V，源温度150℃，脱溶剂温度400℃，锥孔气流150L/h，解吸附气流800L/h；仪器采用多重反应检测模式，碰撞气流速为0.05mL/min，碰撞能量为8。仪器采用多重反应检测模式，碰撞气流速为0.05mL/min，碰撞能量为8；对于展青霉素，m/z 153>m/z109通道为定量离子对，m/z 153>m/z 81通道为定性离子对。对于展青霉素同位素内标，m/z160>m/z 115为定量离子对，m/z 160>m/z 86为定性离子对。由图7可知，对比例3中使用较低的毛细管电压，导致展青霉素色谱图中信号响应降低，方法的灵敏度也随之降低。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (9)

1.一种检测苹果汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
将待测苹果汁与展青霉素同位素内标混匀，之后进行固液分离，得到含内标的澄清苹果汁；
利用季胺类高分子固相萃取柱对所述含内标的澄清苹果汁进行前处理，得到待测样品；
配制含有所述展青霉素同位素内标的不同浓度的展青霉素标准工作液；
对所述待测样品以及不同浓度的所述展青霉素标准工作液进行UPLC-ID-MS/MS检测，其中，液相色谱的检测条件包括：色谱柱的种类为C18，流动相中A相为水，B相为乙腈，流速为0.2-0.4mL/min；质谱采用电喷雾离子源负离子模式，所述质谱的检测条件包括：毛细管电压-2.5±0.25KV，锥孔电压为10±1V，源偏移电压30±3V，源温度150±15℃；脱溶剂温度400±40℃，锥孔气流150±15L/h，解吸附气流800±80L/h，碰撞气流速为0.05±0.005mL/min，碰撞能量为8±0.8，得到所述待测样品以及不同浓度的所述展青霉素标准工作液对应的质谱图；
根据不同浓度的所述展青霉素标准工作液对应的质谱图峰面积制作标准曲线；
根据所述标准曲线以及所述待测样品对应的质谱图峰面积，计算所述待测样品中展青霉素的含量，从而得到所述待测苹果汁中展青霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用季胺类高分子固相萃取柱对所述含内标的澄清苹果汁进行前处理，得到待测样品包括以下步骤：
对所述季胺类高分子固相萃取柱进行活化；
将所述含内标的澄清苹果汁加入到活化后的所述季胺类高分子固相萃取柱中，依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液；
利用氮气将所述洗脱液进行吹干，之后复溶，得到所述待测样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述季胺类高分子固相萃取柱包括HyperSep Retain AX固相萃取柱、Cleanert PAX Bond固相萃取柱、Elut Plexa PAX固相萃取柱或Oasis MAX固相萃取柱。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活化所使用的活化剂为甲醇和水；所述淋洗所使用的淋洗剂为0.1％体积分数的乙酸溶液和水；所述洗脱所使用的洗脱剂为甲醇；所述复溶所使用的溶剂为所述流动相。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为BEH C18；液相色谱的检测条件还包括：所述A相与所述B相的体积比为95:5的等度洗脱；所述色谱柱的温度为30-40℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超高效液相色谱仪的样品室温度为4-10℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱仪为三重四极杆质谱仪；所述三重四极杆质谱仪的m/z 153>m/z 109通道为检测展青霉素的定量离子对，m/z 153>m/z 81为检测展青霉素的定性离子对；m/z 160>m/z 115为检测所述展青霉素同位素内标的定量离子对，而m/z 160>m/z 86为检测所述展青霉素同位素内标的定性离子对。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性范围为1-400ng/mL，检出限为0.2ng/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述展青霉素同位素内标为13C-展青霉素或氘代展青霉素。
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